專利名稱：擬南芥熱激因子基因AtHsfA1d 的植物表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及擬南芥熱激因子基因JiZfei^A/的植物表達(dá)載體及其在制備吸收甲醛能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲醛是一種無色，有強(qiáng)烈刺激氣味的氣體，易溶于水、醇和醚。它反應(yīng)能力極強(qiáng)， 能與蛋白質(zhì)，核酸和脂類產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1973，13:1-49)，是一種非?；顫姷幕衔铮虼藢λ械纳飦碚f都有很高的毒性。 甲醛被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)中，是制造樹脂、膠粘劑、油漆、塑料、人造纖維的原料，是膠粘劑工業(yè)應(yīng)用最廣泛的化學(xué)原材料。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，各種原料制成的建筑裝飾材料已走入各種室內(nèi)公共場所和家庭，使甲醛成為室內(nèi)空氣污染公認(rèn)最具代表性的化學(xué)物質(zhì)。人們?nèi)胱⌒戮佣家M(jìn)行室內(nèi)裝飾和更新家具，其正是室內(nèi)空氣甲醛污染的主要來源。甲醛污染危害嚴(yán)重的場所是居室、辦公室、會議室、賓館、KTV包房、家具商場、建材商場等。室內(nèi)空氣中游離甲醛濃度在中國規(guī)定的允許值是0.08 (mg /立方米)，有調(diào)查表明新的賓館客房室內(nèi)空氣中甲醛濃度最高達(dá)0. 36mg/立方米，平均為0. 17;3mg/立方米， 是室外對照的13倍。而家具商場最高達(dá)0.87;3mg/立方米，平均為0.43aiig/立方米，是室外對照的33倍。建成一所經(jīng)過裝飾的實(shí)驗(yàn)室，空氣中甲醛平均濃度高達(dá)0. 5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽樣檢測發(fā)現(xiàn)單位及住戶室內(nèi)環(huán)境污染嚴(yán)重，查了 11家只有1戶合格，其中竟有1戶甲醛超標(biāo)25倍。甲醛為較高毒性物質(zhì)，當(dāng)室內(nèi)空氣中甲醛含量為0. Img/立方米時(shí)，就有異味和不適感；達(dá)到0.5 mg/立方米時(shí)，可刺激眼睛，引起流淚；達(dá)到0.6 mg/立方米時(shí)，可引起咽喉不適或疼痛。濃度更高時(shí)，可引起惡心嘔吐，咳嗽胸悶，氣喘甚至肺水腫；達(dá)到30 mg/立方米時(shí)，會立即致人死亡。長期接觸低劑量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻煙癌、結(jié)腸癌、腦瘤、月經(jīng)紊亂、細(xì)胞核的基因突變，D N A單鏈內(nèi)交連和D N A與蛋白質(zhì)交連及抑制 D N A損傷的修復(fù)、妊娠綜合癥、引起新生兒染色體異常、白血病，這就是所謂的裝修綜合病(sick-house)。相對于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TDI、VOC等有害物質(zhì)來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。Achkor等人為了檢測甲醛脫氫酶在植物中的功能，對來源于擬南芥FALDH的基因進(jìn)行遺傳操作，得到了有不同F(xiàn)ALDH表達(dá)水平的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。過量表達(dá)此酶的擬南芥對外源甲醛的攝取效率提高25%，F(xiàn)ALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反義表達(dá))和野生型擬南芥相比，甲醛脫毒速率顯著緩慢，能力下降。這些結(jié)果證明在擬南芥中過量表達(dá)FALDH可以提高轉(zhuǎn)基因擬南芥吸收外界環(huán)境中液體甲醛的能力(Achkor等，Plant Physiol, 2003，132(4) 2248-2255)。熱激蛋白(HSPs)是高溫誘導(dǎo)合成的蛋白，熱激因子(HSFs)是一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控HSP基因的表達(dá)。HSFs是調(diào)控應(yīng)答熱激和大量化學(xué)脅迫的基因活性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈的終端成分，在植物中有20到30不同的植物HSFs，在擬南芥中有21個(gè)HSFs。我們用甲醛處理擬南芥，通過半定量RT-PCR分析部分HSP基因的表達(dá)譜。結(jié)果顯示在沒有甲醛脅迫下有低水平的表達(dá)，隨著甲醛處理時(shí)間的延長』i/fe/JA/的表達(dá)量增加，說明熱激因子 A tHsfAld參與了擬南芥對甲醛的脅迫應(yīng)答，A tHsfAld是甲醛脅迫的響應(yīng)基因，且是受甲醛誘導(dǎo)上調(diào)的表達(dá)的基因，因此可能是提高植物耐受甲醛脅迫的一種候選基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有擬南芥熱激因子基因(即JiZfei^A/基因)的植物表達(dá)載體pK2-35S jiife/Wi/，該載體含有擬南芥熱激因子Ji^s/Wi/基因的cDNA及卡那霉素篩選標(biāo)記基因K2和組成型啟動(dòng)子CaMV 35S，CaMV 35S的組成型啟動(dòng)子位于熱激因子 cDNA的上游。