專利名稱：microRNA 145的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,尤其涉及ー種microRNA 145的新用途。
背景技術(shù)：
micro RNAs (miRNAs)，是ー種大小約21_23個堿基的單鏈小分子RNA，通過和靶基因mRNA堿基配對引導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)(最近發(fā)現(xiàn)micro RNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá))。隨著 對micro RNA研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明micro RNA分子在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個環(huán)節(jié)中發(fā)揮著原癌基因或抑癌基因的作用。最早由Michael等應(yīng)用micro RNA克隆和Northern blot技術(shù)在大腸癌和周圍正常粘膜組織中檢測 micro RNAs 表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn) miR-145 (micro RNA145, Genebank number NR_029686. I)在癌組織中表達(dá)較正常組織中明顯降低(microRNA 145在癌組織中的表達(dá)水平是正常組織的4倍)，同時證實大腸癌細(xì)胞系CaCo-2、LIM1863中microRNA 145表達(dá)亦降低。在隨后對miCToRNA 145的多項研究中發(fā)現(xiàn)，它與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在腫瘤中的表達(dá)呈現(xiàn)多樣性的特點。microRNA 145在包括大腸癌在內(nèi)的幾種腫瘤(乳腺癌、肺癌、肝癌、卵巣癌、鼻咽癌等)組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯降低，但在早發(fā)性大腸癌中其表達(dá)升高。Akao研究組和Schepeler研究組等分別應(yīng)用腫瘤細(xì)胞系和小鼠原位移植瘤模型證實了 microRNA 145能夠有效抑制乳腺癌、大腸癌和肺癌細(xì)胞的生長。人們推測microRNA 145在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能通過抑制細(xì)胞増殖扮演腫瘤抑制基因的角色。目前現(xiàn)有對microRNA145的研究主要集中在對其抑制癌細(xì)胞增殖的能力方面，對microRNA 145其他方法的研究報道幾乎沒有。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供一種如下1)-3)中任一所述物質(zhì)在制備具有促進(jìn)腫瘤功能的廣品中的應(yīng)用I)microRNA 145 ；2)含有microRNA 145的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒；4)含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒載體。所述促進(jìn)腫瘤功能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲。所述腫瘤為大腸癌。所述產(chǎn)品為藥物；所述micro RNA145的核苷酸序列為序列表中的序列I。本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組細(xì)胞。本發(fā)明提供的重組細(xì)胞，為將所述microRNA 145、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組載體、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒或含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒載體導(dǎo)入出發(fā)細(xì)胞中得到的重組細(xì)胞。所述出發(fā)細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞；所述腫瘤細(xì)胞具體為大腸癌細(xì)胞。所述的重組細(xì)胞在篩選和/或制備抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲藥物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第三個目的是提供ー種具有促進(jìn)腫瘤功能的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為所述microRNA 145、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組載體、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒或含有microRNA145的編碼基因的重組病毒載體。所述促進(jìn)腫瘤為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲。

所述腫瘤為大腸癌；所述產(chǎn)品為藥物。抑制microRNA 145活性或者表達(dá)的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的廣品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述抑制腫瘤為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲，所述腫瘤具體為大腸癌。本發(fā)明的實驗證明，microRNA 145過表達(dá)后并未能影響HCT-8細(xì)胞的生長,但可顯著增強高轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，在大腸癌轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用，因此說明，microRNA 145與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。


