專利名稱：一種豬tlr4基因c1027a堿基突變的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測(cè)方法，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。 用此方法，能快速檢測(cè)到豬TLR4基因的單核苷酸堿基突變，為豬免疫防御系統(tǒng)受體基因分子結(jié)構(gòu)、功能研究提供幫助。
背景技術(shù)：
Toll樣受體(TLRs)作為重要的模式識(shí)別受體，通過對(duì)病原體相關(guān)分子模式 (PAMPs)的識(shí)別及信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫，是機(jī)體抵抗感染的第一道屏障；TLRs基因變異導(dǎo)致宿主對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌的反應(yīng)能力喪失，改變機(jī)體對(duì)病原的抗性或易感性。TLR4在病原微生物跨膜信號(hào)傳導(dǎo)具重要作用，研究已證實(shí)TLR4是機(jī)體對(duì)LPS免疫應(yīng)答的主要受體，敲除該基因的小鼠對(duì)細(xì)菌性病原的刺激應(yīng)答明顯減弱，TLR4基因缺陷小鼠對(duì)病毒的抵抗能力降低。目前有關(guān)豬TLR4基因的SNP檢測(cè)偶見報(bào)道，但基本局限在個(gè)別外顯子的單個(gè)堿基突變。本發(fā)明根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)豬TLR4基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)中外不同品種豬TLR4基因整個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，找尋可能存在的單核苷酸堿基突變，并分析堿基突變導(dǎo)致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為豬Toll樣受體與機(jī)體免疫力的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，為豬抗病育種研究提供基因工程技術(shù)幫助。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供豬TLR4基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，有助于研究豬 TLR4基因的分子結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)體抗病原免疫模式和機(jī)理，為豬疫病防控及抗病育種提供依據(jù)。技術(shù)方案一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測(cè)方法，包括設(shè)計(jì)豬TLR4基因序列特異性擴(kuò)增引物，對(duì)豬模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；分離、純化特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定、比對(duì)，找尋不同檢測(cè)個(gè)體TLR4基因存在的單核苷酸堿基突變，分析基因突變導(dǎo)致的編碼氨基酸及蛋白活性、功能的改變。其特征在于如下步驟步驟一，據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)豬TLR4基因序列設(shè)計(jì)特異引物正義引物5 ‘ -AATGATTTCAGGTGGCAACA-3 ‘反義引物5' -AATGCTTCAGTTTGGTTGTCC-3‘應(yīng)用上述引物對(duì)待檢測(cè)豬模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(12 μ 1) 10XPCR buffer 1· 2 μ l,2mM/L dNTPs 1· 2 μ l,25mM/ L MgCl2O. 8 μ 1, IOpmol/ μ 1 primer 1. 0 μ 1, 5U/ μ 1 Taq polymerase 0. 2 μ 1, 50ng/ μ 1 DNA0. 8 μ 1，ddH20 6. 8 μ 1 ；
反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，;34個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 8min ；其中，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為229bp。步驟二，對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，獲得特異核酸；步驟三，對(duì)分離純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定、比對(duì)分析，得出待檢豬TLR4基因是否存在C1027A單核苷酸堿基突變。有益效果本發(fā)明根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)豬TLR4基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)中外不同品種豬TLR4 基因整個(gè)編碼區(qū)進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，找尋可能存在的單核苷酸堿基突變，并為豬Toll樣受體與機(jī)體免疫力的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，為豬抗病育種研究提供基因工程技術(shù)幫助。本發(fā)明通過研究，確定了檢測(cè)豬TLR4基因編碼區(qū)C1027A堿基突變合適的特異引物SEQ ID N0:l-2，優(yōu)化的PCR擴(kuò)增程序和條件，明確了豬TLR4基因有效的單核苷酸突變堿基及相應(yīng)的編碼氨基酸改變，分析堿基突變導(dǎo)致的編碼氨基酸及蛋白活性、基因功能的改變，為TLR4受體基因遺傳變異導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)及功能變化提供理論依據(jù)，同時(shí)，為TLR4作為免疫模式受體基因發(fā)生變異而引起機(jī)體對(duì)部分傳染性疾病免疫能力的改變等研究提供技術(shù)支持。


圖1 :PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PAGE電泳示例圖2 突變點(diǎn)測(cè)序結(jié)果示例
具體實(shí)施例方式本發(fā)明針對(duì)豬TLR4基因編碼區(qū)的篩查，檢測(cè)到豬該基因存在C1027A單核苷酸堿基突變，引起Gln343Lys編碼氨基酸的改變。針于豬TLR4基因堿基突變的檢測(cè)技術(shù)較多，包括DNA直接測(cè)序、雜交測(cè)序、酶切測(cè)序、DNA芯片技術(shù)、變性高效液相色譜等。較常規(guī)簡(jiǎn)易的實(shí)施方式為1、以GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)豬TLR4基因序列為模板，應(yīng)用生物軟件設(shè)計(jì)特異引物，如 SEQID NO :1_2，要求引物針對(duì)模板序列易擴(kuò)增，特異性好。2、對(duì)PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，檢測(cè)產(chǎn)物濃度和質(zhì)量；應(yīng)用核酸純化試劑盒， 割膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，測(cè)序。3、用核酸分析軟件比對(duì)各樣本產(chǎn)物序列，找尋單核苷酸堿基突變；分析突變性質(zhì)及由此引起的編碼氨基酸、蛋白結(jié)構(gòu)的變化。用于本發(fā)明的測(cè)試樣本沒有特別限制，可以任何含有豬TLR4基因的核酸序列，對(duì)單個(gè)突變位點(diǎn)，甚至可以從血液、組織等樣品抽提DNA樣本直接應(yīng)用。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。本實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例中未注明的具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件進(jìn)行，如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)所述條件或制造廠商建議條件。實(shí)施例1豬TLR4基因cDNA的獲取及引物設(shè)計(jì)
