專利名稱：細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 微生物領(lǐng)域，特別涉及細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌纖維素是除植物纖維素之外的另一類纖維素，為細(xì)菌合成的天然惰性材料， 細(xì)菌纖維素(bacterial cellulose，BC)具有優(yōu)異的生物親和性、生物相容性、生物適應(yīng)性和良好的生物可降解性，是世界上公認(rèn)的性能優(yōu)異的新型生物學(xué)材料。目前對(duì)BC應(yīng)用主要集中在高附加值的生物醫(yī)用材料上，如組織工程支架、人造血管及人造皮膚等方面。 能夠產(chǎn)生以細(xì)菌纖維素的細(xì)菌主要有Acetobacter、Rhizobium、Agrobacterium和SarcinB 等，其中產(chǎn)量最高的為木醋桿菌，A^to如cter Zj^iZWA屬革蘭氏陰性(少數(shù)可變)；嚴(yán)格好氧，呼吸代謝從不發(fā)酵；傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為乙醇、甘油和乳酸是最好的碳源。雖然木醋桿菌產(chǎn)量較高，但仍不能解決細(xì)菌纖維素生產(chǎn)成本居高不下的問題?！栋褪洗讞U菌合成細(xì)菌纖維素的研究》一文中公開了以甘油的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌纖維素的方法，通過正交試驗(yàn)篩選出以 7%的巴氏醋桿菌接種量在31 °C條件下培養(yǎng)，主要碳源為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的甘油，其細(xì)菌纖維素的最高產(chǎn)量為2. 326g。但是，該方法中采用了價(jià)格較高的牛肉膏和蛋白胨作為培養(yǎng)基的主要成分，且僅進(jìn)行IOmL體系的小規(guī)模培養(yǎng)。眾所周知，在微生物工程領(lǐng)域中，從小規(guī)模的實(shí)驗(yàn)篩選到中試規(guī)模以上的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，每個(gè)環(huán)節(jié)的條件都必須得到優(yōu)化，其中，也包括培養(yǎng)基的優(yōu)化，如未經(jīng)優(yōu)化，將小試實(shí)驗(yàn)條件機(jī)械地?cái)U(kuò)大于規(guī)模化生產(chǎn)通常是無法實(shí)施的。另夕卜，該文章中，甘油僅作為復(fù)合培養(yǎng)基中的碳源使用。而傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)需要碳源、氮源、無機(jī)鹽及生產(chǎn)因子等復(fù)合調(diào)配才能實(shí)現(xiàn)。另外，培養(yǎng)基還得滿足產(chǎn)物最經(jīng)濟(jì)的合成的基本要求。此外，細(xì)菌纖維素的技術(shù)障礙主要在于發(fā)酵水平較低，產(chǎn)量低、成本高、價(jià)格不抵普通植物纖維素；二是進(jìn)一步研究和利用細(xì)菌纖維素的成膜和成型的工藝技術(shù)還沒有解決。如何提高纖維素產(chǎn)量，降低成本，尋找更廉價(jià)更好的細(xì)菌纖維素生產(chǎn)原料從而進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，仍將是細(xì)菌纖維素研究的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供兩種細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成本低廉，來源廣泛，用于細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)其產(chǎn)率高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
甘油培養(yǎng)液，所述甘油培養(yǎng)液為緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為 8g/L-24g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為5. 0-7. 5。進(jìn)一步，所述甘油培養(yǎng)液為緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為 12g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為7. 0。進(jìn)一步，所述緩沖液為醋酸緩沖液。含有所述的甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，按重量份計(jì)每1000份由以下組分組成甘油8-24份，K2HPO4 1-9份，酵母膏4_20g，余量為緩沖液，所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的pH 值為 5. 0-7. 5。進(jìn)一步，按重量份計(jì)每1000份由以下組分組成甘油124份，K2HPO4 5份，酵母膏 13g，余量為緩沖液，所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的pH值為7. 0。本發(fā)明的目的之二在于提供細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)方法，該方法操作簡單，周期短，適用于中式以上規(guī)模的生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
