專利名稱：一種用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物，可用于對(duì)土壤樣品中金龜子綠僵菌的分子檢測(cè)。
背景技術(shù)：
金龜子綠僵菌(Metarkizium anisopliae)屬真菌門、半知菌類、叢梗菌目、叢梗霉科、綠僵菌屬，其寄主范圍廣、致病力強(qiáng)，是世界上第一個(gè)大量生產(chǎn)并用于田間防治的昆蟲病原真菌。早在1879年，俄國(guó)人MetschnikofT就成功利用金龜子綠僵菌防治奧地利金龜子和甜菜象甲，其后100多年人們?cè)诶镁G僵菌控制害蟲方面進(jìn)行了大量的努力。目前，綠僵菌生物制劑已被世界糧農(nóng)組織(FAO)推薦為環(huán)保產(chǎn)品，在非洲和澳洲以及中國(guó)大面積推廣應(yīng)用于害蟲的生物防治。作為真菌微生物，綠僵菌的防效與其在田間土壤中的存活有很大關(guān)系。土壤中綠僵菌的種類與數(shù)量檢測(cè)是評(píng)價(jià)綠僵菌土壤存活能力的重要內(nèi)容，傳統(tǒng)方法依賴選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)或大蠟螟誘集法，但是這兩種方法耗時(shí)費(fèi)力。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，基于PCR的分子檢測(cè)技術(shù)已在農(nóng)業(yè)微生物研究中應(yīng)用越來(lái)越普遍。PCR技術(shù)可對(duì)土壤中綠僵菌種類、數(shù)量和分布進(jìn)行有效檢測(cè)，研究結(jié)果將極大地促進(jìn)該蟲生真菌在害蟲綜合防治體系中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物從土壤樣品DNA中擴(kuò)增出金龜子綠僵菌靶標(biāo)序列的問(wèn)題，而提供一種用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物。本發(fā)明用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物為正向引物5，-CGGCTGTGCTGGAAAACC A-3，，反向引物 5 ’ -ATTGCGCCCGTCAGTATTCT-3，。將本發(fā)明所用弓 I物對(duì)命名為qMetF/MetR。本發(fā)明的引物是根據(jù)真菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物qMetF/MetR可從各類樣品DNA中直接擴(kuò)增出長(zhǎng)度為113bp的金龜子綠僵菌目的片段。


圖1為實(shí)施例1中qMetF/MetR弓丨物對(duì)5屬6種真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。圖2為實(shí)施例2中qMetF/MetR弓丨物對(duì)土壤樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1分別以金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)、黃綠綠僵菌(Metarhiziumflavoviride)> 球抱白僵菌(Beauveria bassiana)、玫煙擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、尖鍵抱菌(Fusarium oxysporum)和鏈格抱菌(Alternaria alternata) 5個(gè)屬真菌DNA為模板進(jìn)行引物qMetF/MetR的特異性驗(yàn)證試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增體系為25 μ L由O. 5 μ L DNA模板(約IOng)、0. 5 μ L正向引物qMetF(lOyM)、0· 5 μ L反向引物 qMetR(10 μ L)、0· 5μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5μ L 10XPCRbuffer (with MgC12) ,0. 2μ I TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足 25 μ L。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 3min，變性94°C 30s，退火58°C 30s，延伸72°C 30s，共35個(gè)循環(huán)，72 °C延伸5min，4°C保存。將本實(shí)施方式擴(kuò)增出的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，圖1中M泳道為DNA marker BM2000,1-6號(hào)泳道分別為含有金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、黃綠綠僵菌(Metarhizium flavoviride)> 球抱白僵菌(Beauveriabassiana)、玫煙擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、尖鍵抱菌(Fusarium oxysporum)和鏈格孢菌(Alternaria alternata)DNA的擴(kuò)增結(jié)果,7號(hào)泳道為不含DNA空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。從圖1中可以看出本實(shí)施方式用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物qMetF/MetR能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出金龜子綠僵菌的靶標(biāo)序列片段，而未能從近緣真菌DNA和空白對(duì)照中擴(kuò)增出核酸片段。將I號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的序列片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為序列長(zhǎng)度為113bp,并且經(jīng)blast分析,為金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)的特異序列。實(shí)施例2應(yīng)用引物qMetF/MetR對(duì)5份土樣(采自河北廊坊市)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增體系為:25yL 由 0.5yL DNA 模板(約 IOng)、0· 5 μ L 正向引物 qMetF(10 μ Μ)、0· 5 μ L反向引物 qMetR(10yM)、0.5yL dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L 10XPCR buffer (with MgCl2)、0. 2μ I TaqDNA聚合酶(5U/ μ L)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μ LICR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C3min，變性 94°C 30s，退火 58°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 5min，4°C保存。將本實(shí)施方式擴(kuò)增出的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，圖2中M泳道為DNA marker BM2000,1-5號(hào)泳道分別為河北廊坊市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，6號(hào)泳道為不含DNA空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。從圖2中可以看出本實(shí)施方式用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物qMetF/MetR能夠準(zhǔn)確的從所有土壤樣品DNA中擴(kuò)增出金龜子綠僵菌的靶標(biāo)序列片段。隨機(jī)挑選I和3號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的序列片段分別與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為序列長(zhǎng)度為113bp，并且經(jīng)blast分析，為金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的特異序列。
序列表核苷酸序列表
<110>謝明
<120> 一種用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> I<211> 19<212> DNA
<213> Metarhizium anisopliae<400> I
cggctgtgct ggaaaacca19
<210> 2<211> 20<212> DNA
<213〉Metarhizium anisopliae<400> 2
attgcgcccg tcagtattct 20
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物，其特征在于用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物為正向引物 qMetF :5’ -CGGCTGTGCTGGAAAACCA-3’反向引物 qMetR :5’ -ATTGCGCCCGTCAGTATTCT-3’。
全文摘要
一種用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物，它涉及一對(duì)用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物。本發(fā)明解決了目前缺乏引物從土壤樣品DNA中擴(kuò)增出金龜子綠僵菌靶標(biāo)序列的問(wèn)題。本發(fā)明用于擴(kuò)增金龜子綠僵菌的特異性引物為qMetF(5’-CGGCTGTGCTGGAAAACCA-3’)和qMetR(5’-ATTGCGCCCGTCAGTATTCT-3’)。本發(fā)明的引物能夠準(zhǔn)確擴(kuò)增出金龜子綠僵菌目的片段。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103045587SQ20111031059
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者謝明, 張艷軍 申請(qǐng)人:謝明