專利名稱：結(jié)核菌檢測(cè)用的引物和探針以及使用它們檢測(cè)人型結(jié)核菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用核酸擴(kuò)增及其檢測(cè)體系，在臨床檢查中檢測(cè)人型結(jié)核菌結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，以下稱為人型結(jié)核菌)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
人型結(jié)核菌是導(dǎo)致人產(chǎn)生結(jié)核病的病原體，是被分類在分枝桿菌屬 (Mycobacterium)并具有抗酸性質(zhì)的革蘭氏陽(yáng)性桿菌。結(jié)核病雖然近年顯著減少，但是，最近產(chǎn)生了老年人的發(fā)病率上升、在沒(méi)有經(jīng)歷過(guò)結(jié)核感染的年輕人中引起集體感染等重大問(wèn)題。另一方面，除了人型結(jié)核菌以外，已知鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)、胞內(nèi) ^felflii (Mycobacterium intracellulare)lif (Mycobacterium kansasii) 等非結(jié)核性抗酸菌對(duì)人表現(xiàn)病原性。另外，在感染AIDS病毒的免疫缺陷者當(dāng)中，非結(jié)核性抗酸菌引起疾病成了主要問(wèn)題。由于這些非結(jié)核性抗酸菌病多數(shù)對(duì)抗結(jié)核藥具有抗藥性， 所以在決定治療方案時(shí)，鑒別診斷結(jié)核病和非結(jié)核性抗酸菌病是很重要的。但是，從臨床癥狀、病理組織學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，鑒別結(jié)核病是非常困難的，因此診斷必須通過(guò)菌的鑒定來(lái)進(jìn)行。在鑒別診斷結(jié)核病或非結(jié)核性抗酸菌病時(shí)，一般通過(guò)小川培養(yǎng)基分離培養(yǎng)樣品， 為了鑒定種而進(jìn)一步采用進(jìn)行生化試驗(yàn)的方法。然而，通常由于分枝桿菌屬生長(zhǎng)慢，培養(yǎng)時(shí)需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。因此，進(jìn)行歷來(lái)的基本方法的涂片試驗(yàn)或培養(yǎng)試驗(yàn)時(shí)，為了得到結(jié)核病與否的診斷結(jié)果，光是菌的分離培養(yǎng)就需要3 4周時(shí)間，然后在鑒定種的各種試驗(yàn)中還需要2 3周時(shí)間。另外也有使用針對(duì)分枝桿菌屬的抗原的抗體的結(jié)核菌檢測(cè)法，但是，由于分枝桿菌屬種之間的交叉反應(yīng)，欠缺相對(duì)于結(jié)核菌的特異性，靈敏度也不夠。近年，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)等的核酸擴(kuò)增技術(shù)的診斷技術(shù)作為有用的方法被研究，也研究了可以被利用到結(jié)核菌的診斷中，研究了結(jié)核菌DNA基因組的各區(qū)域是否在用PCR進(jìn)行的結(jié)核菌檢測(cè)中可以用作靶標(biāo)。例如報(bào)道了檢測(cè)編碼分枝桿菌屬的65千道爾頓抗原的基因區(qū)域的方法(例如參照非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2、非專利文獻(xiàn)3、非專利文獻(xiàn)4、非專利文獻(xiàn)幻。然而，已知 65千道爾頓抗原基因除了在人型結(jié)核菌中具有以外，在鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)(鳥(niǎo)型結(jié)核菌)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum)、副結(jié)核分枝桿菌(M. paratuberculosis)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、BCG和海分枝桿菌(M. marinum)等同屬菌中也具有。尤其是，由于與非結(jié)核性抗酸菌病的典型的病原菌鳥(niǎo)分枝桿菌或堪薩斯分枝桿菌的交叉性高，因此檢測(cè)65 千道爾頓抗原基因的方法作為特異地檢測(cè)人型結(jié)核菌的方法還存在問(wèn)題。另外，研究了使用自牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)DNA鑒定的序列-編碼 MPB70蛋白質(zhì)的基因序列進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的鑒定的試驗(yàn)方法(例如，參照非專利文獻(xiàn)6)。 然而，Kulski 等人在 FEMS Microbiol Lett. 1997 年 3 月 1 日；148(1) :43-48(非專利文獻(xiàn) 7)報(bào)道了其結(jié)果，已知其中進(jìn)行的PCR檢驗(yàn)結(jié)果在以MPB70蛋白質(zhì)作為靶標(biāo)時(shí)，與堪薩斯分枝桿菌的DNA中存在的類似序列產(chǎn)生交叉反應(yīng)，該方法在特異地檢測(cè)人型結(jié)核菌檢測(cè)中也存在問(wèn)題。此外，報(bào)道了編碼蛋白質(zhì)抗原b (Pab)的基因序列作為標(biāo)記的結(jié)核分枝桿菌/牛分枝桿菌的檢測(cè)方法(例如參照非專利文獻(xiàn)8)，證實(shí)了以結(jié)核分枝桿菌/牛分枝桿菌檢測(cè)目的使用該標(biāo)記的有效性。但是，由于考慮到Pab基因在結(jié)核基因組中僅存在一個(gè)拷貝，因此不太優(yōu)選作為核酸擴(kuò)增的靶標(biāo)材料(相對(duì)地，后述的IS6110序列在核酸基因組中存在10 個(gè)拷貝。)。此外，報(bào)道了 IS6110作為探針的RFLP (限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)可以在結(jié)核菌的診斷中使用(例如參照非專利文獻(xiàn)9)，并且可以作為結(jié)核的流行病學(xué)調(diào)查的重要工具在世界各國(guó)中被使用。IS6110是結(jié)核菌特有的插入序列，在染色體DNA中存在多個(gè)IS6110，其在每種菌株中的數(shù)目、位置不同，其特性在一定程度上穩(wěn)定地遺傳下去。其結(jié)果是根據(jù)菌株的不同而顯示不同的RFLP型，也可以分為衍生的組。直至目前為止，很多報(bào)道涉及使用 IS6110的結(jié)核檢測(cè)方法，報(bào)道了具有超過(guò)75%的靈敏度和接近100%的特異性。但是，另一方面，研究結(jié)果也報(bào)道了在使用IS6110的檢測(cè)方法中，存在產(chǎn)生假陽(yáng)性的問(wèn)題(非專利文獻(xiàn)10)。另外，也有對(duì)IS6110設(shè)計(jì)特異的引物而進(jìn)行PCR的檢測(cè)方法(例如參照專利文獻(xiàn) 1、專利文獻(xiàn)2、專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)4)，但存在涉及結(jié)核分枝桿菌以外的來(lái)自分枝桿菌屬的與IS6110相關(guān)的序列也擴(kuò)增的問(wèn)題。另外，IS6110樣序列也存在于結(jié)核菌以外的其他微生物中，在以IS6110作為靶標(biāo)的檢測(cè)方法中，暗示了這些微生物也被檢測(cè)出來(lái)的問(wèn)題。因此，歷來(lái)檢測(cè)IS6110的方法在特異地檢測(cè)各種人型結(jié)核菌方面是不充分的，并存在問(wèn)題。由以上看出目前的情況是期望確立一種新的特異地檢測(cè)人型結(jié)核菌的方法。