所述的熱激因子基因的cDNA來源于擬南芥Ura力ii/oAsis thaiiana), 擬南芥的熱激因子基因J的GenBank登錄號為8405125，用于構(gòu)建所屬植物表達(dá)載 #^ ^ pK2GW7(J)^ g Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。本發(fā)明另一目的是利用擬南芥熱激因子Ji/fe/JA/的植物表達(dá)載體制備快速吸收和耐受甲醛的轉(zhuǎn)基因植物中。本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的 1.植物表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)從GenBank中查找擬南芥基因的cDNA序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對引
物
上游引物 5' CGGAATTCATGGATGTGAGCAAAGTAACCACAAG3'(含有^boRI 位點(diǎn))； 下游引物 5，GCCTCGAGTCAAGGATTTTGCCTTGAGAGATCTAAGG3'(含有 Xho I 位點(diǎn)) 上游引物5’端加GAATTC特征序列，并由此形成&舊I酶切位點(diǎn)；下游引物3’末端加 Xho I酶切位點(diǎn)，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增得到基因的全長 cDNA ；
(2)回收并純化Ji他以^/全長基因cDNA片段，并將其連接到pMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD18-T；
(3)構(gòu)建入門載體pENTR2B-Ji他/J7i/，用 &0R I 禾Π Xho I 酶切 pMD18 ji他和 PENTR2B (Invitrogen),回收4(他以7^/的cDNA片段和載體DNA片段pENTR，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到入門載體pENTR2B1iHs/J7i/ ；
(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2_35Sj^s/Wi/，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把Ji^s/Wi/亞克隆到植物表達(dá)載體PK2GW7中，獲得Ji^s/Wi/基因的植物表達(dá)載體pK2-35Sjiife/J7i/。本發(fā)明的植物表達(dá)載體對那些能實(shí)施轉(zhuǎn)基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、 矮牽牛、非洲菊等，在本發(fā)明的實(shí)施例中以煙草為例說明該表達(dá)載體的應(yīng)用過程。2.煙草遺傳轉(zhuǎn)化
采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK2-35S進(jìn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在Spe平板上生
長兩天后，用菌落PCR檢測質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。PCR擴(kuò)增用的上下游引物， 擴(kuò)增片段理論長度為1458 bp, PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。制備煙草OVicoiiaa3 tabacum cv. Xanth)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，篩選卡那霉素抗性植株。3. PCR檢測目的基因在煙草中的整合情況
為了檢測目的基因JiZfei^A/是否插入有卡那霉素抗性植株煙草的基因組，以抗性苗的基因組為模板，利用的上下游引物做PCR檢測，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段理論長度為 1458 bp, PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因4^ / ^/已插入到煙草基因組中。4.目的基因轉(zhuǎn)錄水平的檢測
為了檢測目的基因力在轉(zhuǎn)基因煙草中是否轉(zhuǎn)錄，提取抗性苗的RNA，利用乂力他以7^/的上下游引物進(jìn)行RT-PCR檢測，RT-PCR擴(kuò)增片段理論長度為1458 bp，RT_PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因已在轉(zhuǎn)基因煙草中正常轉(zhuǎn)錄。5.目的基因編碼蛋白表達(dá)水平的檢測
為了檢測目的基因Ji他以A/編碼的蛋白在煙草中是否表達(dá)，選取經(jīng)RT-PCR檢測正確的轉(zhuǎn)基因株系的嫩葉，提取總蛋白進(jìn)行Western分析。一抗為HSFAld的鼠抗體。根據(jù) J力他以7^/基因的核酸序列推測表達(dá)的蛋白大小約為M kD，Western分析結(jié)果說明檢測到的蛋白質(zhì)條帶大小與理論預(yù)測值相符，說明編碼的蛋白在煙草中已成功表達(dá)。6.轉(zhuǎn)基因煙草甲醛吸收速率檢測
