專利名稱：生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記l型亮氨酸的發(fā)酵工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于穩(wěn)定性同位素標記化合物生產領域；涉及到微生物發(fā)酵生產工藝，尤其是涉及一種生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝。
背景技術：
L-亮氨酸-U-13C6的生產可采用有機合成法、前體發(fā)酵法、酶法及提取法、直接發(fā)酵法等。采用合成法工藝繁瑣，且合成得到的是消旋的DL型亮氨酸-U-13C6,需要光學拆分才能得到目標物L-亮氨酸-U-13C6,使13C原料利用率大大降低，成本上升。水解法常用于制備復合氨基酸，要分開所有氨基酸很困難。酶法生產L-亮氨酸-U-13C6需要α-氧代己酸、 甲酸銨-1 作為原料，最終產量不是很高，且原料甲酸銨-1 價格昂貴，不易得。而采用普通直接發(fā)酵法生產，目標氨基酸大量富集，分離相對簡單，但由于種子、發(fā)酵配方中添加多種有機碳源，且這些有機碳源一般多為混合物，很難標記，常常使得到的L-亮氨酸-13C產品的豐度下降很多，達不到產品要求，而如果不添加這些物質，菌種的產酸水平又會大大降低，使生產成本急劇上升，如果采用常規(guī)發(fā)酵方法穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸產量雖然相對較高，但1 豐度下降很大，往往下降3%以上，很難達到高豐度產品要求。且由于要添加大量1Y葡萄糖，成本很高。采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵雖然對"C豐度影響不大，但產酸量太低使得"C原料利用率不高。因此，篩選適用于L-亮氨酸-U-13C6生產的工藝條件是該技術的關鍵。目前， 在碳13標記領域中還未見相關產品的生產方法專利和文獻報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種可使"C原料得到有效利用，又可使豐度下降很少，以致在不影響豐度的情況下實現高產的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，采用搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L型亮氨酸。所述的菌體適用于L型亮氨酸生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌或谷氨酸棒桿菌。所述的搖瓶發(fā)酵包括以下步驟將菌體接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-30小時，待長成菌落后，將菌落接種于事先滅菌完的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接一環(huán)菌體，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為一個500ml三角瓶裝20-60ml發(fā)酵培養(yǎng)基，將接種完的發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖擺式搖床上，控制發(fā)酵溫度25-35°C，搖床轉速180-240轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72-96小時。所述的發(fā)酵罐發(fā)酵包括以下步驟
(1)將菌體接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-30小時，待長成菌落后將菌落接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在下搖床培養(yǎng)IO-M 小時，獲得種子液；(2)發(fā)酵初始溫度25-35 °C，初始pH6. 8-7. 2，采用大接種量(2-lOwt % )、低糖流加、強制控制發(fā)酵工藝，將種子液按2-10% (體積比)接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制溫度25-37 °C，通氣量0. 5-1. 5VVM，罐壓0. 01-0. 05MPa,溶解氧5-30% (體積比)，pH為6. 5-7. 5，并以消泡劑消泡，發(fā)酵全過程用添加液氨控制pH 在7. 0-7. 5，并且流加50wt%的"C葡萄糖，控制發(fā)酵液"C葡萄糖濃度3-6wt%，發(fā)酵時間 32-70小時。所述的活化培養(yǎng)基平板采用斜面活化培養(yǎng)基，該斜面活化培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖l_5g/l、蛋白胨5-15g/l、牛肉膏3-15g/l、氯化鈉l_10g/l、瓊脂15_30g/l，用 2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 6. 5-8. 0，在110_130°C高壓滅菌鍋中滅菌10-20分鐘。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以13C葡萄糖為碳源，初始配方中13C葡萄糖濃度為； 以氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨或尿素中的一種或幾種為初始氮源，濃度為2-5wt%，發(fā)酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節(jié)PH來補充氮源，添加高豐度菌體水解液作為有機碳源和氮源，添加量為0. 