專利名稱：一種重組l-阿拉伯糖異構(gòu)酶及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinoseisomerase)及其基因和制備方法，以及利用該酶制備D-塔格糖(D-tagatose)的方法。
背景技術(shù)：
塔格糖是一種在自然界中存在較少的單糖，在苔蘚、地衣等低等植物以及加熱過的牛乳、乳粉、酸乳、干酪等乳制品中有少量存在。塔格糖是一種己酮糖，其甜度為蔗糖的92%，而熱量值只有1. 5kcal/g。純凈的塔格糖為白色無水晶體物質(zhì)，無臭，熔點(diǎn)134°C。塔格糖具有良好的功能特性，如糖尿病人食用后可以抑制和減緩血糖的升高；在加熱和烘烤過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生良好色澤，可以作為蔗糖的替代品或和其它甜味劑復(fù)配使用；進(jìn)入結(jié)腸后，被其中的微生物菌群選擇性發(fā)酵，促進(jìn)有益菌增殖，抑制有害菌生長(zhǎng)，明顯改善腸道菌群，是一種很好的益生素。大量的安全毒理學(xué)試驗(yàn)表明，塔格糖安全無毒，因此被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為GRAS (generally regarded as safe),目前被允許作為甜味劑加入食品、飲料、保健品等中。塔格糖的生產(chǎn)方法包括天然提取分離法、化學(xué)催化合成法以及生物轉(zhuǎn)化法等。塔格糖是一種較為罕見的單糖，在自然界的含量極低，提取分離成本高，不適宜工業(yè)化大生產(chǎn)?；瘜W(xué)催化法也存在許多不利的因素，如化學(xué)污染物多，副產(chǎn)物多，分離困難等。因此，近年來對(duì)塔格糖生產(chǎn)的研究主要集中在生物轉(zhuǎn)化法上。研究發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(EC5.3. 1.4, L-arabinose isomerase, L-AI)可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖,是目前生物法生產(chǎn)D-塔格糖最為有效的途徑。D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)要求L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適反應(yīng)pH最好在5. 0 6. 0之間，最適反應(yīng)溫度最好在60 80°C之間，這有利于提高反應(yīng)速度，減少非特異性反應(yīng) ，避免褐變反應(yīng)。然而，目前報(bào)道的天然L-阿拉伯糖異構(gòu)酶無法同時(shí)在pH和溫度等方面滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對(duì)天然L-阿拉伯糖異構(gòu)酶無法同時(shí)在pH和溫度等方面滿足生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖的要求，提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶及其基因和制備方法，以及利用該酶制備D-塔格糖的方法。本發(fā)明的第一方面是提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，它的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。本發(fā)明第二方面提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，它的核苷酸序列是以下的任何一種I)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)編碼氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全長(zhǎng)1488，編碼496個(gè)氨基酸，所用密碼子有利于該基因在枯草芽孢桿菌(Bacillus subti I is)中表達(dá)。
本發(fā)明中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白為L(zhǎng)-阿拉伯糖異構(gòu)酶。所有編碼該氨基酸序列的核苷酸序列都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的第三方面是提供含有如上所述的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的重組載體。所述的重組載體所用的載體是本領(lǐng)域的常規(guī)載體，包括克隆載體和表達(dá)載體。較佳的如克隆載體pUC57。也可以是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，較佳的如穿梭載體pMA5。本發(fā)明的第四方面是提供含有如上所述的重組載體的轉(zhuǎn)化子。所述的轉(zhuǎn)化子的宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細(xì)胞，如大腸桿菌，優(yōu)選枯草芽孢桿菌，更優(yōu)選枯草芽孢桿菌WB600。該轉(zhuǎn)化子較佳的是表達(dá)重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌，優(yōu)選枯草芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌WB600。本發(fā)明的第五方面提供一種制備表達(dá)重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌的方法，包括以下步驟I)合成氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因；2)將步驟I)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因克隆入枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體中構(gòu)建重組載體，然后將重組載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株獲得重組枯草芽孢桿菌，即得表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌。本發(fā)明中，步驟I)所述的合成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的方法是常規(guī)方法，可以人工合成基因。所述的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的核苷酸序列可以是任何編碼SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列，較佳的是序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列。所述的枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體優(yōu)選質(zhì)粒PMA5。所述的枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株優(yōu)選枯草芽孢桿菌WB600。本發(fā)明的 一較佳實(shí)施例是利用引物擴(kuò)增獲得所述的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因。該方法是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，以步驟I)所合成的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增得到L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因。