用Trizol Reagent (Invitrogen)提取豬(長(zhǎng)白豬，購(gòu)自江蘇常州康樂農(nóng)牧有限公司豬場(chǎng))總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)核酸濃度及純度；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(ftOmega)及 Oligo (dT) 18 (Promega)反轉(zhuǎn)錄 cDNA ；根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)豬 TLR4 基因序列(AB18830U AJ628065)，用I^rimer 5. O設(shè)計(jì)特異引物，用于PCR擴(kuò)增。引物序列為正義引物5' -AATGATTTCAGGTGGCAACA-3‘ (SEQ ID NO 1)反義引物5' -AATGCTTCAGTTTGGTTGTCC-3‘ (SEQ ID NO 2)實(shí)施例2PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化應(yīng)用SEQ IDNO 1-2對(duì)待檢測(cè)豬模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(12 μ 1) 10XPCR buffer 1· 2 μ l,2mM/L dNTPs 1· 2 μ l,25mM/ L MgCl2O. 8 μ 1, IOpmol/ μ 1 primer 1. O μ 1, 5U/ μ 1 Taqpolymerase 0. 2 μ 1, 50ng/ μ 1 DNA0. 8 μ 1，ddH20 6. 8 μ 1 ；反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 8min ；其中，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為229bp(圖1)。應(yīng)用核酸純化試劑盒，參照廠商提供方案對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化。實(shí)施例3測(cè)序及單核苷酸多態(tài)檢測(cè)對(duì)純化的豬TLR4基因SEQ ID NO 1~2引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，比對(duì)不同樣本 PCR產(chǎn)物測(cè)定序列。結(jié)果，在被檢測(cè)的10頭長(zhǎng)白豬實(shí)驗(yàn)樣本中，TLR4基因cDNA序列第1027 位點(diǎn)表現(xiàn)為7個(gè)C，2個(gè)C/A雜合，1個(gè)A，揭示實(shí)驗(yàn)豬在TLR4基因編碼區(qū)第1027位點(diǎn)存在 C/A單核苷酸堿基突變(圖1、2)。而且，豬TLR4基因1027位點(diǎn)的C1027A堿基突變，直接導(dǎo)致編碼氨基酸出現(xiàn) Gln343Lys改變，氨基酸性質(zhì)隨之發(fā)生變化，造成TLR4基因功能域超螺旋結(jié)構(gòu)的改變，影響 TLR4作為模式識(shí)別受體對(duì)特異病原的免疫應(yīng)答，進(jìn)而表現(xiàn)對(duì)特定疾病具備不同的免疫能力。為豬疫病防控及抗病育種提供依據(jù)，同時(shí)，為豬抗病育種研究提供基因工程技術(shù)幫助。應(yīng)當(dāng)明確，在閱讀本發(fā)明上述講授內(nèi)容后，相同領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作出各種技術(shù)修改，其等價(jià)形式同樣屬于本申請(qǐng)所附權(quán)力要求書限定范圍。
權(quán)利要求
1.一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測(cè)方法，其特征在于如下步驟 步驟一，據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)豬TLR4基因序列設(shè)計(jì)特異引物正義引物 5 ‘ -AATGATTTCAGGTGGCAACA-3 ‘ 反義引物 5 ‘ -AATGCTTCAGTTTGGTTGTCC-3 ‘ 應(yīng)用上述引物對(duì)待檢測(cè)豬模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟二，對(duì)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，獲得特異核酸；步驟三，對(duì)分離純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定、比對(duì)分析，得出待檢豬TLR4基因是否存在C1027A單核苷酸堿基突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系 12μ 1 :10XPCR buffer 1. 2μ l,2mM/L dNTPs 1. 2μ l,25mM/ L MgCl2O. 8 μ 1, IOpmol/ μ 1 primer 1. 0 μ 1, 5U/ μ ITaq polymerase 0. 2 μ 1, 50ng/ μ 1 DNA0. 8 μ 1，ddH20 6. 8 μ 1 ；反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，34個(gè)循環(huán)； 72°C 延伸 8min ；其中，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為229bp。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬TLR4基因C1027A堿基突變的檢測(cè)方法，屬基因工程技術(shù)領(lǐng)域。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)豬TLR4基因序列設(shè)計(jì)特異引物，對(duì)待檢測(cè)豬模板cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；分離、純化擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得特異核酸；對(duì)分離純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，比對(duì)分析后確定擴(kuò)增序列是否存在C1027A單核苷酸突變。本發(fā)明可用于豬TLR4基因單核苷酸堿基突變的檢測(cè)，對(duì)判定機(jī)體免疫模式識(shí)別改變有很大幫助，為豬疫病防控及抗病育種提供依據(jù)，同時(shí)，為豬抗病育種研究提供基因工程技術(shù)幫助。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102417928SQ20111030685
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月10日
發(fā)明者任守文, 劉筱, 孟翠, 方曉敏, 李碧俠, 王學(xué)敏 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院