2-2wt%。不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨有機碳源，單獨添加一種即可，添加量在0. 2wt%以下，根據不同菌種添加磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽和亞鐵鹽，添加純生物素 10-50ug/L，VBl 200-2000ug/L, VB6 100-1000ug/L，泛酸 100_500ug/L，尼克酸 100-600ug/L。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括1 葡萄糖80-120g/l、(NH4)2SO4 :20-40g/l、 MgSO4 · 7H20 :4-8mg/L、MnSO4 · H2O :2_6mg/L、FeSO4 · 7H20 :2_6mg/L、KH2PO4 :lg/l、純生物素30ug/L、VBl :400ug/L、VB6 :10ug/L、泛酸50_300ug/l、尼克酸50_300ug/l、玉米漿 0. 1-3. 0g/l,13C高豐度菌體水解液0. 5-5g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 6. 5-8. 0，在 110-130°C高壓滅菌鍋中滅菌10-20分鐘。所述的種子培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖20-50g/l、尿素0.5_3g/l、硫酸銨 2-8g/l、KH2PO4 :0. 1-lg/l、玉米漿5_50g/l、MgSO4 · 7H20 :l_10mg/L，用 2mol/l 氫氧化鈉調節(jié)pH = 6. 5-8. 0，在110-130°C高壓滅菌鍋中滅菌10-20分鐘。所述的高豐度菌體水解液采用以下工藝獲得離心收集高豐度"C穩(wěn)定性同位素發(fā)酵液所產生的菌泥，將菌泥收集放入三口燒瓶中，加入5mol/l的硫酸進行消煮，消煮15 小時后，冷卻后，加入2mol/l氫氧化鈉，調節(jié)pH值至中性，離心，收集清液，即為高豐度菌體水解液。所述的分離提取采用等電點沉淀或離子交換法等分步提取得到"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸溶液，然后通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。與現有技術相比，本發(fā)明通過改變發(fā)酵配方和控制工藝，本發(fā)明獲得的"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸產酸量比采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產酸量相應提高50%以上，且1V豐度下降可以減少到0. 5%以下，有的甚至幾乎不下降，大大提高了 13C葡萄糖利用率，減少了生產成本，同時，在保證產品1V豐度條件下，采用一次接種的方法，簡化了發(fā)酵和提取工藝，由于原料得到充分利用，大大節(jié)省了原料，降低了成本，本發(fā)明可利用低豐度和高豐度 13C葡萄糖滿足不同豐度產品要求。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1使用菌種為以黃色短桿菌ATCC39106為出發(fā)菌，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下所示斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂20g/l ；斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂:20g/l ；發(fā)酵培養(yǎng)基=13C葡萄糖100g/l、(NH4)2SO4 :20g/l、MgS04. 7H20 :6mg/L、MnS04 .H2O 4mg/L,FeSO4 ·7Η20 :4mg/L,KH2PO4 :lg/l、VH :10ug/L、VBl :400ug/L、泛酸100ug/l、尼克酸 100ug/l、玉米槳0. 5g/l,13C高豐度菌體水解液2g/l ；用500ml三角瓶以20ml的載液量分裝發(fā)酵培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 7. 0，在115°C高壓滅菌鍋中滅菌15分鐘，待用。取黃色短桿菌ATCC39106 —環(huán)菌體接入斜面活化培養(yǎng)基，放入生化培養(yǎng)箱，30°C 下培養(yǎng)觀小時，在無菌操作臺上將斜面活化培養(yǎng)基上的菌體接入事先配好的300ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶接一環(huán)菌體，接種完用九層紗布封口，置于旋轉式搖床上，在30°C、160rmp下發(fā)酵42小時后將搖床轉速提高至220rmp再發(fā)酵42小時。產L-亮氨酸-U-13C6達18g/l。將上述發(fā)酵液離心分離(4000rpm，10分鐘)，所得到的上清液用鹽酸調節(jié)pH = 2， 上陽離子交換樹脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脫，將得到的L-亮氨酸-U-13C6單斑洗脫液濃縮，活性炭脫色，再結晶并過濾得到的晶體真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固體 4. 22克。