專利文獻(xiàn)1 特表平5-507617號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 特表平11-514522號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 日本專利第觀14422號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 美國(guó)專利第5370998號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)5 特開(kāi)昭60-500717號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 特開(kāi)昭60-281號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7 美國(guó)專利第5210015號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)8 美國(guó)專利第5538848號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)9 美國(guó)專利第5，801，155號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)10 美國(guó)專利第5925517號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)11 美國(guó)專利第6，492，121號(hào)說(shuō)明書(shū)專利文獻(xiàn)12 日本專利第沈50159號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)13 特公平7-114718號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)14 特開(kāi)昭58-40099號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)15 特開(kāi)昭62-265999號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)1 :Chia等人，J. Clin. Microbiol.，1990年，第觀卷，第9期， 1877-1880 頁(yè)；非專利文獻(xiàn)2 =Brisson-Noel 等人，Lancet, 1989 年，第 3；34 卷，p. 1069-1071非專利文獻(xiàn)3 :Hackel 等人，Molecular and cellular Probes，1990 年，第 4 卷， p. 205-210非專利文獻(xiàn)4 :ffoods, Cole, FEMS Mycrobiology Letters, 1989 年，第 65 卷， p. 305-310非專利文獻(xiàn)5 =Hance 等人，Molecular Microbiology, 1989 年，第 3 卷，第 7 期， p.843-849非專利文獻(xiàn)6 :Kulski 等人，J. Clin Microbiol.，1995 年，第 33 期，p. 668-674非專利文獻(xiàn)7 =Kulski 等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett. 1997 年 3 月 1 日，第 148 卷， 第 1 期，p. 43-48非專利文獻(xiàn)8 =Sjobring 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 年，第沘卷，第 10 期， P. 2200-2204非專利文獻(xiàn)9 =Hermans PWM 等人，J. Clin. Microbiol.，1990 年，第 28 卷， p.2051-2058非專利文獻(xiàn)10 =Lee 等人，Neurological Sciences, 1994 年，第 123 卷，p. 173-179非專利文獻(xiàn)11 =Thierry 等人，Nucleic Acid Res.，1990 年，第 18 卷，第 1 期，
P. 188非專利文獻(xiàn)12 :Nucleic Acids Res.，1986 年，第 14 卷，p. 6115-6128非專利文獻(xiàn) 13 =Kent PT,Kubica GP,Pubric Health Mycobacteriology,A Guild for the Level III laboratory,U. S. Department of Health and Human Services,Public Health Service, Center for Disease Control, Atlanta, U. S. A. , 1985 年，p.31-5
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明欲解決的課題鑒于上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種排除診斷上的假陽(yáng)性的新穎的結(jié)核菌檢測(cè)用引物，和使用該引物簡(jiǎn)便、迅速且準(zhǔn)確度高地檢測(cè)人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法。用于解決課題的手段本發(fā)明以解決上述課題為目的并已完成了發(fā)明，包括以下內(nèi)容。(1)含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8中所述的核酸序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鳥(niǎo)嘌呤、T表示胸腺嘧啶。另外，任意位置的T可以被尿嘧啶(U)替換。下同)的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。(2) 一種人型結(jié)核菌檢測(cè)用引物，含有寡核苷酸，該寡核苷酸含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交。
(3) 一種人型結(jié)核菌檢測(cè)用探針，含有寡核苷酸，該寡核苷酸含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交。(4) 一種人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法，其特征在于使用寡核苷酸作為引物和/或探針，該寡核苷酸含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的
部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜 、-父。(5) 一種人型結(jié)核菌檢測(cè)用試劑盒，包括含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào) 4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物和/或探針。本發(fā)明人對(duì)直至目前所確定的人型結(jié)核菌和其他生物的各種基因，反復(fù)進(jìn)行各屬種之間的各基因序列的同源性的理論驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在這樣的堿基序列，所述堿基序列特異地與人型結(jié)核菌的插入重復(fù)序列-IS6110序列的特定區(qū)域雜交，是對(duì)人型結(jié)核菌的檢測(cè)有用的堿基序列。對(duì)這些發(fā)現(xiàn)作進(jìn)一步深入的研究，結(jié)果研發(fā)了對(duì)人型結(jié)核菌具有特異性、并用于其檢測(cè)的寡核苷酸(序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7 和序列號(hào)8中所述的核酸序列)和利用它們的人型結(jié)核菌檢測(cè)用核酸引物和標(biāo)識(shí)探針，并確立使用它們的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法，與歷來(lái)使用的IS6110作為靶標(biāo)的結(jié)核菌的檢測(cè)方法相比，可能排除診斷上的假陽(yáng)性，并且可能以更高的特異性和精確度檢測(cè)人型結(jié)核菌。附圖簡(jiǎn)述[

