專利名稱：米黑根毛霉菌株及其在制備β-葡聚糖酶和凝乳酶中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種米黑根毛霉菌株及其在制備β -葡聚糖酶和凝乳酶中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
β-葡聚糖(Glucan)是以葡萄糖為單體形成的高分子聚合多糖，廣泛存在于植物和微生物的細(xì)胞壁中。葡聚糖酶(Glucanase)是一類重要的水解酶，作用于β-葡聚糖的I，3及I，4糖苷鍵；該酶可以有效分解麥類和谷類植物胚乳細(xì)胞壁中的β -葡聚糖；在飼料中可降低非淀粉多糖(NSP)及其抗?fàn)I養(yǎng)因子的含量，改善畜禽對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高畜禽的生長速度和飼料轉(zhuǎn)化效率；在啤酒釀造上用于降低麥汁黏度，改善過濾性能，提高麥芽溶出率，防止啤酒渾濁，穩(wěn)定啤酒質(zhì)量等。迄今,微生物發(fā)酵產(chǎn)β -葡聚糖酶發(fā)酵的研究主要集中于木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)和芽孢桿菌(Bacillus),而芽孢桿菌中研究較多的是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌(Bacillus licheniformis)和嗜喊芽抱桿菌(alkalophilic Bacillus sp.),且以枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶活性最高。真菌發(fā)酵β_葡聚糖酶是以中溫菌木霉和黑曲霉為主。嗜熱真菌發(fā)酵產(chǎn)耐熱β_葡聚糖酶的研究報(bào)道較少。凝乳酶(chymosin, EC3. 4. 23. 4)是一種從未斷奶的小牛皺胃中發(fā)現(xiàn)的天門冬氨酸蛋白酶，其主要的生物學(xué)功能是有限切斷酪蛋白的K-酪蛋白的Phe-Metl06連接的肽鍵，導(dǎo)致牛奶凝結(jié)，被廣泛應(yīng)用于干酪制造業(yè)，是食品領(lǐng)域中重要的酶制劑。凝乳酶的傳統(tǒng)制備方法是從剛出生的小牛皺胃中提取，傳統(tǒng)的提取方法與現(xiàn)代工業(yè)發(fā)展極不協(xié)調(diào)。研究者不斷尋找新的凝乳酶來源 ，主要包括動(dòng)物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物凝乳酶。微生物生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量大，生產(chǎn)凝乳酶的成本較低、酶提取方便。目前微生物凝乳酶應(yīng)用最多的是微小毛霉(Mucor pusillus)產(chǎn)生的凝乳酶。國內(nèi)外關(guān)于天然微生物液體發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶的專利申請較少，且產(chǎn)酶量偏低。目前生產(chǎn)凝乳酶水平普遍偏低，生產(chǎn)周期長和發(fā)酵成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種米黑根毛霉菌株及其在制備β -葡聚糖酶和凝乳酶中的應(yīng)用。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCJia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) CAU43 2CGMCC No. 4967 簡稱米黑根毛霉 CAU432。本發(fā)明還保護(hù)一種用于培養(yǎng)所述米黑根毛霉CAU432的培養(yǎng)基，由碳源、氮源、無機(jī)鹽和水組成；所述碳源為如下物質(zhì)中的至少一種甘蔗皮、玉米苞皮、玉米桿、燕麥(優(yōu)選)、麥麩、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻殼、可溶性淀粉、幾丁質(zhì)、高粱桿、白酒酒糟、麩皮、稻草和葡萄糖；所述氮源為如下物質(zhì)中的至少一種酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨(優(yōu)選)、豆柏粉、黃豆粉(優(yōu)選)、脫脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氫二銨、硫酸銨、酵母提取物和胰蛋白胨等質(zhì)量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸銨和大豆蛋白胨；所述無機(jī)鹽為如下物質(zhì)中的至少一種KH2P04、MgSO4和CaCl2。所述培養(yǎng)基的pH可為自然pH或 pH 5. 0-7. O (如 pH 5. O, pH 6. O 或 pH 7. O)。所述培養(yǎng)基可由所述碳源、所述氮源、KH2PO4, MgSO4, CaCl2和水組成。所述培養(yǎng)基優(yōu)選為如下(a)至(d)中任一所述的培養(yǎng)基(a)將所述碳源10g_50g(0. 45-0. 9mm粒徑范圍或O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)(如 10g、20g、30g、40g 或 50g)、氮源 10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g 和 CaCl2 0. 3g 溶于水并用水定容至IL得到的培養(yǎng)基；(b)將所述碳源(O. 45-0. 9mm粒徑范圍或O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)和基礎(chǔ)培養(yǎng)液甲混合得到的培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液甲的制備方法為將所述氮源log、KH2PO4 5g、MgSO4 ·7Η20 O. 3g和CaCl2 0. 3g溶于水并用水定容至IL得到的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基的初始含水量為70-90% (質(zhì)量百分 含量)(如70%、75% (優(yōu)選)、80%、85%或90% )；(c)將所述碳源(O. 45-0. 