圖I為熒光顯微鏡下觀察慢病毒載體介導(dǎo)GFP-MIR-145在HCT-8細(xì)胞中的表達(dá)情況圖2為利用CCK-8繪制HCT-8mir-145，HCT_8nc的生長曲線圖3為microRNA 145對HCT-8細(xì)胞遷移能力的影響圖4為microRNA 145對HCT-8細(xì)胞侵襲能力的影響
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、穩(wěn)定高表達(dá)microRNA 145的轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞系的獲得一、大腸癌細(xì)胞系的獲得大腸癌細(xì)胞系HCT-8 (ATCC，CCL-244)，其培養(yǎng)基為含有10 %的胎牛血清(Hyclone)和濃度為 0.2% 的青鏈霉素(Invitrogen)的 1640 培養(yǎng)基(Invitrogen,11875-093)。A、細(xì)胞復(fù)蘇(I)取出HCT-8(ATCC，CCL_244)的凍存管，立即放入37°C _40°C水浴中，快速搖晃
直至完全融化。(2)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入IOml冷PBS中，放入15ml離心管中，用水平離心機離心細(xì)胞(1000轉(zhuǎn)/分鐘，8分鐘)后棄上清。(3)用適量新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置37°Cニ氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。B、細(xì)胞培養(yǎng)將大腸癌細(xì)胞系放入培養(yǎng)基中，于37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每天或者隔天更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞濃度約為培養(yǎng)瓶培養(yǎng)面積80% -90%時進(jìn)行傳代。C、細(xì)胞凍存(I)選取處于指數(shù)生長期的細(xì)胞，凍存前I天給細(xì)胞換液I次。(2)貼壁細(xì)胞以常規(guī)方法消化，制備成單細(xì)胞懸液。收集懸液，離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘，8分鐘)。(3)棄上清，用凍存管重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5X 106/mL。 (4)將細(xì)胞懸液移入凍存管，扭緊管蓋，注明細(xì)胞名稱和凍存日期，放入凍存盒，置于-86°C冰箱16小時后，移至液氮中保存。D、細(xì)胞傳代(I)倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入37°CPBS輕輕洗滌細(xì)胞，吸出PBS，加入胰蛋白酶(25cm2培養(yǎng)瓶加500微升胰酶，75cm2和IOcm直徑培養(yǎng)皿加入I毫升胰酶)，在顯微鏡下觀察消化過程，待細(xì)胞變圓、細(xì)胞間連接斷開。(2)加入十倍于胰酶體積的PBS，用一次性吸管將細(xì)胞輕輕吹打，成細(xì)胞懸液。(3)收集懸液于15或者50mL離心管中，離心(1000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)。(4)用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按I : 2移入新的培養(yǎng)平或培養(yǎng)皿，得到傳代后HCT-8細(xì)胞。ニ、細(xì)胞轉(zhuǎn)染I、轉(zhuǎn)染GFP-MIR-145慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(其中外源基因為microRNA 145，Genebank號為NR_029686. I，即為序列1，購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，為能表達(dá)microRNA145的慢病毒顆粒)，根據(jù)該公司的操作指南進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染I)、分別將生長良好的步驟一得到的傳代后HCT-8細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種到96孔板中(正常培養(yǎng)，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱)，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度達(dá)到30%。2)、每孔中棄去原培養(yǎng)液，加入IOOul培養(yǎng)基及Iul慢病毒試劑(GFP-MIR-145慢病毒表達(dá)系統(tǒng))，溫和混勻。3)、37°C培養(yǎng)24小時后，換正常培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。4)、然后37°C培養(yǎng)72小時后，得到HCT_8high細(xì)胞系。采用同樣的方法將NC慢病毒表達(dá)系統(tǒng)(購自上海上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司，其與GFP-MIR-145慢病毒表達(dá)系統(tǒng)相比沒有外源基因microRNA 145)轉(zhuǎn)染HCT-8細(xì)胞，得到 HCT-8 (NC)。2、檢測細(xì)胞中microRNA 145的表達(dá)I、熒光顯微鏡觀察將上述獲得的HCT-Shigh細(xì)胞系和HCT-8 (NC)分別置于熒光倒置顯微鏡下，檢測其表達(dá)microRNA 145情況，結(jié)果如圖I所示，miR-145為HCT_8high細(xì)胞系，NC為HCT-8 (NC)，從圖中可以看出，HCT-8high細(xì)胞系穩(wěn)定高表達(dá)microRNA 145 (有熒光反應(yīng))。