圖1]是實(shí)施例1中所得的電泳結(jié)果。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用以下的試樣時(shí)的結(jié)果。M4:分子量標(biāo)記(標(biāo)記4)、a:大腸菌(Escherichia coil)、 b、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結(jié)核菌)、C、堪薩斯分枝桿菌 (Mycobacterium kansasii)、d:海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、e 猿分枝桿菌 (Mycobacterium simiae)、f 療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)、g 戈氏分枝 Iflif (Mycobacterium gordonae) > h : ! 分枝!flif (Mycobacterium szulgai) > i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)、j 胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare) k 胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri) >1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum) >n 地分枝!flif (Mycobacterium terrae)、o 次要分枝!f" (Mycobacterium triviale)、ρ 禹發(fā)分枝！flif (Mycobacterium fortuitum)、q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、 s :Mybacterium peregrinum。[圖2]是實(shí)施例2中所得的電泳結(jié)果。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用以下試樣時(shí)的結(jié)果。Ml:分子量標(biāo)記(標(biāo)記1)、M4:分子量標(biāo)記(標(biāo)記4)、a:大腸桿菌(Escherichia coil)、b、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,人型結(jié)核菌)、C、堪薩其Jf 分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)、d 海分枝桿菌(Mycobacteriummarinum)、e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)、f 療病分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)、g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、h 斯氏分枝桿菌 (Mycobacterium szulgai)、i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)、j 胞內(nèi)分枝桿菌 (Mycobacterium intracellulare) k 胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)、l 蟾分枝桿菌 (Mycobacterium xenopi)、m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)、η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)、o 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)、p 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、s :Mybacterium peregrinum。[圖3-1]是比較例1中所得電泳圖。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用以下試樣時(shí)的結(jié)果。另外，當(dāng)使用無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)作為試樣時(shí) (m)的條帶用虛線圓圈起來(lái)表示。另外，當(dāng)使用次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale) 作為試樣時(shí)(ο)的條帶用箭頭指向的虛線圓圈起來(lái)表示。Ml 分子量標(biāo)記(標(biāo)記1)、M4 分子量標(biāo)記(標(biāo)記4)、a 大腸桿菌(Escherichia coil)、b、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、 c、堪薩其jf 分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)、 d海分枝桿菌 (Mycobacterium marinum)、e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)、f 療病分枝桿菌 (Mycobacterium scrofulaceum)、g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)、h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)、i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium) > j 胞內(nèi)分枝桿 |if (Mycobacterium intracellulare) k 胃分枝Iflif (Mycobacterium gastri) > 1 分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)、m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum) >n 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)、o 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)、p 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)、r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、s :Mybacterium peregrinum (peregrinum 分枝桿菌)。[圖3-2]表示對(duì)次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)試樣進(jìn)行上述電泳所得的部分(ο)中，對(duì)擴(kuò)增片段的大小判斷為與人型結(jié)核菌的陽(yáng)性條帶非常相似的部分的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、分析得到的核酸序列列表。其中，源自部分(b)的人型結(jié)核菌的PCR產(chǎn)物的序列作為第一核苷酸序列，為了比較，表示在序列表的上段。另外，自部分(ο)所得的次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)來(lái)源的PCR產(chǎn)物的序列作為第二核苷酸序列，表示在序列表的下段。[圖4]表示在實(shí)施例3中進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果，繪制相對(duì)各PCR用DNA試樣的基因組的拷貝數(shù)(χ軸、對(duì)數(shù)值)的Ct值(y軸)的校正曲線。[圖5]是實(shí)施例4所得的電泳的結(jié)果。另外，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用以下的試樣時(shí)的結(jié)果。