專利名稱：一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于嗜酸乳桿菌制品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法。
背景技術(shù)：
嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)屬乳桿菌科中的乳桿菌屬，形態(tài)呈細(xì)長桿狀，細(xì)胞大小一般為0. 6 0. 9*1. 5 6. 0 μ m，成單、成雙或者2_3個(gè)成短鏈排列。無鞭毛，不運(yùn)動，革蘭氏染色陽性，兼性厭氧，天然地存在于人和動物的胃腸道，人的口腔、陰道及傳統(tǒng)的發(fā)酵乳中。最適生長溫度為35°C 38°C，20°C以下不生長，最高生長溫度43°C 48°C，耐熱性差，能利用葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖進(jìn)行同型發(fā)酵產(chǎn)生DL型乳酸。嗜酸乳桿菌是乳制品及其制劑中常用的益生菌之一，其具有緩解乳糖不耐癥及腸易激綜合癥，預(yù)防腹瀉或便秘，調(diào)解人體腸道菌群平衡，降低血膽固醇，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，抑制腫瘤產(chǎn)生等功能，目前已廣泛用于功能性乳制品、保健食品及微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的生產(chǎn)，因此制備雙歧桿菌菌粉做為發(fā)酵劑或者保健食品的原料很有必要。目前嗜酸乳桿菌菌粉的制備主要采用真空冷凍干燥方法，但在冷凍干燥過程中， 嗜酸乳桿菌要經(jīng)受冷凍和干燥兩種激烈因素的作用，導(dǎo)致菌體死亡。目前國內(nèi)對嗜酸乳桿菌凍干菌粉的研究主要集中在制備過程中凍干保護(hù)劑的篩選方面，并獲得了各種凍干保護(hù)劑配方，但沒有通過亞致死處理提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，該方法可解決嗜酸乳桿菌在凍干過程中存在的凍干存活率低，活菌數(shù)少的問題。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案將嗜酸乳桿菌在MRS肉湯中于37°C培養(yǎng)18h，終止培養(yǎng)后對嗜酸乳桿菌進(jìn)行亞致死處理，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C、7000rpm離心10-15min，棄去上清液得嗜酸乳桿菌菌泥，在嗜酸乳桿菌菌泥中加入菌泥質(zhì)量的10-20%脫脂乳和菌泥質(zhì)量80-90%、pH6. 8的磷酸緩沖液后在-40°C下預(yù)凍8-12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中于溫度-50-60°C，真空度為 4-6Pa下凍干18-24h，即得嗜酸乳桿菌菌粉。所述脫脂乳和磷酸緩沖液的總質(zhì)量與嗜酸乳桿菌菌泥的質(zhì)量相等。所述亞致死處理是指冷休克。所述冷休克是指將嗜酸乳桿菌在8-10°C靜置0. 5-1. 5h。
所述亞致死處理是指熱休克。所述熱休克是指將嗜酸乳桿菌在38-42°C靜置lh。所述亞致死處理是指酸休克。所述酸休克是指用硫酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH為4. 0-5. 5后使嗜酸乳桿菌于5_8°C靜置 30mino
本發(fā)明所述提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法將嗜酸乳桿菌先經(jīng)亞致死處理，使嗜酸乳桿菌在逆境中誘導(dǎo)合成冷休克蛋白、熱休克蛋白或改變細(xì)胞膜脂肪酸組成，從而提高嗜酸乳桿菌在后續(xù)凍干過程中的抵抗力，提高凍干存活率及菌粉活菌數(shù)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的將嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液先經(jīng)冷休克、熱休克或酸休克處理， 使嗜酸乳桿菌在逆境中誘導(dǎo)合成冷休克蛋白、熱休克蛋白或改變細(xì)胞膜脂肪酸組成，從而提高嗜酸乳桿菌在后續(xù)凍干過程中的抵抗力，提高凍干存活率及菌粉活菌數(shù)。具體方法如下(1)首先將嗜酸乳桿菌在MRS肉湯中37°C培養(yǎng)18h，然后終止培養(yǎng)，并將培養(yǎng)液在 8-10°C靜置0. 5-1. 5h，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心10min-15min，棄去上清液， 獲得嗜酸乳桿菌菌泥，在菌泥加入脫脂乳和磷酸緩沖液后在-40°C下預(yù)凍8-12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，在溫度-50-60°C，真空度為4-6Pa下凍干18_24h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。(2)首先將嗜酸乳桿菌在MRS肉湯中37°C培養(yǎng)18h，然后終止培養(yǎng)，并將培養(yǎng)液在38-42°C靜置lh，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，在菌泥加入脫脂乳和磷酸緩沖液后在-40°C下預(yù)凍8-12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，在溫度-50-60°C，真空度為4-6Pa下凍干18_24h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。(3)首先將嗜酸乳桿菌在MRS肉湯中37°C培養(yǎng)18h，然后用硫酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)至 4. 0-5. 5，5-8°C靜置30min，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，在菌泥加入脫脂乳和磷酸緩沖液在-40°C下預(yù)凍8-12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，在溫度-50-60°C，真空度為4-6Pa下凍干18_24h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。實(shí)施例1-1將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液在9°C靜置l.Oh，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C， 7000rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量20% (W/ W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量80% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍8h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，4-6Pa、-50°C下凍干24h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉，其凍干存活率為70.45% (對照組為46. 11% )，活菌數(shù)為2. 1 X lO^cfu/g ((對照組為 1. 10X10ncfu/g)) ο實(shí)施例1-2將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液在8°C靜置0. 5h，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C， 7000rpm離心15min，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量10% (W/ W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量90% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍 12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，6Pa、-60°C下凍干21h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。實(shí)施例1-3將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液在10°C靜置1. 5h，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心llmin，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量16% (W/ W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量84% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍 llh，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，4Pa、-52°C下凍干18h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。