專(zhuān)利名稱(chēng)：青蝦MnSG基因、其擴(kuò)增方法及擴(kuò)增引物組的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因克隆領(lǐng)域，特別涉及青蝦MnSG基因、其擴(kuò)增方法及擴(kuò)增引物組。
背景技術(shù)：
在真核生物中，受精是指兩性生殖細(xì)胞的相互融合。受精包括精子獲能，頂體反應(yīng)，結(jié)合穿越透明帶，和卵膜的相互融合等一系列復(fù)雜的生理過(guò)程。而精子表面的蛋白酶在這些過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Honda等對(duì)老鼠的研究表明，老鼠的精子上存在一種具有水解明膠活性的蛋白酶，該蛋白酶被認(rèn)為在精子穿越卵膜時(shí)發(fā)揮重要作用。^ambaugh等在兔子的研究中發(fā)現(xiàn)，兔精子頂體上一種胰蛋白酶是精子成功穿越卵膜所必需的。Kodama 等對(duì)海鞘的研究表明，海鞘iihlocynthia roretzi)精子上的一種類(lèi)胰蛋白酶spermosin， 在海鞘精子穿越卵膜的過(guò)程中起了重要的協(xié)助作用。目前，關(guān)于甲殼類(lèi)動(dòng)物精子蛋白酶的研究非常有限，Li等對(duì)羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的研究中發(fā)現(xiàn)，I ro^/^argii精子中一種明膠酶蛋白是雄性生殖道特有的，被認(rèn)為可能參與受精過(guò)程。Rios 等對(duì)正型動(dòng)額蝦O^j^doci/^iM typus)的研究表明，R. typus的精子提取物中，一種具有胰蛋白酶活性的蛋白被認(rèn)為參與精子穿越卵膜的過(guò)程。青蝦(Macrobrachium nipponense)是我國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種。目前青蝦的分子研究多集中在群體遺傳多樣性方面，其基因克隆研究較少，而對(duì)青蝦精子蛋白酶相關(guān)基因克隆的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以青蝦為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室青蝦精巢cDNA 文庫(kù)中蹄選至lJ的一個(gè)青蟲(chóng)下精子類(lèi)明膠酶(Macrobrachium nipponense sperm gelatinase, MnSG)基因片段，通過(guò)RACE技術(shù)克隆出該基因全長(zhǎng)cDNA序列，以期為后續(xù)青蝦MnSG基因功能的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為甲殼類(lèi)生殖研究積累背景資料。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供青蝦MnSG基因、其擴(kuò)增方法及擴(kuò)增引物組。利用本發(fā)明提供的引物組從青蝦精巢組織中克隆到了 MnSG基因序列，對(duì)青蝦MnSG基因功能的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為甲殼類(lèi)生殖研究積累背景資料。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
本發(fā)明提供了青蝦MnSG基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增青蝦MnSG基因的引物組，其由如下引物組成 引物組
正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內(nèi)引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內(nèi)引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增青蝦MnSG基因的方法，包括如下步驟 步驟1 獲得青蝦腦組織總RNA ；
步驟2 合成cDNA ；
步驟3 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精巢cDNA文庫(kù)中篩選到MnSG基因片段，以此作為中間序列；
步驟4 用引物組擴(kuò)增獲得青蝦MnSG基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組由如下引物組成
正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內(nèi)引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內(nèi)引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。步驟5 將所述MnSG基因cDNA序列的中間片段、所述MnSG基因的3，端和5，端片段拼接，即得。 作為優(yōu)選，步驟4所述擴(kuò)增為套式兩輪PCR。本發(fā)明以青蝦精巢組織為材料，分離了青蝦MnSG基因全長(zhǎng)cDNA序列，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、嵌套聚合酶鏈反應(yīng)(NeSted-PCR)、3，端cDNA快速擴(kuò)增 (3，-RACE)以及5，端cDNA快速擴(kuò)增(5，-RACE)的方法，對(duì)青蝦MnSG基因進(jìn)行了研究，首次從青蝦精巢組織中克隆到了 MnSG基因全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其所編碼的MnSG的序列特征、同源性、進(jìn)化地位進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究青蝦MnSG基因的表達(dá)、功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為甲殼類(lèi)生殖研究提供了新的材料。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明公開(kāi)了青蝦MnSG基因、其擴(kuò)增方法及擴(kuò)增引物組。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供了青蝦MnSG基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增青蝦MnSG基因的引物組，其由如下引物組成 引物組
正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內(nèi)引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內(nèi)引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。其中，正向外引物3 MnSG 1、正向內(nèi)引物3 MnSG 2與反向引物——3' RACE試劑盒中提供的3' RACE Outer Primer和3' RACE Inner Primer用于擴(kuò)增核苷酸序列如 SEQ ID NO: 1所示青蝦MNSG基因的3，端片段；