根據(jù)蛋白表達(dá)水平，選擇高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行甲醛吸收速率檢測，用4 mM甲醛溶液處理轉(zhuǎn)基因煙草植株0 h，0. 5 h，2 h，6 h，24 h，48 h和72 h，檢測處理液中剩余甲醛的濃度。結(jié)果說明隨著時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草處理液中剩余甲醛的濃度比野生型煙草低，說明轉(zhuǎn)基因煙草比野生型煙草應(yīng)答甲醛的速率要快，這說明擬南芥熱激因子在煙草中的過量表達(dá)可提高其甲醛吸收速率。7.轉(zhuǎn)基因煙草對甲醛的抗性檢測
取大小相當(dāng)?shù)囊吧秃娃D(zhuǎn)基因煙草無菌苗在含有6 mM甲醛的MS固體培養(yǎng)基上25°C持續(xù)光照培養(yǎng)，處理7天后測定其鮮重和總蛋白含量。結(jié)果說明在甲醛脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因煙草的鮮重比野生型煙草大，說明轉(zhuǎn)基因煙草對高濃度的甲醛脅迫的抗性較野生型煙草強(qiáng)， 這說明擬南芥熱激因子在煙草中的過量表達(dá)可提高其對甲醛的抗性。對煙草蛋白含量的測定發(fā)現(xiàn)甲醛脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白的含量比野生型煙草以及未用甲醛處理的轉(zhuǎn)基因煙草高，這表明擬南芥的過量表達(dá)可能誘導(dǎo)了其他蛋白的高水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明的重組載體在轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用可提高植物對甲醛的吸收速率和抗性。


圖1是pMD18 -AtHsfAld的TA克隆策略圖。 圖2是TA克隆載體pMD18 — A tHSFAld的電泳檢測圖。是 PCR 擴(kuò)增基因的 cDNA 片段，M =Maker III ； 1-2 -AtHsfAld 的擴(kuò)增產(chǎn)
物；B 是質(zhì)粒 pMD18-T的電泳檢測，M 對照質(zhì)粒；1-2 :ρΜ 18- -AtNsfAld ；C 是
PMD18-T-Ji他質(zhì)粒的 PCR 檢測，M =Maker III ； 1-9 以 pMD18_T-Ji他質(zhì)粒為模板的PCR產(chǎn)物；10 負(fù)對照；D是重組質(zhì)粒pMD18-T單雙酶切檢測，M =Maker III ；1
EcoRl 酶切 pMD18-T-Ji他產(chǎn)物。圖3是入門載體pENTR2B他以7^/的構(gòu)建策略圖。圖4是入門載體pENTR2B j tHsfAld的電泳檢測圖。是pENTR2B質(zhì)粒的菌落PCR檢測，1-8 擴(kuò)增產(chǎn)物；9 負(fù)對照；M =Maker III ;B是萬co7 /和損oI雙酶切檢測質(zhì)粒pENTR2Bj^7 i 7 /，M:Maker III ；1 -.EcoRl^WXhol 酶切產(chǎn)物；2 質(zhì)粒 pENTR2B jiHs/J7i/。圖5是用Gateway的LR反應(yīng)構(gòu)建力他以7^/基因cDNA植物表達(dá)載體的策略圖。圖6是植物表達(dá)載體pK2_35S jiife/Wi/的電泳檢測及其農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落的電泳檢測圖。是重組質(zhì)粒x^2- ^S-AtHsfAld的菌落PCR檢測，1-8 擴(kuò)增產(chǎn)物9 負(fù)對照；10 以 Ji^s/Wi/為模板作正對照；
B 是和損οI 雙酶切檢測重組質(zhì)粒 pK2-35S jiHs/J7i/，M =Maker III ；1 -.EcoRl 和 Xhol雙酶切產(chǎn)物；
C是菌落PCR檢測的轉(zhuǎn)化效果，1-5 菌落PCR樣品，6 正對照(以 PENTR2B為模板)；7 負(fù)對照(以 PK2GW7 為模板)；M =Maker III。圖7是在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況以及表達(dá)水平的電泳檢測。是轉(zhuǎn)煙草基因組PCR檢測，M =Maker III ；WT-1，WT_2 里予生型煙草；1-9 轉(zhuǎn)基因煙草株系；10 正對照；11 負(fù)對照；
B是轉(zhuǎn)4(他以7^/煙草的RT-PCR檢測，M: Maker III,WT-I 野生型煙草，1 一 8 轉(zhuǎn)基因煙草株系；
C是轉(zhuǎn)基因煙草的Western分析，WT,野生型煙草，5、6號株系轉(zhuǎn)基因煙草株系，正對照=AtHSFAld重組蛋白。圖8是轉(zhuǎn)基因煙草吸收液體甲醛速率的測定；ck 空白對照；wt 野生型煙草；6 號株系轉(zhuǎn)基因煙草。圖9是甲醛脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草鮮重和可溶性總蛋白含量變化的測定；其中
A是甲醛脅迫下煙草鮮重的變化。WT 野生型煙草；AtHsfAld-6 轉(zhuǎn)基因煙草；WT (HCHO)用甲醛處理的野生型煙草；AtHsfAld-6 (HCHO)用甲醛處理的轉(zhuǎn)基因煙草；