M 分子量標(biāo)記、(1)沒(méi)有試樣、(2)人型結(jié)核菌+鳥(niǎo)分枝桿菌 (M. avium) +胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) + 堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、(3)人型結(jié)核菌、(4)鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium) +胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) +堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、(5)人型結(jié)核菌(10個(gè)拷貝)+鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium) +胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare) +堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、(6)鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)、(7)人型結(jié)核菌+胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) +堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)。另外，在電泳模式的左邊用箭頭表示電泳方向，表示各擴(kuò)增產(chǎn)物的部分的出現(xiàn)順序?！癟B”表示結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、“avium”表示鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)、“intra”表示胞內(nèi)分枝 fflif (M. intracellulare) >"kansasii"^/^ifil^Jif^feff lif (Μ. kansEisii)。[圖6]表示在實(shí)施例5中進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果，繪制相對(duì)各PCR用DNA試樣的基因組的拷貝數(shù)(χ軸、對(duì)數(shù)值)的Ct值(y軸)的校正曲線。實(shí)施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌的IS6110基因是由全長(zhǎng)885個(gè)堿基對(duì)的堿基序列組成， 例如在根據(jù)巴斯德研究所的報(bào)告"Nucleic Acid Resl990,No. 18(1), p. 188”(非專利文獻(xiàn) 11)中記載了該全堿基序列。作為本發(fā)明涉及的寡核苷酸，可以列舉含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào) 4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(以下，簡(jiǎn)稱為本發(fā)明的寡核苷酸。)。作為本發(fā)明涉及的含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào) 6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸，例如可以列舉含有與序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列具有約70%或以上、優(yōu)選約80%或以上、更優(yōu)選約90%或以上、最優(yōu)選約95%或以上的同源性的堿基序列的寡核苷酸，或特征在于含有序列表的序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、 序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部，并且由連續(xù)10個(gè)堿基或以上、優(yōu)選20個(gè)堿基或以上組成的寡核苷酸。作為本發(fā)明涉及的含有相對(duì)序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部為互補(bǔ)序列的部分或全部的寡核苷酸，例如可以列舉具有與含有本發(fā)明的序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸雜交的堿基序列的部分或全部的寡核苷酸。所謂上述的本發(fā)明涉及的具有與含有本發(fā)明的序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸雜交的堿基序列的部分或全部的寡核苷酸，具體地，可以列舉具有在高嚴(yán)格的條件或嚴(yán)格的條件下，與含有本發(fā)明的序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào) 7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸雜交的堿基序列的部分或全部的寡核苷酸等。另外，其中所謂的“高嚴(yán)格的條件”具體地是指例如在50%的甲酰胺中、42 70°C、優(yōu)選60 70°C的雜交，然后在0. 2 2XSSC、0. 十二烷基硫酸鈉(SDS)中、25 70°C洗凈的條件。另外，所謂的“嚴(yán)格的條件”具體地是指例如在6XSSC或與其等價(jià)的鹽濃度的雜交溶液中，在50 70°C的溫度條件下進(jìn)行16小時(shí)的雜交，在6XSSC或與其等價(jià)的鹽濃度的溶液等中根據(jù)需要進(jìn)行預(yù)洗凈后，在IXSSC或與其等價(jià)的鹽濃度的溶液等中洗凈的條件。所謂本發(fā)明涉及的與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，可以列舉前述的具有在高嚴(yán)格的條件或嚴(yán)格的條件下，與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的堿基序列的寡核苷酸等。該高嚴(yán)格的條件和嚴(yán)格的條件如前所述。另外，本發(fā)明的寡核苷酸可以是脫氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。 當(dāng)然核糖核酸時(shí)，胸苷殘基⑴與尿苷殘基⑶可以相互替換。另外，也可以在合成時(shí)將任意位置的T變?yōu)閁進(jìn)行合成，得到含有尿苷殘基的DNA。同樣地也可以得到含有將任意位置的U變成T的胸苷殘基的RNA。另外，也可以是1個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失、插入或替換，也可以是如肌苷(I)這樣的修飾核苷酸。為了獲得本發(fā)明的寡核苷酸，也可以使用通過(guò)本身公知的化學(xué)合成法制備的寡核苷酸。因此，相比克隆化的寡核苷酸或多核苷酸，更可以容易、大量且便宜地獲得一定質(zhì)量的寡核苷酸。例如，使用通常進(jìn)行DNA合成的DNA合成儀，根據(jù)通常的磷酰胺(* ^ * 7 ^夕· ^ 卜)法合成寡核苷酸，根據(jù)使用陰離子交換柱色譜的常規(guī)方法進(jìn)行純化，可以得到作為目的的本發(fā)明的寡核苷酸。作為本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌檢測(cè)用引物，可以列舉具有含有序列號(hào)1、序列號(hào) 2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的人型結(jié)核菌檢測(cè)用引物(以下稱為本發(fā)明的引物)。本發(fā)明的引物中使用的含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110 基因的核酸序列雜交的寡核苷酸的具體例子，可以是在前述的本發(fā)明的寡核苷酸的敘述中所述的。另外，本發(fā)明的引物，例如在符合作為目的的核酸雜交條件下，從含有序列號(hào)1 5中所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互補(bǔ)序列的部分或全部的寡核苷酸中，考慮解鏈溫度(Tm值)等、可以以適當(dāng)區(qū)域的適當(dāng)長(zhǎng)度使用。考慮到維持作為引物序列的特異性所需的堿基數(shù)，優(yōu)選具有10個(gè)堿基或以上、更優(yōu)選具有20個(gè)堿基或以上的長(zhǎng)度。將本發(fā)明的引物作為在PCR等中使用的引物時(shí)，例如優(yōu)選正向引物是含有序列號(hào) 1或2中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部的寡核苷酸，反向引物是含有序列號(hào)3或4中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部的寡核苷酸。其中，正向引物優(yōu)選序列號(hào)1或2中所述的核酸序列的寡核苷酸，反向引物優(yōu)選序列號(hào)3或4中所述的核酸序列的寡核苷酸。作為特別優(yōu)選的引物的組合，可以列舉(a)正向引物是序列號(hào)1中所述的核酸序列的寡核苷酸，反向引物是序列號(hào)3中所述的核酸序列的寡核苷酸的組合，或(b)正向引物是序列號(hào)2中所述的核酸序列的寡核苷酸、反向引物是序列號(hào)4中所述的核酸序列的寡核苷酸的組合。獲得本發(fā)明的引物的方法是如獲得前述的本發(fā)明的核苷酸的方法中所述的方法。