9mm粒徑范圍或O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)、所述氮源和基礎(chǔ)培養(yǎng)液乙混合得到的培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液乙的制備方法為將CaCl2 O. 3g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g和吐溫-80 0. 34g溶于水并用水定容至IL ;所述培養(yǎng)基的初始含水量為30-75% (質(zhì)量百分含量)(如33.3%、50% (優(yōu)選)、60%、66· 7%、71· 4% )；所述碳源和所述氮源的質(zhì)量比為5 I ；(d)將所述碳源10g_50g(0. 45-0. 9mm粒徑范圍或O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)(如 10g、20g、30g、40g、50g)、所述氮源 IOg^KH2PO4 5g、MgS04 ·7Η200· 3g 和 CaCl2 O. 3g 溶于水并用水定容至2. 5L得到的培養(yǎng)基。本發(fā)明還保護(hù)一種制備β -葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用所述培養(yǎng)基發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶和/或凝乳酶。所述方法具體可為如下⑴至⑷中的任意一種(I)采用(a)所述培養(yǎng)基50°C振蕩發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為3-5天；(2)采用(b)所述培養(yǎng)基50°C靜置發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為3-5天；(3)采用(C)所述培養(yǎng)基37°C靜置發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為2天；(4)采用(a)所述培養(yǎng)基37°C振蕩發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為3-5天；(5)在發(fā)酵罐中采用⑷所述培養(yǎng)基發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β _葡聚糖酶；所述發(fā)酵的條件為40-55°C (如50°C )、通氣量為l-2vvm(如1. 2vvm)、攪拌速率為300-600rpm(如 500rpm)、發(fā)酵時(shí)間為 IOh 以上(如 10_72h，優(yōu)選 50h)。所述方法(I)和/或所述方法(5)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵液10000 Xg冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有β-葡聚糖酶的溶液。所述方法(2)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的固體發(fā)酵物加入50mM pH 6. O檸檬酸緩沖液，室溫下200rpm震蕩浸提2h，IOOOOXg冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有β-葡聚糖酶的溶液。所述方法(3)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的固體發(fā)酵物加入去離子水，37°C、200rpm震蕩浸提2h，IOOOOrpm冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有凝乳酶的溶液。所述方法(4)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵液IOOOOrpm冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有凝乳酶的溶液。所述方法(I)和/或所述方法(2)和/或所述方法(5)還包括如下步驟將所述含有β -葡聚糖酶的溶液依次進(jìn)行硫酸銨沉淀、DEAE52弱陰離子交換層析和QSFF強(qiáng)陰離子交換層析，得到純化后的葡聚糖酶。以上任一所述方法得到的β -葡聚糖酶和/或凝乳酶也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述葡聚糖酶作為葡聚糖酶的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述應(yīng)用中，所述應(yīng)用的反應(yīng)條件可為40-65°C、pH 4. 0-7. O，優(yōu)選為pH 5. 5、60°C。所述凝乳酶作為凝乳酶的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。米黑根毛霉CAU432具有很高的產(chǎn)β -葡聚糖酶的能力。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酶水平為2000-6500U/mL，固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酶水平為50000-55000U/g，5L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)50h酶活可達(dá)到5500-8000U/mL，是目前相關(guān)報(bào)道中的最高水平。米黑根毛霉CAU432發(fā)酵得到的β -葡聚糖酶，最適pH為5. 5,最適溫度為60°C,該酶具有很好的溫度穩(wěn)定性,在70°C下處理30min后酶活力仍能保持80%以上。米黑根毛霉CAU432具有很高的產(chǎn)凝乳酶的能力，產(chǎn)酶水平可達(dá)105000U/g。米黑根毛霉CAU432具有產(chǎn)凝乳酶的能力。固體發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)凝乳酶水平為105000U/g干基，液體發(fā)酵出產(chǎn)凝乳酶水平為5450U/mL。