經質譜分析得到產品豐度10. 19%，豐度下降小于0. 5%，豐度幾乎不下降，純度大于99 %，可以滿足對高豐度產品的要求。實施例2使用菌種為以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發(fā)菌，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下所示斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂20g/l ；斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂:20g/l ；發(fā)酵培養(yǎng)基=13C葡萄糖100g/l、(NH4)2SO4 :35g/l、MgSO4. 7H20 :6mg/L、MnSO4. H2O 2mg/L, FeSO4. 7H20 :2mg/L, KH2PO4 :lg/l、VH :25ug/L、VB6 :100ug/L、泛酸300ug/l、尼克酸 400ug/l、蛋白胨lg/l、"C高豐度菌體水解液2g/l ；用500ml三角瓶以20ml的載液量分裝發(fā)酵培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 7. 0，在115°C高壓滅菌鍋中滅菌15分鐘，待用。取谷氨酸棒桿菌ATCC13032 —環(huán)菌體接入斜面活化培養(yǎng)基，放入生化培養(yǎng)箱， 30°C下培養(yǎng)M小時，在無菌操作臺上將斜面活化培養(yǎng)基上的菌體接入事先配好的400ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶接一環(huán)菌體，接種完用九層紗布封口，置于旋轉式搖床上，在30°C、220rmp下發(fā)酵80小時。產L-亮氨酸-U-13C6達2(^/1。將上述發(fā)酵液離心分離(4000rpm，10分鐘)，所得到的上清液用鹽酸調節(jié)pH = 2， 上陽離子交換樹脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脫，將得到的L-亮氨酸-U-13C6單斑洗脫液濃縮，活性炭脫色，再結晶并過濾得到的晶體真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固體 5. 52克。經質譜分析得到產品豐度99. 16%,豐度下降小于0. 5%，豐度幾乎不下降，純度大于99 %，可以滿足對高豐度產品的要求。實施例3使用菌種為以黃色短桿菌ATCC39103為出發(fā)菌，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下所示斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂20g/l ；斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂:20g/l ；種子培養(yǎng)基葡萄糖30g/l、尿素lg/l、硫酸銨5g/l、KH2PO4 :0. 5g/l、玉米槳 20g/l、MgSO4. 7H20 :5mg/L發(fā)酵培養(yǎng)基=13C葡萄糖110g/l、(NH4)2SO :40g/l、MgSO4. 7H20 :6mg/L、MnSO4. H2O 2mg/L、FeSO4. 7H20 :2mg/L, KH2PO4 :lg/l、VH :50ug/L、VBl :2000ug/L、泛酸200ug/l、尼克酸500ug/l、玉米漿lg/l、"C高豐度菌體水解液15g/l。以上培養(yǎng)基均用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 7. 0，在115°C高壓滅菌鍋中滅菌15 分鐘，待用。將菌體接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30小時，待菌落長成后，將長好的菌苔接種于已滅菌的各裝有50ml種子培養(yǎng)基的2個500ml搖瓶中，在下搖床培養(yǎng)10小時，獲得種子液。將種子按2% (體積比)接種于已滅菌的裝有5000ml發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制條件溫度，通氣量1. 5VVM，罐壓0. 02MP,溶解氧60%，以30% (體積比) ΝΗΛ0調節(jié)PH = 7. 2，并以消泡劑消泡。發(fā)酵全過程控制pH在微堿性(pH控制在7. 0-7.5， 用添加液氨控制)，流加50% 13C葡萄糖控制發(fā)酵液1V葡萄糖濃度5%，發(fā)酵時間70小時。 產L-亮氨酸-U-13C6達198/1。將上述發(fā)酵液離心分離(4000rpm，10分鐘)，所得到的上清液用鹽酸調節(jié)pH = 2， 上陽離子交換樹脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脫，將得到的L-亮氨酸-U-13C6單斑洗脫液濃縮，活性炭脫色，再結晶并過濾得到的晶體真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固體 30. 18克。經質譜分析得到產品豐度99. 66%，豐度下降小于0. 5%，豐度幾乎不下降，純度大于99 %，可以滿足對高豐度產品的要求。實施例4使用菌種為以大腸桿菌ATCC21530為出發(fā)菌，使用的培養(yǎng)基包括斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基。斜面保藏培養(yǎng)基和斜面活化培養(yǎng)基同常規(guī)發(fā)酵采用相同。使用的斜面保藏培養(yǎng)基、斜面活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下所示