本發(fā)明的引物也可以通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)被標(biāo)識(shí)。作為用于通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)本發(fā)明的引物的標(biāo)識(shí)物質(zhì)，可以使用放射性同位素或酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等公知的標(biāo)識(shí)物質(zhì)中的任一種。例如，作為放射性同位素，可以列舉32P、33P、％等；作為酶，可以列舉堿性磷酸酶、西洋辣根過(guò)氧化物酶等；作為熒光物質(zhì)，可以列舉花菁染料(Cyanine Dye)系的 Cy3、Cy5 (Amasham Bioscience公司)、熒光素等；作為發(fā)光物質(zhì)，可以列舉含有吖啶嗡酯 (Acridinium Ester)的化學(xué)發(fā)光試劑等。通過(guò)放射性同位素標(biāo)識(shí)本發(fā)明的引物時(shí)，可以列舉在合成引物時(shí)，通過(guò)摻入使用放射性同位素標(biāo)識(shí)的核苷酸以標(biāo)識(shí)引物的方法、或合成引物后，使用放射性同位素標(biāo)識(shí)的方法等。具體地，可以列舉通常使用較多的隨機(jī)引物法、切口移位法、通過(guò)T4多核苷酸激酶的5'-末端標(biāo)識(shí)法、使用末端轉(zhuǎn)脫氧核苷酰酶的3'-末端標(biāo)識(shí)法、RNA標(biāo)記法等。通過(guò)酶標(biāo)識(shí)本發(fā)明的引物時(shí)，可以使用使堿性磷酸酶、西洋辣根過(guò)氧化物酶等酶分子與標(biāo)識(shí)的引物直接共價(jià)鍵合等該領(lǐng)域中常用的方法即直接標(biāo)識(shí)法。通過(guò)熒光物質(zhì)標(biāo)識(shí)時(shí)，例如可以通過(guò)該領(lǐng)域中常用方法的標(biāo)識(shí)技術(shù)摻入熒光素標(biāo)識(shí)的核苷酸到引物上。另外，在具有連接臂的核苷酸作為序列的寡核苷酸的一員的替代方法(例如，參照非專利文獻(xiàn)12)中，也可以通過(guò)熒光物質(zhì)標(biāo)識(shí)核苷酸。這時(shí)，也有通過(guò)特開(kāi)昭60-500717號(hào)公報(bào)(專利文獻(xiàn)幻中公開(kāi)的合成法由脫氧尿苷化學(xué)合成5位上具有連接臂的尿苷，在上述寡核苷酸鏈中引入熒光物質(zhì)的方法。通過(guò)發(fā)光物質(zhì)標(biāo)識(shí)的方法和通過(guò)生物素標(biāo)識(shí)的方法，通?？梢愿鶕?jù)該領(lǐng)域中采用的發(fā)光標(biāo)識(shí)或生物素標(biāo)識(shí)核苷酸的常規(guī)方法進(jìn)行。作為本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌檢測(cè)用探針，可以列舉含有寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)的探針(以下稱為本發(fā)明的探針)，該寡核苷酸含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、 序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交。在本發(fā)明的探針中使用的本發(fā)明的寡核苷酸的具體例子如前述的本發(fā)明的寡核苷酸的敘述中所述。本發(fā)明的探針例如在符合作為目的的核酸雜交條件下，由含有序列號(hào)1 8所述的核酸序列的部分或全部的寡核苷酸或含有其互補(bǔ)序列的部分或全部的寡核苷酸，計(jì)算解鏈溫度(Tm值)等，可以以合適的長(zhǎng)度使用合適的區(qū)域。但是，考慮到使探針具有充分的特異性，同時(shí)為了維持作為探針序列的特異性所需的堿基數(shù)，優(yōu)選具有10個(gè)堿基或以上，更優(yōu)選20個(gè)堿基或以上的長(zhǎng)度。另外，序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8中所述的核酸序列是通過(guò)使用本發(fā)明的引物進(jìn)行PCR而被擴(kuò)增的核酸序列。例如，序列號(hào)6中所述的核酸序列是通過(guò)以序列號(hào)1中所述的核酸序列的寡核苷酸作為正向引物，序列號(hào)3中所述的核酸序列的寡核苷酸作為反向引物進(jìn)行PCR而被擴(kuò)增的序列；序列號(hào)7中所述的核酸序列是通過(guò)以序列號(hào)2中所述的核酸序列的寡核苷酸作為正向引物，序列號(hào)4中所述的核酸序列的寡核苷酸作為反向引物進(jìn)行PCR而被擴(kuò)增的序列；序列號(hào)8中所述的核酸序列是通過(guò)以序列號(hào)4中所述的核酸序列的互補(bǔ)鏈序列的寡核苷酸(序列號(hào)14)作為正向引物，序列號(hào)5中所述的核酸序列的寡核苷酸作為反向引物通過(guò)PCR而被擴(kuò)增的序列。獲得本發(fā)明的探針的方法如在獲得前述的本發(fā)明的核苷酸的方法中所述。本發(fā)明的探針可以通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)被標(biāo)識(shí)。作為通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)本發(fā)明的探針中所使用的標(biāo)識(shí)物質(zhì)，可以使用放射性同位素或酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物素等公知的標(biāo)識(shí)物質(zhì)的任一種。
標(biāo)識(shí)本發(fā)明的探針的標(biāo)識(shí)物質(zhì)的具體例子和標(biāo)識(shí)方法如在本發(fā)明的引物的標(biāo)識(shí)方法的敘述中所述。另外，作為后述的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)法中使用的標(biāo)識(shí)探針，可以列舉通過(guò)在實(shí)時(shí)檢測(cè)法中通常使用的標(biāo)識(shí)物質(zhì)對(duì)本發(fā)明的探針進(jìn)行了標(biāo)識(shí)的探針。例如，可以列舉5'末端使用報(bào)告熒光物質(zhì)(羧基熒光素(FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)等)標(biāo)識(shí)的，3' 末端使用猝滅劑染料(例如羧基四甲基若丹明(TAMRA)等熒光物質(zhì)、Black Hole Quencher 染料BHQ，4-((4-二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等的非熒光物質(zhì))標(biāo)識(shí)的本發(fā)明的寡核苷酸。作為在本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌的檢測(cè)中使用的試樣，可以列舉人的痰、血液、經(jīng)支氣管采樣等的各種臨床材料。另外，也可以是從樣品中分離培養(yǎng)的培養(yǎng)菌、自它們分離純化的核酸、或通過(guò)核酸擴(kuò)增檢測(cè)體系等被擴(kuò)增的核酸。從上述試樣提取、純化DNA可以依據(jù)從樣品中提取抗酸菌(結(jié)核菌)DNA中使用的常規(guī)方法進(jìn)行。