B是甲醛脅迫下煙草可溶性總蛋白含量的變化。WT 野生型煙草；WT (HCH0):用甲醛處理的野生型煙草；AtHSFAld-6 轉(zhuǎn)基因煙草6號株系；AtHSFAld_6 (HCH0):用甲醛處理的轉(zhuǎn)基因煙草6號株系。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例中采用的試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因植物鑒定和檢測所需的各種試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑盒、Gateway LR clonase Enzyme Mix kit購自irwitrogen公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學(xué)以及基因
6工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成，本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1 -J極基因cDNA的PCR擴(kuò)增及TA克隆
從GenBank中查找擬南芥基因的cDNA序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對引物 上游引物 5' CGGAATTCATGGATGTGAGCAAAGTAACCACAAG3' (BcoRI)； 下游引物 5'GCCTCGAGTCAAGGATTTTGCCTTGAGAGATCTAAGG3' (.XhoO 上游引物5’端加GAATTC特征序列，并由此形成&舊I酶切位點(diǎn)；下游引物3’末端加 Xho I酶切位點(diǎn)，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增，得到Aiifei^i/基因的全長cDNA。用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)/Λ it^f (Arabidopsis thaiiana)
取總RNA，取植物嫩葉約0. lg，加入Iml的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0. 5ml異丙醇，混勻室溫放置10min，4°C離心IOmin (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇Iml清洗，4°C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解 RNA。使用 M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)進(jìn)行 cDNA 的合成，取植物總 RNA約 0. 1 μ g-5 μ g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC 處理水補(bǔ)足至10 μ 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5min，冰浴lOmin， 加入反應(yīng)混合物 9 μ 1(5Xreaction buffer 4 μ l,25mM MgCl2 4 μ 1,0. IM DTT 2 μ 1，RNA 酶抑制劑1μ 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫aiiin，加入1 M-MuLV Reverse Transcriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫 20min，然后 42°C保溫 70min，合成 cDNA。以cDNA為模板，用J tHsfAld基因cDNA上下游特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到 Ji^s/Wi/的全長cDNA 1458 bp (圖2A)?；厥詹⒓兓L基因片段，并將其連接到PMD-18T (大連寶生物公司)載體上(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5 α (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進(jìn)一步的PCR檢測和雙酶切檢測(圖2Β)。以重組質(zhì)粒為模板，用引物5’和3’弓丨物擴(kuò)增到的1458 bp的PCR產(chǎn)物(圖2C)。根據(jù)陽性重組質(zhì)粒pMD18_T載體兩端的多克隆位點(diǎn)，用i^oRI單酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pMD18-T 單酶切產(chǎn)物理論上為2. 7kb和1. 4kb左右的條帶(圖2D)。實(shí)施例2 構(gòu)建入門載體pENTR2B-^s/J7i/
用 IAoI 和 &ORI 雙酶切 pMD18-T和 pENTR2B_ccdB (圖 3)，通過瓊脂糖
凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，分別回收被切割后產(chǎn)生的乂力他以7^/基因的cDNA片段(1. 4kb)和pENTR2B-ccdB被切割后產(chǎn)生的載體片段pENTR2B， 然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTR2B和Ji他以7^/基因的cDNA片斷產(chǎn)生入門載體(圖3)。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5 α，購自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km， 50 μ g/ml)的平板上，于37 oC過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出連接成功的質(zhì)粒載體pENTRB j^s/Wi/。以pENTR2B1^s/J7i/為模板，利用基因上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果得到約1.4 1Λ左右的條帶(圖4A)。用^oRI (Takara)和Xho I (Takara)雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶，分別為約2. 71Λ和1.41Λ (圖4B)。確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTR2B jiWM7i/。