斜面保藏培養(yǎng)基蛋白胨10g/l、牛肉膏3g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂20g/l ；斜面活化培養(yǎng)基葡萄糖3g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂:20g/l ；種子培養(yǎng)基葡萄糖30g/l、尿素lg/l、硫酸銨5g/l、KH2PO4 :0. 5g/l、玉米槳 20g/l、MgSO4. 7H20 :5mg/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基=13C葡萄糖90g/l、(NH4)2SO4 :50g/l、MgSO4. 7H20 :5mg/L、MnSO4. H2O 2mg/L, FeSO4. 7H20 :2mg/LKH2P04 :lg/l、H :20ug/L、VBl :200ug/L、泛酸200ug/l、尼克酸 300ug/l玉米漿dg/l^C高豐度菌體水解液20g/l。以上培養(yǎng)基均用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 7.0，在115°C高壓滅菌鍋中滅菌15 分鐘，待用。將菌體接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，待菌落長成后，將長好的菌苔接種于已滅菌的各裝有50ml種子培養(yǎng)基的3個500ml搖瓶中，在下搖床培養(yǎng)30小時，獲得種子液。將種子按5% (體積比)接種于已滅菌的裝有3000ml發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制條件溫度32°C，通氣量0. 5VVM，罐壓0. 05MP,溶解氧80 %，以30 % (體積比) ΝΗΛ0調節(jié)PH = 7. 2，并以消泡劑消泡。發(fā)酵全過程控制pH在微堿性(pH控制在7. 0-7.5， 用添加液氨控制)，流加50% 13C葡萄糖控制發(fā)酵液1V葡萄糖濃度3%，發(fā)酵時間55小時。 產L-亮氨酸-U-13C6達198/1。將上述發(fā)酵液離心分離(4000rpm，10分鐘)，所得到的上清液用鹽酸調節(jié)pH = 2， 上陽離子交換樹脂(H+型)吸附，水洗后用0. IN氨水洗脫，將得到的L-亮氨酸-U-13C6單斑洗脫液濃縮，活性炭脫色，再結晶并過濾得到的晶體真空干燥得到L-亮氨酸-U-13C6固體 22. 32克。經質譜分析得到產品豐度99. 06%，豐度下降小于0. 5%，豐度幾乎不下降，純度大于99 %，可以滿足對高豐度產品的要求。實施例5生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，采用搖瓶發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L型亮氨酸。采用的菌體適用于L型亮氨酸生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌或谷氨酸棒桿菌，本實施例采用黃色短桿菌。搖瓶發(fā)酵具體包括以下步驟將黃色短桿菌接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，待長成菌落后，將菌落接種于事先滅菌完的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接一環(huán)菌體，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為一個500ml三角瓶裝20ml發(fā)酵培養(yǎng)基，將接種完的發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖擺式搖床上，控制發(fā)酵溫度25°C，搖床轉速180轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72小時。其中，活化培養(yǎng)基平板采用斜面活化培養(yǎng)基，該斜面活化培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖lg/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、氯化鈉lg/l、瓊脂15g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié) PH = 6. 5，在110°C高壓滅菌鍋中滅菌10分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基以1V葡萄糖為碳源，初始配方中"C葡萄糖濃度為6wt%;以氯化銨為初始氮源，濃度為2wt%，發(fā)酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節(jié)pH來補充氮源，添加高豐度菌體水解液作為有機碳源和氮源，添加量為0. 2wt%。不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨等有機碳源，單獨添加一種即可，添加量在0. 