專利名稱：紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因，還涉及由該基因編碼的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，同時(shí)還涉及一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因及其編碼的蛋白和含有該基因的表達(dá)載體及細(xì)胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿是我國乃至世界上最重要的豆科牧草，被譽(yù)為“牧草之王”。紫花苜蓿在中國西北地區(qū)種植較多，而西北地區(qū)干旱、少雨的氣候特點(diǎn)，對(duì)作物的正常生長發(fā)育非常不利，嚴(yán)重制約了農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。因此，深入研究紫花苜蓿的抗旱性，對(duì)于克服該地區(qū)干旱、風(fēng)蝕等自然條件對(duì)苜蓿栽培的制約，擴(kuò)大其種植范圍，提高生產(chǎn)力，具有舉足輕重的意義。在過去的幾十年里對(duì)紫花苜蓿的抗旱性研究逐步從抗旱性的鑒定方面的研究轉(zhuǎn)移到提高紫花苜蓿自身抗旱性的研究上來，尤其在近幾年或是近十幾年中的研究，紫花苜蓿的抗旱性育種以及品種改良方面的研究工作尤為突出。目前最為有效的和常用的方法還是傳統(tǒng)的輪回選擇法，即通過在原始群體中選株產(chǎn)生后代，對(duì)后代進(jìn)行鑒定，再用優(yōu)良的后代重組形成新的群體以提高群體的平均表現(xiàn)。然后可以利用系譜法對(duì)新的群體選擇自交系。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物技術(shù)在育種中得到了廣泛地應(yīng)用。但與其他作物(如玉米、高粱等)中的研究相比，在紫花苜?？购涤N中的研究還相對(duì)較少。因此，紫花苜蓿抗旱相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制還有待于進(jìn)一歩的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對(duì)紫花苜蓿抗旱相關(guān)的分子生物學(xué)機(jī)制的研究，一方面提供了紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因及該基因編碼的蛋白，另ー方面還提供了含有所述紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，以及培育抗旱紫花苜蓿的方法，還提供了它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因，其中，該基因具有SEQ IDNo 1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了ー種表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體含有本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因。本發(fā)明還提供了ー種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因。本發(fā)明還提供了一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將本發(fā)明提供的紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜?xì)胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達(dá)載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)在紫花苜蓿中被干旱逆境誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而本發(fā)明的發(fā)明人通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因(bZIP)導(dǎo)入到紫花苜蓿中，結(jié)果表明紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表達(dá)可以顯著增強(qiáng)紫花苜蓿的抗旱性能。本發(fā)明從紫花苜蓿中克隆的抗旱基因?yàn)橹饕r(nóng)作物(特別是紫花苜蓿)的抗旱研究提供了基因資源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中將發(fā)揮重要作用。


圖1顯示了 bZIP基因(SEQ ID NO 1)的實(shí)時(shí)定量PCR的分析結(jié)果，結(jié)果顯示bZIP基因的表達(dá)水平能夠被干旱脅迫所誘導(dǎo)提高。圖2顯示了實(shí)施例2中進(jìn)行細(xì)胞定位所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302載體的結(jié)構(gòu)。圖3為將不含有目的bZIP基因的空表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞中，觀察到的亞細(xì)胞定位圖。圖4為將含有ZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞中，觀察到的亞細(xì)胞定位圖。 圖5顯示了實(shí)施例3中對(duì)紫花苜蓿植株進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的bZIP基因轉(zhuǎn)化所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302載體的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了一種由紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，該蛋白具有SEQ ID No 2所不的氣基酸序列。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)，其中，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)是發(fā)明人通過構(gòu)建紫花苜蓿干旱脅迫下特異表達(dá)的cDNA文庫，并從該cDNA文庫中篩選得到的。所述cDNA文庫的構(gòu)建方法包括利用30% (w/v)PEG8000對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa L. cv.