所述的引物是上游引物TG_F的序列為Sy-GGAATTCCATATGATGCTGTCATTACGTCC-3’，下游引物 TG_R 的序列為 5’ -GAGGATCCTTACCGCCCCCGCCAGAATACT-3’ ;分別具有Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)。本發(fā)明所述的將L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因克隆入枯草芽孢桿菌表達(dá)載體的克隆方法是本領(lǐng)域常規(guī)方法。較佳的，如上利用引物TG_F和TG_R擴(kuò)增獲得L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，通過Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)構(gòu)建含有L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的重組載體pMA5-araA，然后用電轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入枯草芽孢桿菌中，利用卡那霉素抗性篩選重組菌株，最后誘導(dǎo)重組枯草芽孢桿菌表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。本發(fā)明的第六方面提供一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的制備方法，包括培養(yǎng)本發(fā)明所述的轉(zhuǎn)化子，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。較佳的所述的轉(zhuǎn)化子是枯草芽孢桿菌。本發(fā)明的第七方面提供一種生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖的方法，包括采用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖，其中，所用的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。該重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶優(yōu)選用本發(fā)明所述的方法制備而得。本發(fā)明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。
相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供一種L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase, L-AI)及其基因和制備方法，以及利用該酶制備塔格糖的方法。尤其用枯草芽孢桿菌表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，獲得了具有生物活性的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，該酶更有利于塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)單、高效、周期短的特點(diǎn)。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1為擴(kuò)增araA基因的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，1、2、3 araA基因(引物物TG_F 和 TG_R)，M :分子量 Marker DL2000。圖2為重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，其中，Ml :分子量Marker DL2000, M2 :分子量Marker DL5000,1 :經(jīng) Nde I 酶切的 pMA5-araA, 2 :經(jīng) BamHI 酶切的 pMA5-araA, 3 :經(jīng) Nde I和BamH I雙酶切的pMA5_araA,4 :未酶切的pMA5_araA。圖3為重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果，其中，M :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(寬)，I 9 :重組質(zhì)粒pMA5-araA轉(zhuǎn)化WB600的重組菌株，10 :宿主菌WB600。圖4為pH和溫度對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活性的影響，A pH的影響，B :溫度的影響。圖5為反應(yīng)時(shí)間對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化率的影響。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明對(duì)已報(bào)道的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)、分析和拼接，重構(gòu)了其氨基酸序列，并對(duì)其基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，以利于其在枯草芽孢桿菌中的高效表達(dá)，從而得到了能夠高效表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌?？莶菅挎邨U菌發(fā)酵容易，可以簡(jiǎn)單、高效、周期短的大量生產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。本發(fā)明獲得的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖，并且在pH5. 0 10. 0，30 80°C的反應(yīng)條件下均具有較高的催化活性，能夠同時(shí)滿足工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶反應(yīng)pH和溫度的要求。下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1重組質(zhì)粒pMA5_araA的構(gòu)建I)從NCBI網(wǎng)站獲得已報(bào)道的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶氨基酸序列，經(jīng)CluxtalX軟件比對(duì)分析、拼接和密碼子優(yōu)化，獲得了有利于在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，其序列見序列表SEQ ID NO.1所示。對(duì)優(yōu)化后的基因采用化學(xué)合成的方法進(jìn)行全基因合成，把合成的基因連接到克隆載體pUC57(購(gòu)自上海閃晶)上得克隆載體pUC57-araA，序列測(cè)定驗(yàn)證完全正確(委托上海閃晶生物合成)。2)設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的引物，上游引物TG_F的序列為5’_GGAATTCCATATGATGCTGTCATTACGTCC-3’，下游引物 TG_R 的序列為 5，-GAGGATCCTTACCGCCCCCGCCAGAATACT-3’ ；分別具有Nde I和BamH I酶切位點(diǎn)。3)以含有密碼子優(yōu)化的araA基因的克隆載體pUC57_araA為模板，利用引物TG_F和TG_R在LA Taq (TaKaRa)的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得1. 5kb的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因片段。擴(kuò)增的程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58。。退火45s，72。。延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸lOmin。擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。
