專利名稱：一種與百草枯抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與百草枯抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
擬南芥(Arabidopsis thaliana)是典型的十字花科植物，廣泛分布于歐洲、亞洲和北美，擬南芥是植物科學(xué)研究的優(yōu)良的模式植物。從擬南芥研究中得到的成果大都在農(nóng)作物中有著良好的應(yīng)用。百草枯(paraquat，簡(jiǎn)寫為PQ)，學(xué)名甲基紫精，是一種非選擇性的四胺除草劑，是目前世界上應(yīng)用廣泛的一種除草劑。它通過(guò)奪取光合過(guò)程中的PS I系統(tǒng)的電子，然后將電子傳遞給氧氣產(chǎn)生超氧分子。不同的植物對(duì)于該除草劑具有不同程度的耐受性，而這種耐受性的機(jī)理至今仍不清楚，研究植物對(duì)于該除草劑的耐受機(jī)理具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種與百草枯抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物百草枯抗性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。序列表中的序列2由1454個(gè)氨基酸殘基組成。編碼所述蛋白的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述基因如下(1)-(5)中任意一種的DNA分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)序列表中序列1自5，末端第35-4399位所示的DNA分子；(3)序列表中序列1自5，末端第35-4398位所示的DNA分子；(4)在嚴(yán)格條件下與⑴或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼與植物百草枯抗性相關(guān)蛋白的DNA分子；(5)與(1)或⑵或(3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85 %、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96 %、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物百草枯抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中的序列1由4557個(gè)核苷酸組成。含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。 所述重組載體是將所述蛋白的編碼基因插入pCB2008E載體的XhoI和BamHI酶切位點(diǎn)間，得到表達(dá)所述蛋白的重組載體。所述的蛋白、所述基因、所述的重組載體、所述表達(dá)盒、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌在植物抗百草枯和/或培育抗百草枯植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述應(yīng)用為將所述的蛋白的編碼基因?qū)胗捎谒龅鞍椎木幋a基因表達(dá)降低而表現(xiàn)為抗百草枯的植物突變體中，得到表現(xiàn)為對(duì)百草枯敏感的目的植物。所述抗百草枯的植物突變體為Salk_067836 ；所述目的植物為野生型擬南芥。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中所述蛋白編碼基因的表達(dá)，得到百草枯抗性高于所述目的植物的植物。所述百草枯抗性高于所述目的植物的植物體現(xiàn)在如下1)或2):1)所述植物的存活率高于所述目的植物；2)所述植物體內(nèi)的百草枯含量低于所述目的植物。所述方法在百草枯的脅迫下進(jìn)行；所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。攜帶有本發(fā)明PQT24-1的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、玉米等單子葉植物，也可以是擬南芥、大豆、油菜、棉花等雙子葉植物。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新基因PQT24，在敲出該基因的突變體 Salk_067836中進(jìn)行功能互補(bǔ)，突變體表型回復(fù)至野生型(即對(duì)百草枯敏感)。用同位素 C14標(biāo)記的百草枯吸收實(shí)驗(yàn)顯示突變體對(duì)于百草枯的吸收比野生型減少。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明該蛋白定位在質(zhì)膜上，因此該蛋白是一個(gè)運(yùn)輸百草枯進(jìn)入植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，不但在闡明農(nóng)作物對(duì)于百草枯的耐受性機(jī)理中有著重要意義，而且可能直接應(yīng)用于農(nóng)作物耐白葉枯除草劑的遺傳改良。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為6 μ M百草枯初篩得到的耐氧化突變體苗pqt24_l圖2為含2 μ M百草枯的MS培養(yǎng)基上pqt24_l和野生型(WT)的生長(zhǎng)差異圖3為Fl代的除草劑抗性檢測(cè)圖4為Salk_067836及pqt24_l插入位點(diǎn)示意圖及RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖5為Salk_067836對(duì)百草枯的抗性檢測(cè)圖 6 為擴(kuò)增 PQT24cDNA 及酶切鑒定 pCB2008E/PQT24
圖 7 為 pCB2008E/PQT24 載體8為PQT24蛋白定位圖9為敲出突變體Salk_067836的功能互補(bǔ)
圖10為同位素14C標(biāo)記百草枯吸收實(shí)驗(yàn)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、pqt24_l突變體的獲得和研究一、pqt24_l突變體的獲得中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室用包含四個(gè)花椰菜病毒CaMV 35S增強(qiáng)子的T-DNA隨機(jī)插入擬南芥基因組，得到一個(gè)T-DNA轉(zhuǎn)基因的突變體庫(kù)，共計(jì)55，000個(gè)單株。該突變體庫(kù)理論上包括可能被四個(gè)增強(qiáng)子超量表達(dá)的一個(gè)或幾個(gè)基因的功能獲得型突變體，也包括由于T-DNA的插入某個(gè)基因?qū)е略摶虮黄茐亩纬傻墓δ苋笔屯蛔凅w。 用含有6μ M百草枯的MS (Murashige and Skoog)培養(yǎng)基(含1 %蔗糖，1 %瓊脂粉，pH值 5.8，高溫蒸汽滅菌11分鐘，冷卻至約55°C時(shí)加入過(guò)濾滅菌的百草枯)作為篩選條件。在該條件下，絕大部分種子萌發(fā)后被漂白死亡，極少出現(xiàn)的萌發(fā)后可以正常生長(zhǎng)的幼苗就是需要的突變體。經(jīng)過(guò)幾次篩選，得到了若干棵耐百草枯的突變體。突變體后期被移到正常的生長(zhǎng)條件下讓其完成整個(gè)生命過(guò)程，得到其種子。將上述得到的種子，用10%藍(lán)月亮漂漬液在室溫下滅菌10分鐘，滅菌水沖洗4-5 遍后，4°C下避光放置2天，以使種子發(fā)芽一致。然后將種子播種于含有2 μ M百草枯MS培養(yǎng)基(含蔗糖，瓊脂粉，PH值5. 8，高溫蒸汽滅菌11分鐘，冷卻至約55°C時(shí)加入過(guò)濾滅菌百草枯)，進(jìn)行復(fù)篩。