反向外引物5 MnSG 1、反向內(nèi)引物5 MnSG 2與正向引物——5' RACE試劑盒中提供的5' RACE Outer Primer 和 5' RACE Inner Primer 用于擴(kuò)增核苷酸序列如 SEQ ID N0:1 所示青蝦MnSG基因的5’端片段。本發(fā)明還提供了一種擴(kuò)增青蝦MnSG基因的方法，包括如下步驟 步驟1 獲得青蝦腦組織總RNA ；
步驟2 合成cDNA ；
步驟3 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精巢cDNA文庫(kù)中篩選到MnSG基因片段，以此作為中間序列；
步驟4 用引物組擴(kuò)增獲得青蝦MnSG基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組由如下引物組成
正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內(nèi)引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內(nèi)引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。步驟5 將所述MnSG基因cDNA序列的中間片段、所述MnSG基因的3，端和5，端片段拼接，即得。作為優(yōu)選，步驟4所述擴(kuò)增為套式兩輪PCR。使用ClustalWl. 83將MnSG蛋白序列與已公布的部分甲殼類(lèi)MnSG蛋白序列進(jìn)行了比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示，青蝦MnSG蛋白序列與羅氏沼蝦最為相似。本發(fā)明中青蝦由太湖無(wú)錫湖區(qū)漁民提供，試劑均可由市場(chǎng)夠得，純化及cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司(Sang0n)，3'及5' RACE試劑盒購(gòu)自寶生物(大連)有限公司(Takara)。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明 實(shí)施例1
總RNA提取逐個(gè)取青蝦精巢組織，迅速放入盛有液氮的預(yù)冷研缽中，共取三只青蝦的精巢組織共約30mg，解剖速度要快并且注意添加液氮；總RNA的提取使用Takara公司的 RNAiso Plus提取試劑結(jié)合傳統(tǒng)的酚仿抽提法進(jìn)行，提取方法參照使用說(shuō)明書(shū)。cDNA第一鏈合成據(jù)上海生工生物工程有限公司(Sangon) cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。青蝦MnSG基因全長(zhǎng)cDNA序列的克隆
根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精巢cDNA文庫(kù)中篩選到的MnSG基因片段設(shè)計(jì)引物，用于3’ 端、5，端快速擴(kuò)增，得到青蝦MnSG基因全長(zhǎng)cDNA序列； MnSG基因cDNA 3，端快速擴(kuò)增(3，-RACE) 根據(jù)MnSG基因中間片段序列，設(shè)計(jì)特異性正向引物3 MnSG 1和3 MnSG 2 ；與正向引物3 MnSG 1和3 MnSG 2相配對(duì)反向引物是3' RACE試劑盒中提供的3 ‘ RACE Outer Primer 和 3' RACE Inner Primer，進(jìn)行 cDNA 3，快速擴(kuò)增，操作步驟按 TaKaRa 3，-RACE 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。正反引物序列如下
3 MnSG 1 5' - AGCACAGGAGTTCAAGGACA -3' 3 MnSG 2 5' - GACGCTTCGGTATCCTACTT -3' 3' RACE Outer Primer 5' -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3‘3' RACE Inner Primer 5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3‘ 反轉(zhuǎn)錄
按照3' RACE試劑盒中的說(shuō)明進(jìn)行，獲得3' RT液。
權(quán)利要求
1.青蝦MnSG基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。
2.用于擴(kuò)增青蝦MnSG基因的引物組，其特征在于，其由如下引物組成 引物組正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內(nèi)引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內(nèi)引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
3.一種擴(kuò)增青蝦MnSG基因的方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟1 獲得青蝦腦組織總RNA ；步驟2 合成cDNA ；步驟3 從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的青蝦精巢cDNA文庫(kù)中篩選到MnSG基因片段，以此作為中間序列；步驟4 用引物組擴(kuò)增獲得青蝦MnSG基因片段的3’端和5’端片段；所述引物組由如下引物組成正向外引物3 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； 正向內(nèi)引物3 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示； 反向外引物5 MnSG 1的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示； 反向內(nèi)引物5 MnSG 2的核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示。
4.步驟5將所述MnSG基因cDNA序列的中間片段、所述MnSG基因的3，端和5，端片段拼接，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟4所述擴(kuò)增為套式兩輪PCR。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因克隆領(lǐng)域，特別涉及青蝦精子類(lèi)明膠酶(Macrobrachiumnipponensespermgelatinase,MnSG)基因、其擴(kuò)增方法及擴(kuò)增引物組。利用本發(fā)明提供的引物組從青蝦精巢組織中克隆到了一種MnSG基因全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)青蝦MnSG基因功能的研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為甲殼類(lèi)生殖研究積累背景資料。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102367449SQ20111030379
公開(kāi)日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者喬慧, 傅洪拓, 卜憲飛, 吳滟, 龔永生 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心