例如在以菌體作為試樣時(shí)，例如可以列舉通過(guò)SDS等表面活性劑或硫氰酸胍 (GTC)等蛋白變性劑處理菌體以破壞結(jié)核菌的膜結(jié)構(gòu)的方法、通過(guò)玻璃珠等物理壓碎菌體的方法等。以痰作為試樣時(shí)，作為前處理，可以通過(guò)美國(guó)疾病管理預(yù)防中心(Centers for Disease Control and Prevention，簡(jiǎn)稱 CDC)推薦的 NALC (N-乙酰 _L_ 半胱氨酸)-NaOH 法(非專利文獻(xiàn)1 進(jìn)行樣品的均質(zhì)化。然后，可以通過(guò)一般的DNA制備法(酚/氯仿提取、乙醇沉淀法等，Rapid and simple method for purification of nucleic acids,J. Clin. Microbiol. , 1990 年 3 月； 28(3) ,495-503, Boom R，Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, ffertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J)進(jìn)行DNA的提取和純化。從樣品中分離、培養(yǎng)的培養(yǎng)菌用作檢測(cè)人型結(jié)核菌的試樣時(shí)的例子有例如收集小川培養(yǎng)基上的菌落，懸浮在滅菌蒸餾水中，離心分離收集菌體后，再懸浮在蒸餾水中，高壓滅菌釜處理后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過(guò)玻璃珠進(jìn)行物理壓碎等)，再離心分離回收上清液。從所得的上清液中可以提取純化DNA。對(duì)于DNA的提取純化，由于市售有各種試劑盒， 因此可以使用這些試劑盒進(jìn)行，也可以根據(jù)該領(lǐng)域中的常規(guī)方法(例如，酚/氯仿提取法、 使用乙醇或異丙醇等使沉淀的方法等)進(jìn)行。例如，可以使用(株)“，‘ > 制離子交換樹(shù)脂類型的DNA提取純化試劑盒Genomic-tip等進(jìn)行DNA的提取、純化。作為本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法，可以列舉將含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、 序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物和/或探針的方法(使用本發(fā)明的引物和/或探針的方法)。例如，使用本發(fā)明的引物，使其與試樣中的核酸雜交，通過(guò)DNA聚合酶等進(jìn)行核酸擴(kuò)增(例如PCR;專利文獻(xiàn)6)使引物延伸，因?yàn)閷?duì)于人型結(jié)核菌，可以使IS6110核酸序列的特異區(qū)域的序列擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)定所得引物延伸物，可以檢測(cè)人型結(jié)核菌。作為本發(fā)明涉及的使用本發(fā)明的引物檢測(cè)人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法的具體例子，可以列舉“人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟(i)使用含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部，或含有其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明的引物)，以試樣中的核酸作為模板進(jìn)行PCR，(ii)對(duì)于上述(i)所得的引物延伸物進(jìn)行電泳，由其結(jié)果判斷有無(wú)人型結(jié)核菌”。在上述方法中使用的本發(fā)明的引物的具體例子如前所述。優(yōu)選地，可以列舉以含有序列號(hào)1或2中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為正向引物，以含有序列號(hào)3或4中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為反向引物。使用上述引物的PCR、及接下來(lái)進(jìn)行電泳法的條件、操作方法等可以參照該領(lǐng)域中通常使用的常規(guī)方法。作為進(jìn)行電泳并由其結(jié)果判斷有無(wú)人型結(jié)核菌的方法，例如可以例舉(a)通過(guò)確認(rèn)目標(biāo)堿基對(duì)數(shù)的引物延伸物部分來(lái)判斷的方法、(b)通過(guò)使用標(biāo)識(shí)探針的雜交來(lái)判斷的
方法等。作為(a)通過(guò)確認(rèn)目標(biāo)堿基對(duì)數(shù)的引物延伸物部分來(lái)判斷的方法，例如可以列舉使用序列號(hào)1所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號(hào)3所述的寡核苷酸作為反向引物， 進(jìn)行PCR后，對(duì)所得的引物延伸物進(jìn)行電泳，對(duì)確認(rèn)有178個(gè)堿基對(duì)部分的試樣判斷為陽(yáng)性的方法。另外，例如也可以是使用序列號(hào)2所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號(hào)4所述的寡核苷酸作為反向引物，進(jìn)行PCR后，對(duì)所得的引物延伸物進(jìn)行電泳，對(duì)確認(rèn)有182個(gè)堿基對(duì)部分的試樣判斷為陽(yáng)性的方法。另外，例如也可以是使用序列號(hào)14所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號(hào)5 所述的寡核苷酸作為反向引物，進(jìn)行PCR后，對(duì)所得的引物延伸物進(jìn)行電泳，對(duì)確認(rèn)有3M 個(gè)堿基對(duì)部分的試樣判斷為陽(yáng)性的方法。作為通過(guò)使用(b)的標(biāo)識(shí)探針的雜交進(jìn)行判斷的方法，例如，可以列舉在進(jìn)行電泳后，對(duì)于所得的電泳部分，進(jìn)行使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)的標(biāo)識(shí)探針與本發(fā)明的核苷酸的雜交， 通過(guò)檢測(cè)該標(biāo)識(shí)探針的標(biāo)識(shí)，確認(rèn)與該標(biāo)識(shí)探針雜交的部分是否存在，以判斷陽(yáng)性的方法。例如，可以列舉以使用序列號(hào)1所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號(hào)3所述的寡核苷酸作為反向引物進(jìn)行PCR的情況為例，PCR后，進(jìn)行電泳，對(duì)于所得的部分，進(jìn)行使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)的標(biāo)識(shí)探針與含有序列號(hào)6中所述的核酸序列的寡核苷酸的雜交，通過(guò)檢測(cè)該標(biāo)識(shí)探針的標(biāo)識(shí)，確認(rèn)與該標(biāo)識(shí)探針雜交的部分是否存在，以判斷陽(yáng)性的方法。另外，使用序列號(hào)2所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號(hào)4所述的寡核苷酸作為反向引物進(jìn)行PCR時(shí)，PCR后，進(jìn)行電泳，對(duì)于所得的部分，進(jìn)行使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)的標(biāo)識(shí)探針與含有序列號(hào)7所述的核酸序列的寡核苷酸的雜交，通過(guò)檢測(cè)該標(biāo)識(shí)探針的標(biāo)識(shí)， 確認(rèn)與該標(biāo)識(shí)探針雜交的部分是否存在，以判斷陽(yáng)性的方法。另外，使用序列號(hào)14所述的寡核苷酸作為正向引物，使用序列號(hào)5所述的寡核苷酸作為反向引物進(jìn)行PCR時(shí)，PCR后，進(jìn)行電泳，對(duì)于所得的部分，進(jìn)行使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)的標(biāo)識(shí)探針與含有序列號(hào)8所述的核酸序列的寡核苷酸的雜交，通過(guò)檢測(cè)該標(biāo)識(shí)探針的標(biāo)識(shí)，確認(rèn)與該標(biāo)識(shí)探針雜交的部分是否存在，以判斷陽(yáng)性的方法。