細(xì)菌纖維素的制備方法，具體為將木醋桿菌菌種接種于培養(yǎng)基中，在IOO-ISOrpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2-3天，所得木醋桿菌菌種按2-20%接種量接種于培養(yǎng)基中，在IOO-ISOrpm 條件下?lián)u床培養(yǎng)2-3天，所得發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至淺盤中靜態(tài)培養(yǎng)2-5天，得細(xì)菌纖維素，所述培養(yǎng)基為所述甘油培養(yǎng)液或所述含有甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為 26-31 °C，培養(yǎng)時(shí)通氣量為0. 3-0. 6vvm。進(jìn)一步，將木醋桿菌菌種接種于培養(yǎng)基中，在150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，所得木醋桿菌菌種按7%接種量接種于培養(yǎng)基中，在150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，所得發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至淺盤中靜態(tài)培養(yǎng)5天，得細(xì)菌纖維素，所述培養(yǎng)基為所述甘油培養(yǎng)液或所述含有甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為30°C。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明首次將甘油作為核心培養(yǎng)基原料，用濃度為Sg/ L-24g/L的甘油用于培養(yǎng)細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基成本低廉，用于培養(yǎng)細(xì)菌纖維素收率高，且可縮短培養(yǎng)時(shí)間。另外，本發(fā)明為細(xì)菌纖維素穩(wěn)定的大規(guī)模細(xì)菌纖維素培養(yǎng)提供了重要條件。將培養(yǎng)基結(jié)合特有的動(dòng)、靜結(jié)合培養(yǎng)，可明顯提高細(xì)菌纖維素收率，縮短細(xì)菌纖維素培養(yǎng)時(shí)間。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的木醋桿菌(gluconacetobacter xylium)，購自中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種編號(hào)為1. 2378。下述細(xì)菌纖維素冷凍干燥過程是將細(xì)菌纖維素平鋪于冷凍干燥盤中，進(jìn)行從-30°C —25°C逐級(jí)控溫冷凍真空干燥，直至細(xì)菌纖維素完全干燥。冷凍干燥法利用深低溫冷凍方法使細(xì)菌纖維素濕膜內(nèi)的水變?yōu)楣虘B(tài)，然后在真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，利用控制其真空度的方法，使膜內(nèi)固態(tài)的水升華。并用冷凝方法捕獲并冷凝升華的水汽，致使物質(zhì)脫水干燥。真空冷凍干燥過程在極低的溫度和高真空的條件下進(jìn)行，對(duì)材料的熱變性小，在最大限度上保持了材料的生物學(xué)活性。同時(shí)，在升華的過程中，不會(huì)破壞它的物理結(jié)構(gòu)，化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化也很小，因此可以很好地保存細(xì)菌纖維素膜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。實(shí)施例1甘油培養(yǎng)液及含有所述甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基
配方一甘油培養(yǎng)液，所述甘油培養(yǎng)液為醋酸緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為8g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為5. 0。配方二 甘油培養(yǎng)液，其特征在于所述甘油培養(yǎng)液為醋酸緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為24g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為7. 5。配方三所述甘油培養(yǎng)液為醋酸緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為12g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為7.0。配方四按重量份計(jì)每1000份由以下組分組成甘油8份，K2HPO4 1份，酵母膏4g，余量為含有醋酸緩沖液，所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的PH值為5. O。
對(duì)比配方四同配方四的唯一區(qū)別在于將甘油以等重的葡萄糖替代。配方五按重量份計(jì)每1000份由以下組分組成甘油24份，K2HPO4 9份，酵母膏 20g,余量為含有醋酸緩沖液，所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的pH值為7. 5。對(duì)比配方五同配方五的唯一區(qū)別在于將甘油以等重的D-果糖替代。配方六按重量份計(jì)每1000份由以下組分組成甘油12份，K2HPO4 5份，酵母膏 13g，余量為含有醋酸緩沖液，所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的PH值為7. 0。對(duì)比配方六同配方六的唯一區(qū)別在于將甘油以等重的可溶性淀粉替代。實(shí)施例2制備細(xì)菌纖維素