4)用Nde I和BamH I對(duì)擴(kuò)增的araA基因片段和穿梭載體pMA5 (Dartois V, CoppeeJY, Colson C and Baulard A. Genetic analysis and overexpression of lipolyticactivity in Bacillus subtilis. Appl Environ Microb. 1994 ;60 :1670-1673)進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，利用T4連接酶(TaKaRa)于16°C過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a并涂布于含有I00mg/L氨芐青霉素的LB瓊脂平板，37°C培養(yǎng)12 16h。5)挑取抗性平板上生長(zhǎng)的單菌落10個(gè)接種于5mL含有100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 37°C條件下過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以Nde I和BamH I進(jìn)行雙酶切鑒定，得到含有araA基因的重組質(zhì)粒pPMA5_araA，對(duì)酶切正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，酶切電泳結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例2重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建及L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的誘導(dǎo)表達(dá)I)制備WB600感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟包括a.接種WB600(Wu XC,Lee W,Tran L,ffong SL. Engineering a Bacillus subtilisexpression-secretion system with a strain deficient in six extracellularproteases. J Bacteriol. 1991 ; 173 (16) :4952-4958)于 3mL 液體培養(yǎng)基(含 0. 5mol/L 山梨醇的LB)中，200rpm 37°C過夜培養(yǎng)。b.取2mL過夜培養(yǎng)物，接種于含有40mL液體培養(yǎng)基(含0. 5mol/L山梨醇的LB)中，200rpm 37 °C 培養(yǎng)至 0D600 = 0.85 0.95。c.在4°C下，5000g離心5min收集細(xì)胞,用50mL預(yù)冷的電擊緩沖液(0. 5mol/L山梨醇，0. 5mol/L甘露醇，10%葡萄糖)懸浮菌體，如此漂洗4次。d.如上離心，用ImL預(yù)冷的電擊緩沖液懸浮細(xì)胞，按60 ii L/管分裝。2)重組質(zhì)粒pMA5_araA電轉(zhuǎn)化WB600，具體步驟包括a.混合60li L感受態(tài)細(xì)胞和約50ng重組質(zhì)粒pMA5_araA并轉(zhuǎn)移至0°C預(yù)冷的0.1cm電擊杯，冰上靜置5min。c.根據(jù)BioRad電轉(zhuǎn)化儀操作手冊(cè)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，電擊參數(shù)為電壓2. 5KV，電阻200 Q ,電容 20kF。d.電擊結(jié)束后立刻加入ImL冰冷的復(fù)蘇培養(yǎng)基(含0. 5mol/L山梨醇和0. 38mol/L甘露醇的LB)至電擊杯并轉(zhuǎn)移至離心管中。e.將離心管于37°C 200rpm下溫育3h。f.以100-300 u L/平板涂布于含30mg/L卡那霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)至單菌落形成。3)利用引物 TGI (5 ’ -ATACTACCTGTCCCTTGCTG-3 ’)和TG2 (5’-GGAAACGGTGTCCTAAGTC-3’)進(jìn)行菌落PCR鑒定，菌落PCR的模板為經(jīng)凍融法處理的菌體，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，58。。退火45s，72。。延伸1. 5min，共30個(gè)循環(huán)；72°C再延伸lOmin。4)分別挑取PCR鑒定且測(cè)序正確的單菌落，接種于2mL含30mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。按2%的接種量轉(zhuǎn)接于20mL含30mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，200rpm振蕩培養(yǎng)24h后將發(fā)酵液8000g下離心5min，棄上清，菌體用于SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例3L-阿拉伯糖異構(gòu)酶制備塔格糖的條件優(yōu)化
I) L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活力測(cè)定取發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，按100mg/ml的濃度懸浮于70mM Tris-HCl (pH7. 6)緩沖液中，加入100mg/ml底物半乳糖，60°C振蕩反應(yīng)lh，12000rpm離心5min收集上清液，適當(dāng)稀釋后利用改進(jìn)的半胱氨酸-咔唑法測(cè)定560nm處的吸光值變化，具體步驟如下a.取0，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8mL塔格糖標(biāo)準(zhǔn)液(50mg/L)于具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)足到1. OmL。b.取25mL具塞試管，分別加入1. OmL適當(dāng)稀釋的反應(yīng)液及對(duì)照液，然后每管中加A6. OmL 70% (V/V)的硫酸溶液，0. 2mL 1.5% (W/V)的半胱氨酸鹽酸鹽溶液，搖勻，立即加A 0. 2mL 0. 12% (W/V)的咔唑酒精溶液，劇烈振蕩后于60°C水浴中反應(yīng)lOmin，立即取出，冰浴冷卻5min,用IOmm光徑的比色皿在560nm波長(zhǎng)下比色。2)反應(yīng)體系pH對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶制備塔格糖的影響取發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，按100mg/ml的濃度分別懸浮于pH3 10的緩沖液中。加A 100mg/ml半乳糖，60°C振蕩反應(yīng)lh, 12000rpm離心5min收集上清液,適當(dāng)稀釋后利用半胱氨酸-咔唑法測(cè)定L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的活力，以最大酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。檢測(cè)pH3 10的酶活,酶活值最大點(diǎn)的酶活即為最大酶活，以此為100%，計(jì)算其他點(diǎn)和最大點(diǎn)的比值得到相對(duì)酶活。結(jié)果見圖4(A)。重組枯草芽孢桿菌表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在pH3 10的范圍內(nèi)均具有活性，其最適反應(yīng)pH為6. 0，在pH5. 0 10. 0的范圍內(nèi)均具有較高的催化活性。