2wt%以下，根據不同菌種添加磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽和亞鐵鹽，添加純生物素10ug/L，VBl 200ug/L, VB6 100ug/L，泛酸100ug/L， 尼克酸100ug/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括13C葡萄糖80g/l、(NH4)2SO4 :20g/l、MgS04 ·7Η20 4mg/L,MnSO4 .H2O :2mg/L,FeSO4 · 7H20 :2mg/L,KH2PO4 :lg/l、純生物素:30ug/L、VBl :400ug/ L、VB6 :10ug/L、泛酸:50ug/l、尼克酸:50ug/l、玉米漿0. lg/l、13C高豐度菌體水解液 0. 5g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)PH = 6. 5，在110°C高壓滅菌鍋中滅菌10分鐘。高豐度菌體水解液采用以下工藝獲得離心收集高豐度"C穩(wěn)定性同位素發(fā)酵液所產生的菌泥，將菌泥收集放入三口燒瓶中，加入5mol/l的硫酸進行消煮，消煮15小時后， 冷卻后，加入2mol/l氫氧化鈉，調節(jié)pH值至中性。離心，收集清液，即為高豐度菌體水解液。 分離提取采用等電點沉淀或離子交換法等分步提取得到"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸溶液，然后通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。實施例6生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，采用搖瓶發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L型亮氨酸。采用的菌體適用于L型亮氨酸生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌或谷氨酸棒桿菌，本實施例采用鈍齒棒桿菌。搖瓶發(fā)酵包括以下步驟將鈍齒棒桿菌接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30小時，待長成菌落后，將菌落接種于事先滅菌完的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接一環(huán)菌體，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為一個500ml三角瓶裝60ml發(fā)酵培養(yǎng)基，將接種完的發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖擺式搖床上，控制發(fā)酵溫度35°C，搖床轉速240轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵96小時?；罨囵B(yǎng)基平板采用斜面活化培養(yǎng)基，該斜面活化培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖 5g/l、蛋白胨15g/l、牛肉膏15g/l、氯化鈉10g/l、瓊脂:30g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié) PH = 8.0，在130°C高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基以1V葡萄糖為碳源，初始配方中"C葡萄糖濃度為以硫酸銨和醋酸銨為初始氮源，濃度為5wt%，發(fā)酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節(jié)pH來補充氮源， 添加高豐度菌體水解液作為有機碳源和氮源，添加量為2wt%。不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨等有機碳源，單獨添加一種即可，添加量在0. 2wt%以下，根據不同菌種添加磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽和亞鐵鹽，添加純生物素50ug/L，VBl 2000ug/L, VB6 1000ug/L，泛酸 500ug/L，尼克酸 600ug/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括13C葡萄糖120g/l、(NH4)2SO4 :40g/l、MgSO4 · 7H20 :8mg/ L、MnSO4 · H2O :6mg/L、FeSO4 · 7H20 :6mg/L、KH2PO4 :lg/l、純生物素30ug/L、VBl :400ug/L、 VB6 :10ug/L、泛酸50-300ug/l、尼克酸300ug/l、玉米漿3. 0g/l,13C高豐度菌體水解液 5g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 8. 0，在130°C高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘。高豐度菌體水解液采用以下工藝獲得離心收集高豐度"C穩(wěn)定性同位素發(fā)酵液所產生的菌泥，將菌泥收集放入三口燒瓶中，加入5mol/l的硫酸進行消煮，消煮15小時后， 冷卻后，加入2mol/l氫氧化鈉，調節(jié)PH值至中性。離心，收集清液，即為高豐度菌體水解液。所述的分離提取采用等電點沉淀或離子交換法等分步提取得到"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸溶液，然后通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。