熒光顯微鏡下觀察到其轉(zhuǎn)染效率高達(dá)80 % (通過流式細(xì)胞儀計數(shù)得到)。2、RT-PCR 檢測利用Trizol (Invitrogen, 15596-018)提取上述獲得的 HCT_8high 細(xì)胞系和HCT-8 (NC)細(xì)胞總RNA，以提出的總RNA為模板，microRNA 145弓丨物(購買自Qiagen，貨號為MS00003528)，進(jìn)行RT-PCR，以RNU6B為內(nèi)參(引物購買自Qiagen，貨號為MS00033740)；以未轉(zhuǎn)染病毒的HCT-8細(xì)胞和HCT-8(NC)細(xì)胞為對照。結(jié)果如下HCT-8high細(xì)胞系的microRNA 145的相對表達(dá)率為2200 ；HCT-8 (NC)的 microRNA 145 的相對表達(dá)率為 I ;未轉(zhuǎn)染病毒的HCT-8細(xì)胞中的microRNA 145的相對表達(dá)率為I ;
可以看出，microRNA 145在HCT_8high細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)。實施例2、HCT-8high細(xì)胞系穩(wěn)定高表達(dá)microRNA 145的功能研究I、細(xì)胞生長曲線(I)取轉(zhuǎn)染后24小時，生長狀態(tài)良好的由實施例I得到的HCT_8high，采用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液。計數(shù)，精準(zhǔn)地將細(xì)胞種在96孔板中，每孔細(xì)胞總數(shù)要求一致(2000個/孔)，加入培養(yǎng)劑的量也要一致，并設(shè)置空白對照(即同樣體積的培養(yǎng)基)，每孔終體積為100ul。置37°C，5% C02培養(yǎng)箱中孵育24小時。(2)每孔加入IOul的CCK-8溶液(購自日本同仁化學(xué)研究所貨號CK04)?？筛鶕?jù)具體情況增加或減少CCK-8溶液的用量。(3)正常培養(yǎng)條件(37°C，5% C02培養(yǎng)箱)下培養(yǎng)4小時(培養(yǎng)時間取決于所使用的細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度)。(4)水平晃動約10秒后用酶標(biāo)儀測量450nm波長的OD值，保存好數(shù)據(jù)。(5)每天依次法測定，共7天。每培養(yǎng)2天要給未計數(shù)的細(xì)胞換液。(6)以培養(yǎng)時間為橫軸，OD值為縱軸，描繪在半對數(shù)座標(biāo)紙上，連接曲線后即成該細(xì)胞的生長曲線。實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果為圖2所示，可以看出HCT-Shigh在加入CCK-8溶液后I天、3天和5天的96孔板中每孔細(xì)胞的OD值分別為1、3. 7,10. 2。空白對照在加入CCK-8溶液后I天、3天和5天的96孔板中每孔細(xì)胞的總數(shù)分別為1、3. 5、10. I ;可以看出，miCToRNA 145過表達(dá)后并未能影響HCT-8細(xì)胞的生長。2、細(xì)胞遷移實驗(I)將 Transewll 小室(購自 Corning 公司)用無血清 1640 培養(yǎng)基(Invitrogen,31800-022)平衡至少ー個小時或過夜，有助于更好貼附和生長。(2)實驗前一天，將由實施例I得到的HCT_8high細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)。(3)將Transewll放入24孔板,在Transewll下室中加入600ul含有10%血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。(4)先取轉(zhuǎn)染后24小時并無血清饑餓過的細(xì)胞，消化后進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4X 105/mL，再在每個Transewll小室中加入IOOul由實施例I得到的HCT-8 high細(xì)胞懸液(饑餓培養(yǎng)后，4X IO4細(xì)胞)。每組設(shè)三個平行樣本。置于孵箱中培養(yǎng)。(5) 24小時后吸去上室液體，用PBS濕潤棉簽擦去膜上面未穿過聚碳酸酯膜上小孔的細(xì)胞，生理鹽水漂洗，稍干。(6)O. 5mL甲醇結(jié)晶紫溶液染色30分鐘，流水沖洗3_5次。(7)用小刀片將聚碳酸酯膜小心切下，置膜于載玻片上，膜底面朝上，滴樹脂后用蓋玻片封片，顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野的細(xì)胞數(shù)，求和，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)檢驗，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。以轉(zhuǎn)染NC的HCT-8 (NC)為陰性對照(NC)。結(jié)果如圖3所示，其中A為顯微鏡檢測結(jié)果圖，B為遷移細(xì)胞數(shù)結(jié)果圖，從圖3A可以看出，miR-145組為HCT-8high，NC組為HCT-8 (NC)，細(xì)胞遷移24小時后，miR-145組較NC組相比有更多的細(xì)胞，說明有更多細(xì)胞遷移到Transwell小室的另ー側(cè)。圖3B中，miR-145組的細(xì)胞數(shù)為162，NC組的細(xì)胞數(shù)為50，miR-145組大約為NC組的3倍,這說明microRNA 145能夠促進(jìn)細(xì)胞的垂直遷移能力。 3、細(xì)胞侵襲試驗(I)將槍頭、Eppendorf 管、Matrigel 膠(購自 BD 公司)、Transwell 室、24 孔板置于4°C過夜，由實施例I得到的HCT-8hig細(xì)胞換無血清培養(yǎng)基中饑餓培養(yǎng)過夜。消化細(xì)胞，無血清培養(yǎng)基吸打，調(diào)整細(xì)胞濃度在I X 106/mL。(2) 4で溶解Matrigel基質(zhì)過夜,用預(yù)冷的槍頭將Matrigel膠混勻。(3)將培養(yǎng)基置于冰上，預(yù)冷槍頭取20ul Matrigel膠(I 3)于Transwell小室的上室，37°C放置30分鐘。