保定苜蓿，北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)進(jìn)行模擬干旱處理12個(gè)小時(shí)，收獲植株，放于_80°C作為實(shí)驗(yàn)組。沒有經(jīng)過干旱處理的植株為對(duì)照組。利用PCR-Selected cDNA Subtraction Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA)構(gòu)建了紫花苜蓿干旱脅迫下特異表達(dá)的cDNA文庫。在文庫的構(gòu)建過程中，獲得了 525個(gè)單菌落并全部進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過去除載體序列和冗余序列，最終獲得了 130條EST序列。這些序列的大小從250bp到lOOObp。其中，長度為567bp的EST序列引起了實(shí)驗(yàn)者的關(guān)注，并對(duì)利用SMARTer RACE cDNA AmplificationKit(Clontech，USA)分別對(duì)該EST序列進(jìn)行了 5’ RACE和3’ RACE克隆，最后獲得了該基因全長序列(SEQ IDNO :2)。其中，基因克隆的方法為分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作，具體方法如下A.準(zhǔn)備基本液體2· Ομ I 5Χ 第一鏈緩沖液，1·0μ I DTT (20mM),1. O μ IdNTPMix(IOmM)；B.制備用于 5’ RACE 的 cDNA:2.75yl RNA,1. O μ I 5’ -CDS 弓丨物A (ACGCGACGGTTTCAACATCCCTCTC)；制備用于3’ RACE 的 cDNA:3.75yl RNA,1. O μ I 3’ -CDS 弓丨物A(GAGCTGATGCTGTGGCTGCTGGTTG)；C.將準(zhǔn)備好的液體放于72°C 3分鐘，再放于42°C冷卻2分鐘。D.向 B 中 5’ RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo。E.制備5’ RACE和3’ RACE的cDNA反應(yīng)液4. O μ I的步驟A得到的緩沖液，0. 25 μ IRNA 酶抑制劑(40U/ μ I)，1. O μ I SMARTScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶(100U)。F.將步驟E中的液體加入到步驟C中，完成3’ RACE的cDNA合成反應(yīng)液的制備；將步驟E中的液體加入到步驟D中，完成5’ RACE的cDNA合成反應(yīng)液的制備。G.將制備好的反應(yīng)液放于42°C中90分鐘，最后70°C中10分鐘，完成cDNA的合成。其中，3’ RACE反應(yīng)體系為94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分鐘，共30個(gè)循環(huán)。5’ RACE反應(yīng)體系為94°C 30秒，65°C 30秒，72°C 3分鐘，共40個(gè)循環(huán)。
`
取PCR產(chǎn)物于1. O (W/V) %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，回收目的條帶，連接回收產(chǎn)物與PEGM T-Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該基因具有SEQ ID =No 1所示的核苷酸序列(1781bp)。本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，其中，該表達(dá)載體含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明提供的基因可以通過現(xiàn)有的方法構(gòu)建到表達(dá)載體中，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物選擇性標(biāo)記(如BAR基因、GUS基因、熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(如潮霉素、卡那霉素等)。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述細(xì)胞可以為單子葉植物的細(xì)胞，也可以為雙子葉植物的細(xì)胞，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄或苜蓿等的細(xì)胞。優(yōu)選為苜蓿細(xì)胞，更優(yōu)選為紫花苜蓿細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將具有SEQ IDNo 1所示的核苷酸的基導(dǎo)入到紫花苜蓿細(xì)胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)本發(fā)明所述將有本發(fā)明提供的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜?xì)胞中的方法為基因工程領(lǐng)域常規(guī)的方法，例如可以通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，之后將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞培育成植株。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達(dá)載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述植物為紫花苜蓿。實(shí)施例1bZIP基因的實(shí)時(shí)定量PCR分析為了進(jìn)一步研究從抑制差減雜交文庫中獲得的bZIP基因(SEQ ID NO :1所示的基因)的表達(dá)情況，利用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行了分析，具體步驟如下以50天大小的紫花苜猜植株(Medicago sativa L. cv.保定苜猜，北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)為實(shí)驗(yàn)材料，分別用30% (w/v)PEG 8000處理0、15、30分鐘和1、6、12、24小時(shí)，提取總RNA。5μ g的總RNA被用于第一鏈cDNA的制備，具體步驟如下首先加入 O. 5 μ I 50 μ M oligo (dT) (Invitrogen) > I μ I IOmM dNTP Mix 和 5 μ IDEPC-treated water,65°C熱激5分鐘，放于冰上冷卻I分鐘；其次，加入4 μ I 5XFirstStrand Buffer>2 μ I 0.1M dithiothreitol(DTT)、I μ I 40U/μ I RNaseOUT(Invitrogen)和 200USuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen),放于 25°C 5 分鐘、5CTC 60分鐘和70°C 15分鐘。