將木醋桿菌菌種接種于培養(yǎng)基中，在ISOrpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，所得木醋桿菌菌種按2%接種量接種于培養(yǎng)基中，在靜態(tài)條件下培養(yǎng)3天，所得發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至淺盤中靜態(tài)培養(yǎng)5 天，得細(xì)菌纖維素，所述培養(yǎng)溫度為31°C，培養(yǎng)時(shí)通氣量為0. 3vvm。將所得細(xì)菌纖維素放入 90° C去離子水中殺菌2小時(shí)，取出后用去離子水清洗2次；用沸騰的0.5 mol/L的NaOH 溶液煮15 min ；放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NaOH溶液中靜置2天；放置在去離子水中浸泡至中性，進(jìn)行稱重，稱重結(jié)果詳見表1中對(duì)應(yīng)的“重量1”對(duì)應(yīng)欄。另外將所得細(xì)菌纖維素進(jìn)行冷凍干燥，對(duì)冷凍干燥的細(xì)菌纖維素進(jìn)行稱重，結(jié)果詳見表3中對(duì)應(yīng)的“重量2”對(duì)應(yīng)欄。表1細(xì)菌纖維素膜的產(chǎn)率 __
權(quán)利要求
1.甘油培養(yǎng)液，其特征在于所述甘油培養(yǎng)液為緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為8g/L-24g/L，所述甘油培養(yǎng)液的PH值為5. 0-7. 5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘油培養(yǎng)液，其特征在于所述甘油培養(yǎng)液為緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為12g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘油培養(yǎng)液，其特征在于所述緩沖液為醋酸緩沖液。
4.含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，其特征在于所述細(xì)菌纖維蘇培養(yǎng)基由以下組分組成甘油培養(yǎng)液，K2HPO4，酵母膏，所述甘油培養(yǎng)液中甘油與K2HPO4和酵母膏的質(zhì)量比為8-24:1-9:4-20 ；所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的pH值為5. 0-7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，其特征在于所述甘油培養(yǎng)液中甘油與 K2HPO4和酵母膏的質(zhì)量比為15:3:8 ；所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的pH值為6.0。
6.細(xì)菌纖維素的制備方法，其特征在于，具體為將木醋桿菌菌種接種于培養(yǎng)基中， 在IOO-ISOrpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2_3天，所得木醋桿菌菌種按2-20%接種量接種于培養(yǎng)基中，在IOO-ISOrpm條件下?lián)u床培養(yǎng)2_3天，所得發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至淺盤中靜態(tài)培養(yǎng)2_5天，得細(xì)菌纖維素，所述培養(yǎng)基為所述甘油培養(yǎng)液或所述含有甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為26-31°C，培養(yǎng)時(shí)通氣量為0. 3-0. 6vvm。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細(xì)菌纖維素的制備方法，其特征在于，將木醋桿菌菌種接種于培養(yǎng)基中，在150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，所得木醋桿菌菌種按7%接種量接種于培養(yǎng)基中，在150rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)3天，所得發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至淺盤中靜態(tài)培養(yǎng)5天，得細(xì)菌纖維素，所述培養(yǎng)基為所述甘油培養(yǎng)液或所述含有甘油培養(yǎng)液的細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)溫度為30°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基及其制備方法,細(xì)菌纖維素的培養(yǎng)基為甘油培養(yǎng)液，由醋酸緩沖液和甘油組成，所述甘油培養(yǎng)液中甘油的濃度為8g/L-24g/L，所述甘油培養(yǎng)液的pH值為5.0-7.5；或按重量份計(jì)每1000份由以下組分組成甘油8-24份，K2HPO41-9份，酵母膏4-20g，余量為醋酸緩沖液，所述細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基的pH值為5.0-7.5；本發(fā)明首次將甘油作為培養(yǎng)基原料，該培養(yǎng)基成本低廉，用于培養(yǎng)細(xì)菌纖維素收率高，且可縮短培養(yǎng)時(shí)間；另外，本發(fā)明為細(xì)菌纖維素穩(wěn)定的大規(guī)模細(xì)菌纖維素培養(yǎng)提供了重要條件；將培養(yǎng)基結(jié)合特有的動(dòng)、靜結(jié)合培養(yǎng)，可明顯提高細(xì)菌纖維素收率，縮短細(xì)菌纖維素培養(yǎng)時(shí)間。
文檔編號(hào)C12R1/02GK102329832SQ20111029876
公開日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者吳力克 申請(qǐng)人:吳力克