專利名稱：直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，尤其涉及直接將人的成纖維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元樣細胞的方法及其用途。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)公開了神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺在維持人的正常運動和動作協(xié)調(diào)方面起重要作用，當產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元發(fā)生凋亡時，多巴胺的產(chǎn)生減少，患者將出現(xiàn)肌肉震顫，動作不協(xié)調(diào)甚至運動障礙，醫(yī)學上稱為帕金森氏病。目前還沒有有效的藥物能治療帕金森氏病。有人嘗試移植能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元，可以明顯減輕患者的癥狀。本領(lǐng)域公知，由于神經(jīng)元是終末分化細胞，不能通過細胞分裂增殖的方法獲得，因此，移植細胞來源于其他個體，如因外傷或疾病死亡的捐獻者或胎兒。這類細胞很難獲得，即使能夠得到，由于來自其他個體，會引發(fā)免疫排斥反應，最終仍將導致移植細胞凋亡或死亡，治療失敗。因此，能從患者自體來源的細胞誘導出能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞的方法顯得非常重要。如何從自體來源的細胞誘導出能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞？有關(guān)研究通常嘗試以下方法一是從來源于自體的神經(jīng)干細胞誘導產(chǎn)生，由于從自體獲得神經(jīng)干細胞也是非常困難的，因此，實際應用價值不大；二是從自體來源的成纖維細胞誘導產(chǎn)生多能干細胞，再誘導多能干細胞向多巴胺神經(jīng)元分化。然而，目前的方法還不能完全誘導多能干細胞定向分化，值得注意的是，未完全分化的干細胞有產(chǎn)生畸胎瘤的危險！實際應用也存在限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，提供一種誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，尤其涉及直接將人成纖`維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元樣細胞的方法。本發(fā)明的另一目的是提供所述方法獲得的神經(jīng)元樣細胞在制備減輕帕金森氏病大鼠的運動障礙制劑中的用途。本發(fā)明的方法，可以繞過現(xiàn)有技術(shù)中所涉及的多能干細胞的環(huán)節(jié)，直接從來源于自體的成纖維細胞誘導能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞，該直接誘導得到的神經(jīng)細胞用于帕金森氏病大鼠動物模型，可以明顯減輕帕金森氏病大鼠的運動障礙。具體而言，本發(fā)明的直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，其包括I)選擇誘導人成纖維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)錄因子及其組合，本發(fā)明中，可以參與直接將人的成纖維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞的8個轉(zhuǎn)錄因子，它們是Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3, LmxlA, LmxlB 和 ENl,本發(fā)明中，優(yōu)選Mashl, Ngn2, Sox2, Nurrl和Pitx3的組合,更優(yōu)選Mashl, Ngn2或Sox2轉(zhuǎn)錄因子或及其與其他因子的組合。
表I是八種參與誘導人成纖維細胞轉(zhuǎn)變成多巴胺神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)錄因子。表I
權(quán)利要求
1.直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，其包括步驟 1)選擇誘導人成纖維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)錄因子及其組合； 2)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子病毒載體及介導轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移； 3)將步驟2)的病毒載體感染人成纖維細胞及多巴胺樣神經(jīng)細胞的鑒定。
2.按權(quán)利要求1所述的直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，所述步驟I)的轉(zhuǎn)錄因子及其組合是，Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3, Lmx 1A, LmxlB和ENl及其組合。
3.按權(quán)利要求1所述的直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，所述步驟I)的轉(zhuǎn)錄因子及其組合是Mashl, Ngn2, Sox2, Nurrl和Pitx3的組合。
4.按權(quán)利要求1所述的直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，所述步驟I)的轉(zhuǎn)錄因子及其組合是Mashl，Ngn2或Sox2轉(zhuǎn)錄因子或其與其他因子的組合。
5.按權(quán)利要求1所述的直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，所述步驟2)的攜帶轉(zhuǎn)錄因子病毒載體是攜帶Mashl, Ngn2, Sox2, NurrI, Pitx3,Lmx 1A, LmxlB或ENl編碼基因的慢病毒載體，或攜帶Mashl, Ngn2, Sox2, Nurrl或Pitx3編碼基因的腺病毒載體。
6.按權(quán)利要求1所述的直接從人成纖維細胞誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，其特征在于，所述步驟3)的病毒載體感染人成纖維細胞及多巴胺樣神經(jīng)細胞的鑒定通過下述方法 用構(gòu)建的攜帶轉(zhuǎn)錄因子的病毒感染人離體成纖維細胞后，將感染過的人成纖維細胞接種到由失活的小鼠成纖維細胞組成的飼養(yǎng)層細胞上或細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，存活的人成纖維細胞，經(jīng)免疫熒光染色法鑒定所述細胞表達神經(jīng)元標志物Tujl以及與多巴胺產(chǎn)生有關(guān)的酶。
7.按權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的與多巴胺產(chǎn)生有關(guān)的酶包括，酪氨酸羥化酶，多巴脫羧酶和多巴胺轉(zhuǎn)運體。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及誘導產(chǎn)生多巴胺樣神經(jīng)元的方法，尤其涉及直接將人的成纖維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元樣細胞的方法及其用途。本方法包括步驟選擇誘導人成纖維細胞轉(zhuǎn)變成能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)錄因子及其組合；構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子病毒載體及介導轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)移；構(gòu)建的病毒載體感染人成纖維細胞及多巴胺樣神經(jīng)細胞的鑒定。本發(fā)明方法可以繞過現(xiàn)有技術(shù)中所涉及的多能干細胞的環(huán)節(jié)，直接從來源于自體的成纖維細胞誘導能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞；直接誘導得到的神經(jīng)細胞用于帕金森氏病大鼠動物模型，可以明顯減輕帕金森氏病大鼠的運動障礙。
文檔編號C12N5/10GK103031335SQ20111030449
公開日2013年4月10日 申請日期2011年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月9日
發(fā)明者李川源, 劉新建, 李芳 , 黃倩 申請人:李川源, 黃倩