實施例7生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，采用發(fā)酵罐發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L型亮氨酸。采用的菌體適用于L型亮氨酸生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌或谷氨酸棒桿菌，本實施例采用大腸桿菌。發(fā)酵罐發(fā)酵包括以下步驟(1)將大腸桿菌接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時，待長成菌落后將菌落接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在下搖床培養(yǎng)10小時， 獲得種子液；(2)發(fā)酵初始溫度251，初始？!1為6.8，采用大接種量Qwt%)、低糖流加、強制控制發(fā)酵工藝，將種子液按2% (體積比)接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制溫度25°C，通氣量0. 5VVM，罐壓0. OlMPa,溶解氧5% (體積比)，pH為6. 5，并以消泡劑消泡，發(fā)酵全過程用添加液氨控制PH在7. 0，并且流加50wt %的1V葡萄糖，控制發(fā)酵液13C葡萄糖濃度3wt%，發(fā)酵時間32小時。其中，活化培養(yǎng)基平板采用斜面活化培養(yǎng)基，該斜面活化培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖lg/l、蛋白胨5g/l、牛肉膏3g/l、氯化鈉lg/l、瓊脂15g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié) pH = 6. 5，在110°C高壓滅菌鍋中滅菌10分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基以"C葡萄糖為碳源，初始配方中1Y葡萄糖濃度為6wt% ；以硝酸銨和尿素為初始氮源，濃度為2wt%，發(fā)酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節(jié)pH來補充氮源， 添加高豐度菌體水解液作為有機碳源和氮源，添加量為0. 2wt%。不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨等有機碳源，單獨添加一種即可，添加量在0. 2wt%以下，根據不同菌種添加磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽和亞鐵鹽，添加純生物素10ug/L，VBl 200ug/L, VB6 100ug/L，泛酸100ug/L，尼克酸100ug/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括1 葡萄糖80g/l、(NH4)2SO4 :20g/l、 MgSO4 · 7H20 :4mg/L,MnSO4 · H2O :2mg/L、FeS04 · 7H20 :2mg/L,KH2PO4 :lg/l、純生物素30ug/ L、VB1 :400ug/L、VB6 :10ug/L、泛酸:50ug/l、尼克酸:50ug/l、玉米漿:0. lg/l、13C 高豐度菌體水解液0. 5g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 6. 5，在110°C高壓滅菌鍋中滅菌10分鐘。種子培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖20g/l、尿素0. 5g/l、硫酸銨2g/l、KH2PO4 0. lg/Ι、玉米漿5g/l、MgSO4 · 7H20 :lmg/L，用 2mol/l 氫氧化鈉調節(jié) pH = 6. 5，在 110°C高壓滅菌鍋中滅菌10分鐘。高豐度菌體水解液采用以下工藝獲得離心收集高豐度"C穩(wěn)定性同位素發(fā)酵液所產生的菌泥，將菌泥收集放入三口燒瓶中，加入5mol/l的硫酸進行消煮，消煮15小時后， 冷卻后，加入2mol/l氫氧化鈉，調節(jié)PH值至中性。離心，收集清液，即為高豐度菌體水解液。 分離提取采用等電點沉淀或離子交換法等分步提取得到"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸溶液，然后通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。實施例8生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，采用發(fā)酵罐發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L型亮氨酸。采用的菌體適用于L型亮氨酸生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌或谷氨酸棒桿菌，本實施例采用谷氨酸棒桿菌。