(4)預(yù)溫?zé)o血清培養(yǎng)基輕柔洗滌已凝固的Matrigel，_ IOOul細(xì)胞懸液(IX IO5細(xì)胞)，每組設(shè)三個平行孔。(5)下室加入600ul含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。(6)置于37°C、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育24小時，棉簽拭去濾膜上表面未穿透的細(xì)胞。(7)對已穿透的細(xì)胞進(jìn)行固定、結(jié)晶紫染色、封片，每個樣本均計數(shù)5個高倍鏡視野，取其平均值。各組細(xì)胞穿透濾膜的數(shù)量的多少作為評價其侵襲能力的指標(biāo)。以轉(zhuǎn)染NC的HCT-8為陰性對照為對照(NC)。結(jié)果如圖4所示，其中A為顯微鏡下結(jié)果圖，B為侵襲實驗結(jié)果圖，從圖4A可以看出，miR-145組為HCT-8high，NC組為HCT-8 (NC)，miR-145組較對照組(NC組)細(xì)胞明顯增多。圖4B中，miR-145組的細(xì)胞數(shù)為120，NC組的細(xì)胞數(shù)為40。這些體外功能預(yù)實驗證實microRNA 145過表達(dá)可顯著增強高轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，高度提示其在大腸癌轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用。
權(quán)利要求
1.如下1)-4)中任一所述物質(zhì)在制備具有促進(jìn)腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用1)microRNA145 ； 2)含有microRNA145的編碼基因的重組載體； 3)含有microRNA145的編碼基因的重組病毒； 4)含有microRNA145的編碼基因的重組病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述促進(jìn)腫瘤功能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的應(yīng)用，其特征在于 所述腫瘤為大腸癌； 所述產(chǎn)品為藥物； 所述micro RNA145的核苷酸序列為序列表中的序列I。
4.一種重組細(xì)胞，為將所述microRNA 145、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組載體、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒或含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒載體導(dǎo)入出發(fā)細(xì)胞中得到的重組細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞，其特征在于所述出發(fā)細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞；所述腫瘤細(xì)胞具體為大腸癌細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4或5所述的重組細(xì)胞在篩選和/或制備抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4或5所述的重組細(xì)胞在制備用于篩選抑制腫瘤藥物的模型中的應(yīng)用。
8.一種具有促進(jìn)腫瘤功能的產(chǎn)品，其活性成分為所述microRNA 145、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組載體、所述含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒或含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于 所述促進(jìn)腫瘤為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲； 所述腫瘤具體為大腸癌； 所述產(chǎn)品為藥物。
10.抑制microRNA145活性或者表達(dá)的物質(zhì)在制備具有抑制腫瘤功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用； 所述抑制腫瘤具體為抑制腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲，所述腫瘤具體為大腸癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種microRNA 145的新用途。本發(fā)明提供了一種如下1)-3)中任一所述物質(zhì)在制備具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、擴散和/或侵襲的產(chǎn)品中的應(yīng)用1)microRNA 145；2)含有microRNA 145的編碼基因的重組載體；3)含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒；4)含有microRNA 145的編碼基因的重組病毒載體。本發(fā)明的實驗證明，microRNA 145過表達(dá)后并未能影響HCT-8細(xì)胞的生長，但可顯著增強高轉(zhuǎn)移性大腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，在大腸癌轉(zhuǎn)移過程中可能起重要作用，因此說明，microRNA 145與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。
文檔編號C12Q1/68GK102676516SQ20111031107
公開日2012年9月19日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者袁偉, 馬潔 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所