實(shí)施例3 植物表達(dá)載體pK2_35S j tHsfAld的構(gòu)建
通過(Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把4(他以7^/亞克隆到植物表達(dá)載體pK2GW7(Gateway的目的載體，比利時(shí)VIB/Gent公司)中(圖5)。具體的做法是用質(zhì)粒抽提試劑盒純化(Gateway 的目的載體PK2GW7，在Gateway的LR反應(yīng)體系中加和pK2GW7各150ng， 1μ 1 LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25 °°反應(yīng)過夜，通過整合酶的作用把Ji^s/Wi/整合到pK2GW7中獲得Jiife/Wi/的植物表達(dá)載體質(zhì)粒pK2-35S j^s/Wi/ (圖 5)。用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞φΗδα，購自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe，50yg/ml)的平板上，于37 過夜培養(yǎng)， 篩選Spe抗性重組子菌落。從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出大小和對照質(zhì)粒pK2GW7 相似的整合成功的質(zhì)粒pK2-35S j tHsfAld進(jìn)行PCR檢測，正對照試驗(yàn)用pENTR2B j tHsfAld 作為模板，負(fù)對照用PK2GW7作為模板。pK235S他以7^/和pENTR2B1^s/J7i/擴(kuò)增產(chǎn)物均出現(xiàn)約1.41Λ目的條帶，負(fù)對照沒有擴(kuò)增產(chǎn)物(圖6A)。然后進(jìn)一步用酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，用和損ol酶切檢測pK2-35S j^s/Wi/，酶切結(jié)果得到11. Ikb和1458bp左右的兩條帶(圖6B)。確認(rèn)是整合成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。PK2GW7攜帶的篩選標(biāo)記基因?yàn)榭敲顾乜剐曰?Knf )，這樣可用加有卡那霉素的平板篩選轉(zhuǎn)基因植物。
實(shí)施例4 用HsfAld的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中， 輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進(jìn)行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入 0. 5mlS0C培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離心管中；28°C，200rpm搖床培養(yǎng)3_5h ；室溫下， 7500rpm離心lmin，棄大部分上清，保留100 μ 1將細(xì)胞懸?。话艳r(nóng)桿菌涂布于有壯觀霉素 (Spe,50yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入20 μ 1 ddH20中，98°C處理5分鐘后取出10 μ 1農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。 PCR檢測pK2-35S j^s/Wi/轉(zhuǎn)化結(jié)果，正對照擴(kuò)增體系模板使用pENTR2B質(zhì)粒，
負(fù)對照使用PK2GW7質(zhì)粒，擴(kuò)增片斷理論長度約為1.4 kb, PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析顯示其片段大小與理論預(yù)測值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(圖6C)。
實(shí)施例5 用含有基因的植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草