發(fā)酵罐發(fā)酵包括以下步驟所述的發(fā)酵罐發(fā)酵包括以下步驟(1)將谷氨酸棒桿菌接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30小時，待長成菌落后將菌落接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在30°C下搖床培養(yǎng)M 小時，獲得種子液；(2)發(fā)酵初始溫度35°C，初始pH7.2，采用大接種量(IOwt %)、低糖流加、強制控制發(fā)酵工藝，將種子液按10% (體積比)接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制溫度37°C，通氣量1.5界11，罐壓0.0510^，溶解氧30% (體積比)，pH為7. 5，并以消泡劑消泡，發(fā)酵全過程用添加液氨控制PH在7. 5，并且流加50wt%的"C葡萄糖，控制發(fā)酵液"C葡萄糖濃度6wt%，發(fā)酵時間70小時。活化培養(yǎng)基平板采用斜面活化培養(yǎng)基，該斜面活化培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖 5g/l、蛋白胨15g/l、牛肉膏15g/l、氯化鈉10g/l、瓊脂:30g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié) PH = 8.0，在130°C高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基以1V葡萄糖為碳源，初始配方中"C葡萄糖濃度為以醋酸銨、 硫酸銨和尿素為初始氮源，濃度為5wt%，發(fā)酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節(jié)pH來補充氮源，添加高豐度菌體水解液作為有機碳源和氮源，添加量為2wt%。不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨等有機碳源，單獨添加一種即可，添加量在0. 2wt%以下，根據不同菌種添加磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽和亞鐵鹽，添加純生物素50ug/L，VBl 2000ug/L, VB6 IOOOug/ L，泛酸 500ug/L，尼克酸 600ug/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括13C葡萄糖120g/l、(NH4)2SO4 :40g/l、MgSO4 · 7H20 :8mg/ L、MnSO4 · H2O :6mg/L、FeSO4 · 7H20 :6mg/L、KH2PO4 :lg/l、純生物素30ug/L、VBl :400ug/L、 VB6 :10ug/L、泛酸50-300ug/l、尼克酸300ug/l、玉米漿3. 0g/l,13C高豐度菌體水解液 5g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)PH = 8. 0，在130°C高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘。種子培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖50g/l、尿素3g/l、硫酸銨8g/l、KH2PO4 :lg/l、 玉米漿50g/l、MgSO4 ·7Η20 :10mg/L，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 8. 0，在130°C高壓滅菌鍋中滅菌20分鐘。高豐度菌體水解液采用以下工藝獲得離心收集高豐度"C穩(wěn)定性同位素發(fā)酵液所產生的菌泥，將菌泥收集放入三口燒瓶中，加入5mol/l的硫酸進行消煮，消煮15小時后， 冷卻后，加入2mol/l氫氧化鈉，調節(jié)PH值至中性。離心，收集清液，即為高豐度菌體水解液。 分離提取采用等電點沉淀或離子交換法等分步提取得到"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸溶液，然后通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。
權利要求
1.生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，該發(fā)酵工藝采用搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L 型亮氨酸。
2.根據權利要求1所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的菌體適用于L型亮氨酸生產的棒桿菌、短桿菌屬，并能采用強制控制工藝控制其細胞膜通透性，包括黃色短桿菌、鈍齒棒桿菌、大腸桿菌、粘質賽氏桿菌或谷氨酸棒桿菌。
3.根據權利要求1所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的搖瓶發(fā)酵包括以下步驟將菌體接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-30小時，待長成菌落后，將菌落接種于事先滅菌完的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接一環(huán)菌體，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為一個500ml三角瓶裝20-60ml發(fā)酵培養(yǎng)基，將接種完的發(fā)酵培養(yǎng)基置于搖擺式搖床上，控制發(fā)酵溫度25-35°C，搖床轉速180-240轉/分鐘，連續(xù)發(fā)酵72-96小時。