本發(fā)明所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐熱性好，且菌種穩(wěn)定性好，產(chǎn)酶高，發(fā)酵成本低(利用的碳源和氮源易于購買，價(jià)格便宜)，生產(chǎn)周期短，適宜應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。


圖1為發(fā)酵時(shí)間對米黑根毛霉CAU432搖瓶液體發(fā)酵產(chǎn)β -葡聚糖酶活性的影響。圖2為米黑根毛霉CAU4325L發(fā)酵罐產(chǎn)β -葡聚糖酶過程曲線。圖3為β _甸聚糖酶的純化過程中的蛋白電泳圖；1:粗酶液；2 :粗蛋白；3 :DEAE52弱陰離子交換層析純化后的蛋白；4和5 =QSFF強(qiáng)陰離子交換層析純化后的蛋白。圖4為β -葡聚糖酶的最適pH。圖5為β -葡聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖6為β -葡聚糖酶的最適溫度。圖7為β -葡聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。圖8為發(fā)酵時(shí)間對米黑根毛霉CAU432固體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶酶活性的影響。圖9為碳源種類對米黑根毛霉CAU432液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶酶活性的影響。圖10為氮源種類對米黑根毛霉CAU432液體發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶酶活性的影響。圖11為米黑根毛霉CAU432搖瓶發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶過程曲線。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。酵母提取物、胰蛋白胨，購自英國Oxoid公司。瓊脂、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、酪蛋白、豆柏粉、尿素、可溶性淀粉等購自北京康明威培養(yǎng)基技術(shù)有限責(zé)任公司。kh2po4、MgSO4 · 7H20、CaCl2、NaOH、苯酚、Na2S03、CuSO4 · 5H20、酒石酸鉀、Na2CO3、脫氧膽酸鈉、三氯乙酸，均為分析純，購自北京化工廠。3，5_ 二硝基水楊酸購自上海遠(yuǎn)帆制劑廠。大麥β-葡聚糖、葡萄糖購自Sigma公司。脫脂奶粉(脫脂粉)購自完達(dá)山股份有限公司。幾丁質(zhì)購自青島海洋奇力生物工程有限公司。蛋白胨購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。燕麥、甘蔗皮、稻草、玉米苞皮、麩皮、白酒酒糟、玉米桿、高粱桿、麥麩、甘蔗渣、稻殼、玉米芯和啤酒酒糟均粉碎后過篩，取粉末用作培養(yǎng)基的制備。活化培養(yǎng)基的配制方法燕麥(O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨 5g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g, CaCl2 0. 3g、瓊脂 20g，加水到 1L，自然 pH。種子培養(yǎng)基的配制方法燕麥(O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨 5g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g、CaCl2 0. 3g，加水到 1L，自然 pH。采用DNS法測定β -葡聚糖酶酶活。反應(yīng)原理3，5_ 二硝基水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，還原糖的量和棕紅色物的顏色深淺呈一定比例關(guān)系，在540nm波長下測定棕紅色物質(zhì)的吸光度值，便可求出樣品中還原糖的含量。描述DNS法測定β-葡聚糖酶酶活的參照文獻(xiàn)Miller.，et al. 1959. Use ofdinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. AnalyticalChemistry. 1959，31 :426-428.。
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凝乳酶酶活測定的參考文獻(xiàn)Arima(ArimaK，Yu J，Iwasaki S. Milk-clottingenzyme from Mucorpussilus. Methods in Enzymology Academic，1970，19(3) :446-460.。采用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量。描述Lowry法測定蛋白質(zhì)含量的參考文獻(xiàn)Lowry,0. H. Rosebrough, N. J.，F(xiàn)arr, A. L. and Randall，R. J. Protein measurement with thefolin phenol reagent. Biol. Chem.，1951，193 :265_275。實(shí)施例1、菌株的分離和鑒定一、菌株的分離本發(fā)明提供的米黑根毛霉CAU432是從土壤中篩選得到的。分離培養(yǎng)基的配制方法燕麥(O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)20g,大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g、CaCl2 0. 3g、瓊脂 20g、加水到 1L，自然 pH。初篩培養(yǎng)基的配制方法燕麥(O. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)20g，大豆蛋白胨IOg^KH2PO4 5g、MgS04.7H20 0. 3g、CaCl2 0. 3g、剛果紅 0. 05g、瓊脂 20g，加水到 1L，自然 pH。發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法燕麥(0. 18-0. 3mm粒徑范圍的粉末)20g，大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 0. 3g、CaCl2 0. 3g，加水到 1L，自然 pH。