可以列舉下述例子來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法例如進(jìn)行 PCR以及電泳后，其中PCR使用序列號(hào)2所述的寡核苷酸作為正向引物，序列號(hào)4所述的寡核苷酸作為反向引物，通過(guò)確認(rèn)目標(biāo)堿基對(duì)數(shù)的引物延伸物部分的方法進(jìn)行檢測(cè)，如下所述。首先，根據(jù)前述方法，從應(yīng)該檢出人型結(jié)核菌的試樣中得到純化的DNA試樣。另外，通過(guò)前述的方法，從本發(fā)明涉及的核苷酸，使用DNA合成儀，根據(jù)磷酰胺法，合成序列號(hào) 2所示的序列(以下稱為IS_F6)和序列號(hào)4所示的序列(以下稱為IS_R6)的寡核苷酸。制備含有各0. 2 2. Ομπι 的 IS_F6 和 IS_R6、1. O 4. OmM MgCl2、80mMKCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. 005 0. 2% Triton X-100 (卜'J 卜 > X-100、聚氧乙烯辛苯基醚、rohm-and-haas 公司商品名)、分別為 0. 1 0. 6mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 10 80單位/mL的iTaq DNA聚合酶的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 9)，作為PCR用反應(yīng)液。向PCR用反應(yīng)液中添加Ing純化的DNA試樣使用作PCR用試樣，通過(guò)DNA熱循環(huán)儀，進(jìn)行20-40次PCR。對(duì)PCR后所得的5 μ L反應(yīng)液進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳。接著溴化乙錠染色后，用紫外線檢測(cè)熒光。另外，分子量標(biāo)記也與反應(yīng)液一起遷移，通過(guò)比較相對(duì)遷移程度，計(jì)算出被檢測(cè)的DNA片段的長(zhǎng)度。在使用IS_F6作為正向引物和IS_R6作為反向引物的PCR中，預(yù)測(cè)IS6110的核酸序列中的182個(gè)堿基對(duì)的DNA片段(序列號(hào)7)被復(fù)制。其中，182個(gè)堿基對(duì)的熒光條帶被確認(rèn)的試樣可以判斷為陽(yáng)性。作為本發(fā)明涉及的使用寡核苷酸作為引物的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法的其他實(shí)施方式，可以列舉將本發(fā)明的引物使用前述方法標(biāo)識(shí)的標(biāo)識(shí)引物，進(jìn)行以試樣中的核酸作為模板的PCR，在通過(guò)測(cè)定所得引物延伸物的標(biāo)識(shí)可以檢測(cè)到標(biāo)識(shí)的情況下，判斷人型結(jié)核菌陽(yáng)性的方法。上述方法中，在進(jìn)行PCR后，除去游離的標(biāo)識(shí)引物，測(cè)定引物延伸物的標(biāo)識(shí)，可以檢測(cè)到標(biāo)識(shí)時(shí)，判斷為人型結(jié)核菌陽(yáng)性。作為除去游離的標(biāo)識(shí)引物的方法，可以列舉通過(guò)使核酸沉淀的常規(guī)方法(乙醇沉淀法、使用異丙醇的沉淀法等)使進(jìn)行PCR后所得的反應(yīng)物中的引物延伸物沉淀，然后除去含有未沉淀的游離標(biāo)識(shí)弓I物的上清液的方法。另外，也可以列舉在適當(dāng)?shù)臈l件下，通過(guò)凝膠層析法處理進(jìn)行PCR反應(yīng)所得的反應(yīng)物，分離引物延伸物和游離的標(biāo)識(shí)引物的方法，通過(guò)電泳分離的方法等。對(duì)于本發(fā)明的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法，也可以使用實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)體系(例如參照專利文獻(xiàn)7、專利文獻(xiàn)8的記載)。作為通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)體系的檢測(cè)體系例子，可以列舉實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系。例如，可以在本發(fā)明的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法中使用TaqMan 實(shí)時(shí)PCR法(例如參照專利文獻(xiàn)8的記載)、MGB Eclipse Probe System法(例如參照專利文獻(xiàn)9的記載)、Molecular Beacons Probe Technology 法(例如參照專利文獻(xiàn) 10 的記載)、LUX Fluorogenic Primer 法(Invitrogen Corporation) ^Quenching probe-PCR(QP)法(例如參照專利文獻(xiàn)11的記載)等各種實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)法。更加具體地，通過(guò)使用以FAM標(biāo)識(shí)5'末端，TAMRA標(biāo)識(shí)3'末端的探針的TaqMan 實(shí)時(shí)PCR法(例如參照專利文獻(xiàn)8的記載)，可以高靈敏度且定量地檢測(cè)目標(biāo)的微量的DNA。
S卩，使用含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明的引物)，使用含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào) 4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8中所述的核酸序列的部分或全部或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)的5'末端通過(guò)報(bào)告熒光染料被標(biāo)識(shí)，3'末端通過(guò)猝滅染料被標(biāo)識(shí)的寡核苷酸作為標(biāo)識(shí)探針，試樣中的核酸作為模板，進(jìn)行PCR，通過(guò)檢測(cè)從該標(biāo)識(shí)探針游離的標(biāo)識(shí)物質(zhì)而進(jìn)行的方法。上述TaqMan 實(shí)時(shí)PCR法的原理如下所示?？梢允褂猛ㄟ^(guò)熒光染料(報(bào)告分子) 標(biāo)識(shí)5'末端，猝滅染料標(biāo)識(shí)3'末端的、在目標(biāo)基因的特定區(qū)域雜交的寡核苷酸探針。該探針在通常的狀態(tài)下，通過(guò)猝滅染料抑制報(bào)告分子的熒光。在完全使該熒光標(biāo)識(shí)探針與目標(biāo)基因雜交的狀態(tài)下，從其外側(cè)使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR。如果通過(guò)TaqDNA聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，則熒光標(biāo)識(shí)探針由于該核酸外切酶活性而自5'端水解，報(bào)告染料游離，發(fā)出熒光。實(shí)時(shí)PCR法通過(guò)實(shí)時(shí)地監(jiān)測(cè)該熒光強(qiáng)度，可以正確地測(cè)定模板DNA的初期量。作為本發(fā)明涉及的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系中使用的、通過(guò)熒光染料(報(bào)告分子)標(biāo)識(shí) 5'末端、猝滅染料標(biāo)識(shí)3'末端的探針中使用的探針，可以是前述的本發(fā)明的探針，或由所述探針序列設(shè)計(jì)的探針。例如，可以列舉由序列號(hào)6設(shè)計(jì)的序列號(hào)11所示的序列。