3)溫度對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶制備塔格糖的影響取發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，按100mg/ml的濃度懸浮于70mM Tris-HCl (pH7. 6)緩沖液中，加入100mg/ml底物半乳糖,分別在30 80°C下振蕩反應(yīng)lh, 12000rpm離心5min收集上清液，適當(dāng)稀釋后利用半胱氨酸-咔唑法測(cè)定560nm處的吸光值變化。結(jié)果見圖4(B)。在30 80°C的反應(yīng)條件下，重組枯`草芽孢桿菌表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的酶活性隨著溫度的升高而增大。4)反應(yīng)時(shí)間對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶制備塔格糖的影響取發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，按100mg/ml的濃度懸浮于70mM Tris-HCl (pH7. 6)緩沖液中，加入100mg/ml底物半乳糖，分別在70°C下振蕩反應(yīng)，12000rpm離心5min收集2，4，6，8，IOh的上清液，適當(dāng)稀釋后利用半胱氨酸-咔唑法測(cè)定560nm處的吸光值變化。結(jié)果見圖5。在IOh內(nèi)，重組枯草芽孢桿菌表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶對(duì)半乳糖的轉(zhuǎn)化率隨著時(shí)間的增加而增加。應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表
<110>上海醫(yī)藥工業(yè)研究院；中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院 〈120〉一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶及其基因和應(yīng)用
〈130〉P4-111802C
<160〉2
<170〉PatentIn version 3.4
<210>I
〈211〉1491
<212〉DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶 〈220〉
<221〉 CDS <222〉(1).. (1491)
<400〉 1
atg ctg tea tta cgtcct tat gaa ttt tggttt gtg aca gga agt cag48
Met Leu Ser Leu Arg Pro Tyr Glu Phe Trp Phe Val Thr Gly Ser Gln151015
cac ttg tac gga gaa gaa gcg tta aaa caa gtc gaa gaa cat tea aga96
His Lcu Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Lys Gln Val Glu Glu His Ser Arg202530
ate atg gtc aat gaa tgg aat cgc gat tcg gtg ttt ccg ttc cca ttc144
He Met Val Asn Glu Trp Asn Arg Asp Ser Val Phe Pro Phe Pro Phe 354045
gtt ttc aaa tea gtc gtg acg acg cca gag gaa ate egg cgc gtt tgc192
Val Phe Lys Ser Val Val Thr Thr Pro Glu Glu He Arg Arg Val Cys505560
ctt gag gcg aat gcg age gaa caa tgc get ggg gtc ate act tgg atg 240
權(quán)利要求
1.一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，其特征在于，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。
2.一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，其特征在于，其核苷酸序列是以下的任何一種 1)序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列； 2)編碼氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。
3.含有如權(quán)利要求2所述的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的重組載體。
4.含有如權(quán)利要求3所述的重組載體的轉(zhuǎn)化子。
5.一種制備表達(dá)重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)合成氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因； 2)將步驟I)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因克隆入枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體中構(gòu)建重組載體，然后將重組載體導(dǎo)入枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株獲得重組枯草芽孢桿菌，即得表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因工程菌。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟I)所述的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體是質(zhì)粒pMA5 ;所述的枯草芽孢桿菌表達(dá)菌株是枯草芽孢桿菌WB600。
8.—種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的制備方法，其特征在于，包括培養(yǎng)如權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化子，從發(fā)酵產(chǎn)物中分離重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。
9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)化子是枯草芽孢桿菌。
10.一種生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D-塔格糖的方法，包括采用L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化生成D-塔格糖，其特征在于，所用的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase，L-AI)及其基因和制備方法，以及利用該酶制備D-塔格糖(D-tagatose)的方法。尤其用枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，獲得了具有生物活性的重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，該酶更有利于塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)單、高效、周期短的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103045575SQ20111031297
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者朱寶泉, 林軍, 胡海峰, 胡又佳 申請(qǐng)人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院