新鮮土樣稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基中，在50°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待分離培養(yǎng)基中有菌落長出，將菌株接種到初篩培養(yǎng)基，凡在菌落周圍能使剛果紅褪色形成透明圈的菌株，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件5(TC、200rpm、36h。發(fā)酵結(jié)束后取ImL發(fā)酵液于1. 5mL離心管中，離心(12000rpm、IOmin)取上清,測定β _葡聚糖酶及凝乳酶酶活。篩選得到一株酶活較高的菌株，將其命名為菌株CAU432。二、菌株的鑒定菌株CAU432的形態(tài)特征在麥芽 汁平板培養(yǎng)基上生長良好，最適生長溫度為50-550C ;菌絲體呈深灰色，但在光照下培養(yǎng)顏色變淺；在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)為橢圓形，直徑可以高達(dá)50 μ m ;在沒有硫胺素存在的SMA培養(yǎng)基(標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基)上生長，不會(huì)產(chǎn)生孢子。菌株CAU432的18S rDNA測序結(jié)果見序列表的序列I。綜合形態(tài)特征和測序結(jié)果，將菌株CAU432鑒定為米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCCjia :北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCCNo. 4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) CAU432CGMCC No. 4967 簡稱米黑根毛霉 CAU432。實(shí)施例2、搖瓶發(fā)酵制備β -葡聚糖酶的條件優(yōu)化—、發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的篩選本步驟中的發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法碳源IOg(0. 45-0. 9mm粒徑范圍的粉末)、蛋白胨 IOg^KH2PO4 5g、MgS04 · 7H20 O. 3g、CaCl2 O. 3g，加水到 1L，自然 pH。分別采用如下 15種碳源甘蔗皮、玉米苞皮、玉米桿、燕麥、麥麩、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻殼、可溶性淀粉、幾丁質(zhì)、高粱桿、白酒酒糟、麩皮和稻草。1、菌種活化將保存的米黑根毛霉CAU432在活化培養(yǎng)基平板上進(jìn)行活化。2、種子液制備將活化后的新鮮菌株接種到種子培養(yǎng)基中，50°C恒溫空氣浴往復(fù)式搖床上以200rpm振蕩培養(yǎng)24h，得到種子液，種子液的濕重約等于0. lg/mL。3、搖瓶液體發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶在250mL三角瓶中裝入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接種步驟2的種子液，接種量為2% (體積百分比)；在501恒溫空氣浴往復(fù)式搖床上以200rpm振蕩培養(yǎng)72h。取發(fā)酵液12000 Xg冷凍離心lOmin，取上清液(粗酶液)，進(jìn)行葡聚糖酶酶活測定。β -葡聚糖酶酶活的具體測定方法取100 μ L待測溶液(或其稀釋液)，加入到900 μ L底物溶液(由大麥β -葡聚糖和50mM pH 6. O檸檬酸緩沖液組成；大麥β -葡聚糖的濃度為0. 5g/100mL)中，60°C水浴反應(yīng)IOmin后加入ImL DNS試劑(將Ig 3,5- 二硝基水楊酸、Ig NaOH,0. 2g苯酚溶于蒸餾水并定容至IOOmL,即為貯存液；使用前在貯存液中加入無水亞硫酸鈉，使其濃度為0. 05g/100mL)，煮沸15min后加入ImL飽和酒石酸鉀鈉溶液，冷卻后測定540nm吸光度值。用不同濃度的葡萄糖水溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將每分鐘生成I μ mol葡萄糖所需要的酶量定義為I個(gè)酶活性單位(U)。根據(jù)540nm吸光度值計(jì)算待測溶液的酶活力的公式如下Y = (1. 0585*χ-0· 0394)*1000*Ν/180· 16，Y代表酶活性(單位為U)，X代表540nm吸光度值，N代表稀釋倍數(shù)。采用各個(gè)碳源的培養(yǎng)基得到的粗酶液的β -葡聚糖酶酶活見表I。
表I碳源對米黑根毛霉CAU432固體發(fā)酵產(chǎn)β -葡聚糖酶活性的影響
權(quán)利要求
1.米黑根毛霉(Rhizomucormiehei) CAU432，其保藏編號(hào)為 CGMCC No. 4967。
2.用于培養(yǎng)權(quán)利要求1所述米黑根毛霉的培養(yǎng)基，由碳源、氮源、無機(jī)鹽和水組成；所述碳源為如下物質(zhì)中的至少一種甘蔗皮、玉米苞皮、玉米桿、燕麥、麥麩、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻殼、可溶性淀粉、幾丁質(zhì)、高粱桿、白酒酒糟、麩皮、稻草和葡萄糖；所述氮源為如下物質(zhì)中的至少一種酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、豆柏粉、黃豆粉、脫脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氫二銨、硫酸銨、酵母提取物和胰蛋白胨等質(zhì)量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸銨和大豆蛋白胨；所述無機(jī)鹽為如下物質(zhì)中的至少一種KH2PO4、MgSO4 和 CaCl2。