4.根據權利要求1所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵罐發(fā)酵包括以下步驟(1)將菌體接種于活化培養(yǎng)基平板上，30°C下生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-30小時，待長成菌落后將菌落接種于已滅菌的裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在下搖床培養(yǎng)IO-M小時， 獲得種子液；(2)發(fā)酵初始溫度25-35°C，初始pH6.8-7.2，采用大接種量(2-lOwt% )、低糖流加、 強制控制發(fā)酵工藝，將種子液按2-10% (體積比)接種于已滅菌的裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中開始發(fā)酵，控制溫度25-37°C，通氣量0. 5-1. 5VVM，罐壓0. 01-0. 05MPa，溶解氧5-30% (體積比)，PH為6. 5-7. 5，并以消泡劑消泡，發(fā)酵全過程用添加液氨控制pH在7. 0-7. 5，并且流加50wt%的1V葡萄糖，控制發(fā)酵液"C葡萄糖濃度3-6wt%，發(fā)酵時間32-70小時。
5.根據權利要求3或4所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝， 其特征在于，所述的活化培養(yǎng)基平板采用斜面活化培養(yǎng)基，該斜面活化培養(yǎng)基的配方包括 葡萄糖l_5g/l、蛋白胨5-15g/l、牛肉膏3-15g/l、氯化鈉l_10g/l、瓊脂15_30g/l，用 2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 6. 5-8. 0，在110_130°C高壓滅菌鍋中滅菌10-20分鐘。
6.根據權利要求3或4所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基以13C葡萄糖為碳源，初始配方中13C葡萄糖濃度為；以氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨或尿素中的一種或幾種為初始氮源，濃度為2-5wt %，發(fā)酵中后期添加尿素、氨水或液氨調節(jié)pH來補充氮源，添加高豐度菌體水解液作為有機碳源和氮源，添加量為0.2-2wt%。不添加或添加極微量玉米漿、酵母膏、蛋白胨有機碳源，單獨添加一種即可，添加量在0. 2wt%以下，根據不同菌種添加磷酸鹽、鎂鹽、錳鹽和亞鐵鹽，添加純生物素10-50ug/L，VBl 200-2000ug/L, VB6 100-1000ug/L，泛酸 100-500ug/L，尼克酸 100-600ug/L。
7.根據權利要求3或4所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方包括1 葡萄糖80-120g/l、(NH4)2SO4 :20_40g/ UMgSO4 · 7H20 :4-8mg/L、MnSO4 · H2O :2_6mg/L、FeSO4 · 7H20 :2-6mg/L, KH2PO4 :lg/l、純生物素30ug/L、VBl :400ug/L、VB6 :10ug/L、泛酸50_300ug/l、尼克酸50_300ug/l、玉米漿0·.1-3. 0g/l,13C高豐度菌體水解液0. 5-5g/l，用2mol/l氫氧化鈉調節(jié)pH = 6. 5-8. 0，在 110-130°C高壓滅菌鍋中滅菌10-20分鐘。
8.根據權利要求4所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基的配方包括葡萄糖20-50g/l、尿素0. 5-3g/l、硫酸銨2-8g/1·、KH2PO4:0. 1-lg/l、玉米漿5-50g/l、MgSO4 · 7H20 :l_10mg/L，用 2mol/l 氫氧化鈉調節(jié) pH =6. 5-8. 0，在110-130°C高壓滅菌鍋中滅菌10-20分鐘。
9.根據權利要求6所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的高豐度菌體水解液采用以下工藝獲得離心收集高豐度"C穩(wěn)定性同位素發(fā)酵液所產生的菌泥，將菌泥收集放入三口燒瓶中，加入5mol/l的硫酸進行消煮，消煮15小時后，冷卻后，加入2mol/l氫氧化鈉，調節(jié)pH值至中性，離心，收集清液，即為高豐度菌體水解液。
10.根據權利要求1所述的生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，其特征在于，所述的分離提取采用等電點沉淀或離子交換法等分步提取得到"C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸溶液，然后通過真空濃縮趕氨并采用乙醇低溫結晶、真空干燥得到產品。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產穩(wěn)定性同位素碳13全標記L型亮氨酸的發(fā)酵工藝，該發(fā)酵工藝采用搖瓶發(fā)酵或發(fā)酵罐發(fā)酵對菌體進行發(fā)酵培養(yǎng)后，再經分離提取得到同位素碳13全標記L型亮氨酸，其中，產品需求量大時采用發(fā)酵罐發(fā)酵，反之，采用搖瓶發(fā)酵。與現有技術相比，本發(fā)明獲得的13C穩(wěn)定性同位素標記L-亮氨酸產酸量比采用全合成培養(yǎng)基發(fā)酵產酸量相應提高50％以上，且13C豐度下降可以減少到0.5％以下，減少了生產成本，簡化了發(fā)酵和提取工藝，由于原料得到充分利用，可利用低豐度和高豐度13C葡萄糖滿足不同豐度產品要求。
文檔編號C12R1/15GK102352390SQ201110298559
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權日2011年9月28日
發(fā)明者宋明鳴, 張亮, 李良君, 杜曉寧 申請人:上?；ぱ芯吭?br>