挑取攜帶有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含 Spe, ΙΟΟμ g/ml), 180rpmJ8°C培養(yǎng) 24h，待菌液 0D_ 至 1· O 左右，離心 IOmin (3000rpm), 沉淀菌體。再用IOml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心IOmin (3000rpm)，沉淀菌體。重復(fù)以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。 制備煙草OVicoiiaaa tabacum cv. Xanth)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草， 然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進(jìn)一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15-20min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSl (MS+NAA02. 1 μ g/ml+BAP 0. 02 μ g/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(50 μ g/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4 (MS+NAA0. 53 μ g/ml+BAPO. 5 μ g/ml)上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50ug/ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行根的誘導(dǎo)。實(shí)施例6 diifei^ii/基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及表達(dá)水平的檢測為了確認(rèn)通過卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實(shí)含有導(dǎo)入的目的基因的DNA片段，
用PCR方法對篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進(jìn)一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組 稱取植物葉片IOOmg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入 90(^1預(yù)熱到651的2\07^緩沖液(111^8-!1(1 pH 7.5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1.4 M, CTAB ^0，65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml EP管；再次加入500 μ 1氯仿一異戊醇混合液(24 :1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10 體積3M pH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20min( 12000rpm);棄上清，用75% 乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組DNA樣品。 以轉(zhuǎn)Ji/fe/Wi/煙草抗性苗基因組作為模板，用Ji/fe/Wi/基因上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測/是否插入煙草基因組。擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為1.4 1Λ左右，和預(yù)期推測一致，說明目的基因均已插入這些轉(zhuǎn)基因株系的基因組，野生型煙草基因組PCR產(chǎn)物未出現(xiàn)目標(biāo)條帶 (圖 7A)。為了考察目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總RNA， 反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測A tHsfAld基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA，取植物嫩葉約 0. lg，加入 Iml 的 TRIzoL 提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0. 5ml異丙醇，混勻室溫放置lOmin，4°C離心IOmin (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇Iml清洗，4°C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μ 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測質(zhì)量和濃度。使用Reverse Transcriptase進(jìn)行cDNA的合成，取植物總RNA 約 0. 1 μ g-5 μ g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix 1 μ 1，用 DEPC 處理水補(bǔ)足至 10 μ 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應(yīng)混合物9 μ 1 (5 Xreaction buffer 4 μ l,25mM MgCl2 4μ 1,0. IM DTT 2 μ 1，RNA 酶抑制劑 1 μ 1 )，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫anin，加入1μ 1 M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫20min，然后42°C 保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用Ji他/Wi/基因的上下游引物進(jìn)行RT-PCR分析， 考察轉(zhuǎn)基因煙草中是否有目的基因的轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因煙草植株均有目的基因的轉(zhuǎn)錄物，而野生型的煙草則沒有(圖7B)，說明目的基因AWWi/已在轉(zhuǎn)基因煙草中正常轉(zhuǎn)錄。