實(shí)施例2-1將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液在39°C靜置1. 0h，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C， 7000rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量15% (W/ W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量85% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍 12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，4-6Pa、-50°C下凍干20h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉，其凍干存活率為84. 25% (對照組為49. 64% ),活菌數(shù)為2. 61 X lO^cfu/g(對照組為 1. 13X10ncfu/g)。實(shí)施例2-2將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液在38°C靜置1. Oh，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C， 7000rpm離心13min，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量20% (W/ W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量80% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍 9h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，6Pa、-52°C下凍干18h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。實(shí)施例2-3將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后將培養(yǎng)液在42°C靜置1. 0h，取樣測活菌數(shù)，然后在4°C， 7000rpm離心15min，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量10% (W/ W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量90% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍 8h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，4Pa、-60°C下凍干24h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。實(shí)施例3-1將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后用2mol/L的硫酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)至4.5，5°C靜置 30min,取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心lOmin，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥， 稱重菌泥，加入菌泥重量10% (W/W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量90% (W/W)的PH6.8的磷酸緩沖液，然后在_40°C下預(yù)凍10h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，4-6Pa、-60°C下凍干22h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉，其凍干存活率為87. 22% (對照為49. 64% )，活菌數(shù)為 4. 09 X IO11CfVg (對照組為 1. 07 X 10ncfu/g)。實(shí)施例3-2將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后用2mol/L的硫酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)至4. 0，7°C靜置30min， 取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心12min，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量14% (W/W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量86% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍8h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，4Pa、-50°C下凍干24h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。實(shí)施例3-3
將MRS肉湯在118°C下滅菌15min，冷卻至室溫，然后按4% (V/V)接種量接入嗜酸乳桿菌，37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后用2mol/L的硫酸將培養(yǎng)液的pH調(diào)至5. 5，8°C靜置30min， 取樣測活菌數(shù)，然后在4°C，7000rpm離心15min，棄去上清液，獲得嗜酸乳桿菌菌泥，稱重菌泥，加入菌泥重量20% (W/W)的脫脂乳粉，再加入菌泥重量80% (W/W)的pH6.8的磷酸緩沖液，然后在-40°C下預(yù)凍12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行凍干，6Pa、-53°C下凍干18h，即可獲得嗜酸乳桿菌菌粉。上述實(shí)施例中，對照組指其它條件完全相同，只是沒有經(jīng)過亞致死處理。
權(quán)利要求
1.一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于包括以下步驟將嗜酸乳桿菌在MRS肉湯中于37°C培養(yǎng)18h，終止培養(yǎng)后對嗜酸乳桿菌進(jìn)行亞致死處理，然后在4°C、7000rpm離心10-15min，棄去上清液得嗜酸乳桿菌菌泥，在嗜酸乳桿菌菌泥中加入菌泥質(zhì)量的10-20%脫脂乳和菌泥質(zhì)量80-90%、pH6. 8的磷酸緩沖液后在_40°C下預(yù)凍8-12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中于溫度-50-60°C，真空度為4-6Pa下凍干18_24h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述脫脂乳和磷酸緩沖液的總質(zhì)量與嗜酸乳桿菌菌泥的質(zhì)量相等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述亞致死處理是指冷休克。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述冷休克是指將嗜酸乳桿菌在8-10°C靜置0. 5-1. 5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述亞致死處理是指熱休克。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述熱休克是指將嗜酸乳桿菌在38-42°C靜置lh。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述亞致死處理是指酸休克。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法，其特征在于所述酸休克是指用硫酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的PH為4. 0-5. 5后使嗜酸乳桿菌于5-8°C靜置30min。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法將嗜酸乳桿菌于37℃培養(yǎng)18h后對嗜酸乳桿菌進(jìn)行亞致死處理，然后在4℃、700)0rpm離心10-15min，在嗜酸乳桿菌菌泥中加入菌泥質(zhì)量的脫脂乳和磷酸緩沖液后在-40℃下預(yù)凍8-12h，然后置于冷凍干燥機(jī)中于溫度-50～-60℃，真空度為4-6Pa下凍干18-24h，即得嗜酸乳桿菌菌粉。本發(fā)明所述提高嗜酸乳桿菌凍干存活率的方法將嗜酸乳桿菌培養(yǎng)液先經(jīng)冷休克、熱休克或酸休克處理，使嗜酸乳桿菌在逆境中誘導(dǎo)合成冷休克蛋白、熱休克蛋白或改變細(xì)胞膜脂肪酸組成，從而提高嗜酸乳桿菌在后續(xù)凍干過程中的抵抗力，提高凍干存活率及菌粉活菌數(shù)。
文檔編號C12N1/04GK102329759SQ201110310289
公開日2012年1月25日 申請日期2011年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月13日
發(fā)明者張華 , 張強(qiáng), 王娟, 秦濤, 舒國偉, 陳合, 馬齊 申請人:陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院