3.如權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基由所述碳源、所述氮源、KH2PO4、MgSO4、CaCl2 和水組成； 所述培養(yǎng)基優(yōu)選為如下(a)至(d)中任一所述的培養(yǎng)基(a)將所述碳源10g-50g、氮源 IOg^KH2PO4 5g、MgS04.7H20 0. 3g 和 CaCl2 0. 3g 溶于水并用水定容至IL得到的培養(yǎng)基； (b)將所述碳源和基礎(chǔ)培養(yǎng)液甲混合得到的培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液甲的制備方法為將所述氮源10g、KH2P04 5g、MgS04 *7H20 0. 3g和CaCl2 0. 3g溶于水并用水定容至IL得到的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基的初始含水量為70-90% ； (c)將所述碳源、所述氮源和基礎(chǔ)培養(yǎng)液乙混合得到的培養(yǎng)基；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液乙的制備方法為將CaCl2 0. 3g、KH2PO4 5g、MgSO4 7H20 0. 3g和吐溫-80 0. 34g溶于水并用水定容至IL ;所述培養(yǎng)基的初始含水量為30-75% ;所述碳源和所述氮源的質(zhì)量比為5:1;(d)將所述碳源10g-50g、所述氮源 10g、KH2PO4 5g、MgSO4 7H20 0. 3g 和 CaCl2O. 3g 溶于水并用水定容至2. 5L得到的培養(yǎng)基。
4.一種制備3 -葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用權(quán)利要求2或3所述培養(yǎng)基發(fā)酵權(quán)利要求1所述米黑根毛霉，得到P-葡聚糖酶和/或凝乳酶。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法為如下(I)至(5)中的任意一種 (1)采用權(quán)利要求3的(a)所述培養(yǎng)基50°C振蕩發(fā)酵權(quán)利要求1所述米黑根毛霉，得到葡聚糖酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為3-5天； (2)采用權(quán)利要求3的(b)所述培養(yǎng)基50°C靜置發(fā)酵權(quán)利要求1所述米黑根毛霉，得到葡聚糖酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為3-5天； (3)采用權(quán)利要求3的(c)所述培養(yǎng)基37°C靜置發(fā)酵權(quán)利要求1所述米黑根毛霉，得到凝乳酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為2天； (4)采用權(quán)利要求3的(a)所述培養(yǎng)基37°C振蕩發(fā)酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述發(fā)酵的時(shí)間為I天以上，優(yōu)選為1-6天，最優(yōu)選為3-5天； (5)在發(fā)酵罐中采用權(quán)利要求2的(d)所述培養(yǎng)基發(fā)酵權(quán)利要求1所述米黑根毛霉，得到￠-葡聚糖酶；所述發(fā)酵的條件為40-55°C、通氣量為l-2vvm、攪拌速率為300-600rpm、發(fā)酵時(shí)間為IOh以上。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于 所述方法⑴和/或所述方法(5)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵液`10000 Xg冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有P -葡聚糖酶的溶液； 所述方法(2)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的固體發(fā)酵物加入50mM pH 6. 0檸檬酸緩沖液，室溫下200rpm震蕩浸提2h，10000X g冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有^-葡聚糖酶的溶液； 所述方法(3)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的固體發(fā)酵物加入去離子水，37°C、200rpm震蕩浸提2h，IOOOOrpm冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有凝乳酶的溶液； 所述方法(4)還包括如下步驟將所述發(fā)酵得到的發(fā)酵液IOOOOrpm冷凍離心lOmin，取上清液，即為含有凝乳酶的溶液。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法(I)和/或所述方法(2)和/或所述方法(5)還包括如下步驟將所述含有3 -葡聚糖酶的溶液依次進(jìn)行硫酸銨沉淀、DEAE52弱陰離子交換層析和QSFF強(qiáng)陰離子交換層析，得到純化后的P -葡聚糖酶。
8.權(quán)利要求4至7中任一所述方法得到的P-葡聚糖酶或凝乳酶。
9.權(quán)利要求8所述P-葡聚糖酶作為P -葡聚糖酶的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述凝乳酶作為凝乳酶的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種米黑根毛霉菌株及其在制備β-葡聚糖酶和凝乳酶中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4967。本發(fā)明所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐熱性好，且菌種穩(wěn)定性好，產(chǎn)酶高，發(fā)酵成本低(利用的碳源和氮源易于購買，價(jià)格便宜)，生產(chǎn)周期短，適宜應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)領(lǐng)域，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/14GK103045485SQ20111031230
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者江正強(qiáng), 唐艷斌, 崔健, 閆巧娟, 楊紹青 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)