經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩得到耐百草枯的突變體，其中一個(gè)被命名為 pqt24-l (pqt :paraquat tolerance), JALIU 1 禾口圖 2。二、突變體的遺傳分析pqt24-l和哥倫比亞型野生型幼苗在土中生長(zhǎng)至開(kāi)花，以野生型作為母本突變體作為父本進(jìn)行雜交，得到Fl代種子。用同樣的方法洗種子，在2 μ M百草枯的MS培養(yǎng)基 (含蔗糖，瓊脂粉，PH值5. 8，高溫蒸汽滅菌11分鐘，冷卻至約55°C時(shí)加入過(guò)濾滅菌百草枯)上同時(shí)將pqt24_l、野生型(WT)和Fl代種子在22°C的光照培養(yǎng)下生長(zhǎng)約10天， pqt24_l可以正常生長(zhǎng)，F(xiàn)l代和野生型萌發(fā)后漂白死亡(圖3)。Fl代的植株自交后產(chǎn)生的 F2代種子，取50粒種子用同樣的方法檢測(cè)，其在含2 μ M百草枯的MS培養(yǎng)基上存活與漂白的比例為1 3。以上遺傳分析實(shí)驗(yàn)顯示pqt24_l突變體是由單個(gè)隱性核基因突變引起的。三、pqt24-l突變體T-DNA插入位點(diǎn)檢測(cè)TAIL (thermal asymmetric interlaced) PCR ^ M hk YAC (yeast artificial chromosome)和Pl克隆中鑒定插入末端序列的一種有效的技術(shù)。Liu和Whittier在1995 年將此種方法改進(jìn)，用于檢測(cè)擬南芥中T-DNA插入位點(diǎn)左右邊界的基因組DNA序列(Liu and ffhittier, 1995)。本實(shí)驗(yàn)室用此方法檢測(cè)了耐氧化突變體pqt24_l的T-DNA插入位點(diǎn) T-DNA插入在基因Atlg66950第13個(gè)外顯子中?；駻tlg66950包括20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子，編碼1455個(gè)氨基酸長(zhǎng)的一個(gè)PDR5相似蛋白。TAIL-PCR所用引物為SPl5 '-ATACGACGGATCGTAATTTGTC-3 ‘
SP25' -TAATAATAACGCTGCGGACATCAT-3 ‘
SP35 '-TTGACCATCATACTCATTGCTG-3 ‘
AD15，-NTCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3 ‘
AD25，-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3 ‘
AD35' -(A/T)GTGNAG( A/T) ANC ANAGA-3 ‘具體操作過(guò)程如下在三個(gè)反應(yīng)體系中，各取1 μ 1基因組DNA作為第一輪PCR擴(kuò)增的模板，按表1中第一輪的體系組成分別加入SPl和不同簡(jiǎn)并度的簡(jiǎn)并引物AD1、AD2或AD3，按表2中第一輪的擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第一輪擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物按照1 50稀釋后取1 μ 1作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，按表1中第二輪的體系組成分別加入SP2和不同簡(jiǎn)并度的簡(jiǎn)并引物 AD1、AD2或AD3，按表2中第二輪的擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第二輪擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物按照 1 10稀釋后取 μ 作為第三輪PCR擴(kuò)增的模板，按表1中第三輪的體系組成分別加入 SP3和不同簡(jiǎn)并度的簡(jiǎn)并引物AD1、AD2或AD3，按表2中第三輪的擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 第三輪擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用0.8%凝膠電泳分離得到的不同大小的片段全部切膠回收并以SP3作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與擬南芥全基因序列進(jìn)行比對(duì)確定插入位點(diǎn)。表1為TAIL-PCR體系組成
權(quán)利要求
1.一種蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物百草枯抗性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下(1)_(5)中任意一種的DNA 分子(1)序列表中序列1所示的DNA分子；(2)序列表中序列1自5，末端第35-4399位所示的DNA分子；(3)序列表中序列1自5，末端第35-4398位所示的DNA分子；(4)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列雜交且編碼與植物百草枯抗性相關(guān)蛋白的DNA分子；(5)與⑴或⑵或(3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且編碼與植物百草枯抗性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因插入PCB2008E載體中，得到表達(dá)所述蛋白的重組載體。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求2或3所述基因、權(quán)利要求4所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在植物抗百草枯和/或培育抗百草枯植物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1所述的蛋白的編碼基因?qū)胗捎跈?quán)利要求1所述的蛋白的編碼基因表達(dá)降低而表現(xiàn)為抗百草枯的植物突變體中，得到表現(xiàn)為對(duì)百草枯敏感的目的植物。
8.一種培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中權(quán)利要求1所述蛋白編碼基因的表達(dá)，得到百草枯抗性高于所述目的植物的植物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述百草枯抗性高于所述目的植物的植物體現(xiàn)在如下1)或2)1)所述植物的存活率高于所述目的植物；2)所述植物體內(nèi)的百草枯含量低于所述目的植物。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述方法在百草枯的脅迫下進(jìn)行；所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種與百草枯抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物百草枯抗性相關(guān)的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)新基因PQT24，在敲出突變體Salk_067836中表達(dá)進(jìn)行功能互補(bǔ)，可是突變體表型回復(fù)至野生型(即對(duì)百草枯敏感)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102329384SQ201110309668
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者向成斌, 席靜, 徐萍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)