合成的cDNA放于_20°C保存。用于 實(shí)時(shí)定量PCR的引物為引物1:5，-3，ACCAAGACTGAAAAGCCTTC引物2 :5，-3，TTCTCCATCAGTGGTCGGTG。A SYBR green reporter assay kit 被用于實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng)。Medicagotruncatula的18S rRNA被用于內(nèi)標(biāo)。對(duì)于每個(gè)基因做3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)體系如下2μ I10 X PCR buffer, 2 μ I 25mM Mg2+, 0. 5 μ I 25mM dNTP, 0. 5 μ I 10 μ M forward primer,0.5 μ I 10 μ M reverse primer,I μ I 20 X SYBR Green Master Mix (Invitrogen), 0. 2 μ I5U/y I Taq(Invitrogen, 11304-029), I μ I cDNA，最后用超純水將總體積補(bǔ)到 20 μ I。反應(yīng)條件如下95°C溶解DNA 2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，95°C 10秒鐘，60°C 30秒鐘，70°C45秒鐘。最后用2_Λ 統(tǒng)計(jì)方法對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。從圖1的結(jié)果可以看出，bZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達(dá)水平能夠被干旱脅迫所誘導(dǎo)提聞。實(shí)施例2bZIP基因的亞細(xì)胞定位植物表達(dá)載體的構(gòu)建I) RNA提取(Trizol法提取)，2)反轉(zhuǎn)錄(M-MLV, promega公司)，3) PCR擴(kuò)增以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用Taq酶做PCR，將設(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)(NcoI和SpeI)連入PCR產(chǎn)物，4) PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行酶切處理，5)酶切產(chǎn)物連接，載體結(jié)構(gòu)如圖2所示。轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，利用基因槍，將不含有目的bZIP基因的空表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞，觀察其亞細(xì)胞定位(如圖3所示)；利用基因槍，將含有目的基因的載體導(dǎo)入到洋蔥表皮細(xì)胞中，觀察其亞細(xì)胞定位(如圖4所示)。圖3中，通過A和B的比較可以看出，不含有目的bZIP基因的空表達(dá)載體在細(xì)胞的各部分均有表達(dá)；而通過圖4中A和B的比較可以看出，含有ZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達(dá)載體僅在細(xì)胞核中表達(dá)。實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的bZIP基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿植株一、材料與試劑1、植物材料供試苜猜品種為紫花苜猜(Medicago sativa L. cv.保定苜猜,北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)。發(fā)芽7天的無 菌苗子葉為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。2、農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒載體所用的農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌GV3103(北京天恩澤基因科技有限公司)，農(nóng)桿
菌培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種由紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列。
3.一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No :1所示的核苷酸序列。
5.—種表達(dá)載體,其特征在于,該表達(dá)載體含有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
8.一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求3所述的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜?xì)胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿細(xì)胞及轉(zhuǎn)基因植株。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體、權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述植物為紫花苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白的編碼基因，以及含有該基因的表達(dá)載體和細(xì)胞，同時(shí)還涉及一種培育抗旱紫花苜蓿的方法和它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表達(dá)可以顯著增強(qiáng)紫花苜蓿的抗旱性能。該基因的發(fā)現(xiàn)為主要農(nóng)作物的抗旱研究提供了基因資源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/09GK103044534SQ201110310769
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者王涌鑫, 鄭彥, 劉濤, 張路培, 苗麗宏, 李聰 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所