為了檢測目的基因編碼的蛋白在煙草中是否表達(dá)，選取經(jīng)RT-PCR檢測正確的轉(zhuǎn)基因株系的嫩葉，提取總蛋白進(jìn)行Western分析。一抗為AtHSFAld的鼠抗體。根據(jù)基因的核酸序列推測表達(dá)的蛋白大小約為M kD，Western分析結(jié)果說明檢測到的蛋白質(zhì)條帶大小與理論預(yù)測值相符(圖7C)，說明/編碼的蛋白在煙草中已成功表達(dá)。實(shí)施例7 轉(zhuǎn)基因煙草吸收液體甲醛速率的測定
甲醛可與Nash試劑(醋酸氨15%，冰醋酸0. 3%，乙酰丙酮0. 2%)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有顏色的物質(zhì)，該物質(zhì)的最大吸收波長為410nm，因此可以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)HCHO-Nash標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出反應(yīng)液中甲醛的含量，利用該方法可以測定植物對甲醛的吸收速率。取 1. 5g左右植物材料放入小三角瓶中，加入50ml處理液(HCHO 4mM, KHCO3 5mM, MES 0. 1%)， 處理一定時(shí)間。取出40 μ 1處理液，加水至500 μ L，再加入500 μ L Nash試劑在30°C保溫30分鐘后，測定OD41tl，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出處理液殘存甲醛濃度(圖8)。在4 mM甲醛處理0 h，0. 5 h，2 h，6 h，24 h，48 h和72 h，檢測剩余甲醛的含量，結(jié)果表明，隨著時(shí)間的延長，轉(zhuǎn)基因煙草的剩余甲醛含量比野生型煙草少，這說明轉(zhuǎn)基因煙草吸收液體中甲醛的速率優(yōu)于野生型。實(shí)施例8 轉(zhuǎn)基因煙草對甲醛的抗性檢測
將轉(zhuǎn)基因和野生型煙草無菌苗移入MS固體培養(yǎng)基(甲醛濃度為6 mM)，在25°C持續(xù)光照培養(yǎng)7天后測定煙草的鮮重，結(jié)果表明，在未受到甲醛的脅迫時(shí)，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草都能很好的生長，但是當(dāng)受到甲醛脅迫的時(shí)候，轉(zhuǎn)基因煙草的鮮重高于野生型煙草(圖 9A)，說明轉(zhuǎn)基因煙草對甲醛的抗性好于野生型煙草。對煙草蛋白含量的測定發(fā)現(xiàn)甲醛脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草總蛋白的含量比野生型煙草以及未用甲醛處理的轉(zhuǎn)基因煙草高(圖9B)，這表明擬南芥的過量表達(dá)可能誘導(dǎo)了其他蛋白的高水平表達(dá)。
權(quán)利要求
1.擬南芥熱激因子基因Jiifei^A/的植物表達(dá)載體Vh-HAtHsfAld,所述載體含有擬南芥熱激因子基因的cDNA及卡那霉素篩選標(biāo)記基因K2和組成型啟動(dòng)子CaMV 35S。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物表達(dá)載體，其特征在于基因cDNA來源于擬南芥，GenBank 登錄號為 8405125。
3.權(quán)利要求1所述的擬南芥熱激因子的植物表達(dá)載體在制備吸收和耐受甲醛能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了擬南芥熱激因子AtHsfA1d植物表達(dá)載體及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明用擬南芥熱激因子AtHsfA1d基因的cDNA構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2-35S-AtHsfA1d，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物中，使植物提高對甲醛的吸收和耐受能力，克服植物本身吸收耐受甲醛能力低的缺點(diǎn)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過量表達(dá)AtHsfA1d轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因煙草在含有6mmol/L甲醛的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，鮮重高于野生型煙草，在4mM甲醛處理液中轉(zhuǎn)AtHsfA1d基因煙草的植株甲醛吸收速率高于野生型煙草。
文檔編號C12N15/29GK102363790SQ201110306498
公開日2012年2月29日 申請日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者年洪娟, 張道君, 李昆志, 陳麗梅 申請人:昆明理工大學(xué)