另外，作為標(biāo)識(shí)5'末端的報(bào)告熒光物質(zhì)，可以列舉FAM、HEX、TET等，其中優(yōu)選FAM。作為標(biāo)識(shí)3' 末端的猝滅染料，可以列舉TAMRA等熒光物質(zhì)、BHQ、DABCYL等非熒光物質(zhì)，其中優(yōu)選TAMRA。作為本發(fā)明涉及的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系中使用的正向引物的優(yōu)選例子，可以列舉含有序列號(hào)1或2中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸，作為反向引物的優(yōu)選例子，可以列舉含有序列號(hào)3或4中所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸。實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系中所使用的其他的脫氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、 DNA聚合酶等試劑，可以使用在通常的實(shí)時(shí)PCR中所使用的試劑，實(shí)時(shí)PCR技術(shù)除了使用本發(fā)明的引物和探針以外，也可以根據(jù)實(shí)時(shí)PCR的一般方法進(jìn)行。闡述本發(fā)明涉及的通過(guò)實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)體系(TaqMan 實(shí)時(shí)PCR法)檢測(cè)人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法的例子如下所示。首先，根據(jù)前述方法，從可以檢測(cè)人型結(jié)核菌的試樣中制得純化的DNA試樣。另外，使用DNA合成儀，通過(guò)磷酰胺(* ^ * 7 ^ ^卜)法合成序列號(hào)1所示的序列(IS_ F5)、序列號(hào)3所示的序列(IS_R5)的寡核苷酸。另外，自通過(guò)使用IS_F5和IS_R5作為引物進(jìn)行PCR而擴(kuò)增的序列號(hào)6的寡核苷酸設(shè)計(jì)用作探針的序列(序列號(hào)11)，合成該序列的寡核苷酸。通過(guò)常規(guī)方法將報(bào)告染料 FAM鍵合至該寡核苷酸的5'末端，將報(bào)告消光體TAMRA鍵合至該寡核苷酸的3'末端，制得熒光標(biāo)識(shí)探針。使用上述制備的IS_F5作為正向引物，IS_R5作為反向引物，例如如下所示進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。即，制備含有各1 μ M的引物IS_F5和引物IS_R5、100 1 OOOnM熒光標(biāo)識(shí)探針、1.0 4. OmM MgCl2、80mM KCl、500yg/mL BSA、0. 1 %膽酸鈉、0. 005 0. 2% TritonX-100、 分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10 80 單位 /mL 的 iTaq DNA 聚合酶的 IOmM Tris-HCl緩沖液(pH8. 9)，作為反應(yīng)液。向20 μ L反應(yīng)液中加入Ing純化的DNA試樣作為 PCR用試樣，加入到96孔反應(yīng)板的孔中，使用TaqManTMpCR專用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)裝置進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR0反應(yīng)進(jìn)行30 50個(gè)循環(huán)，測(cè)定每次循環(huán)報(bào)告染料的發(fā)光量。在人型結(jié)核菌的判斷中，測(cè)定報(bào)告染料的發(fā)光量時(shí)，可以判斷人型結(jié)核菌陽(yáng)性。另外，在實(shí)時(shí)PCR法中，由于可以制作校正曲線，因此可以制得試樣中的人型結(jié)核菌的基因組DNA的數(shù)目(拷貝數(shù))。另外，由于該數(shù)目與人型結(jié)核菌的數(shù)目成比例，因此也可以得到試樣中的人型結(jié)核菌的數(shù)目。校正曲線的制作方法可以參照實(shí)時(shí)PCR方法中通常進(jìn)行的常規(guī)方法進(jìn)行。例如，使用拷貝數(shù)已知的人型結(jié)核菌的基因組DNA試樣作為標(biāo)準(zhǔn)，制備稀釋系列的濃度(拷貝數(shù))的PCR用DNA試樣。接著，使用各稀釋系列的PCR用DNA試樣，根據(jù)上述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，測(cè)定報(bào)告染料的發(fā)光量。在各個(gè)稀釋系列的PCR用DNA試樣中，繪制相對(duì)PCR的各個(gè)循環(huán)數(shù)(χ軸)測(cè)定的發(fā)光量的測(cè)定值(fouy軸)，制作成擴(kuò)增曲線。接著，選擇發(fā)光量呈指數(shù)函數(shù)地?cái)U(kuò)增的1 部，引入臨界線(Threshold line) (Th)0 Th 和各個(gè)PCR用DNA試樣的擴(kuò)增曲線的交叉點(diǎn)為臨界循環(huán)(Threshold cycle) (Ct)值。接著繪制相對(duì)使用的各個(gè)PCR用DNA試樣的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(χ軸)的Ct值(y軸)，對(duì)應(yīng)各Ct 所得的近似曲線可以作為校正曲線。對(duì)于定量試樣中的人型結(jié)核菌的基因組DNA的數(shù)目(拷貝數(shù))，首先，從可以檢測(cè)人型結(jié)核菌的試樣中分離純化DNA，然后，對(duì)所得的DNA試樣進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，同樣地制作擴(kuò)增曲線。得到在制作校正曲線時(shí)的Th和所得擴(kuò)增曲線交叉的Ct值。通過(guò)將該Ct值應(yīng)用于校正曲線，由此可以獲得試樣中的人型結(jié)核菌的基因組DNA量(拷貝數(shù))。另外本發(fā)明在核酸擴(kuò)增步驟中，可以應(yīng)用利用RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的檢測(cè)法。例如，可以列舉NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)法(專利文獻(xiàn)12)、3SR(自我維持的序列擴(kuò)增)法(專利文獻(xiàn)1 等，其中利用逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶的協(xié)同作用(逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶在協(xié)同地作用的條件下反應(yīng))的特定溫度核酸擴(kuò)增法適用于測(cè)定系統(tǒng)的自動(dòng)化。另外，作為本發(fā)明的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法，可以列舉通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8中所述的核酸序列的部分或全部、或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸(本發(fā)明的寡核苷酸)作為標(biāo)識(shí)探針，使該標(biāo)識(shí)探針與試樣中的核酸雜交，除去游離的標(biāo)識(shí)探針后，檢測(cè)雜交復(fù)合體的標(biāo)識(shí)的方法。具體地，可以列舉例如(a)將本發(fā)明的寡核苷酸結(jié)合在固相載體上，用作捕捉探針，使其與試樣中的核酸雜交，使試樣中的人型結(jié)核菌衍生的核酸固定在固相上的檢測(cè)法 (例如，參照專利文獻(xiàn)15的記載)，(b)使用(a)的捕捉探針和本發(fā)明的標(biāo)識(shí)探針，使其與試樣中的核酸雜交，在固相載體上形成捕捉探針和人型結(jié)核菌衍生的核酸和標(biāo)識(shí)探針的復(fù)合體，進(jìn)行測(cè)定標(biāo)識(shí)探針的夾心試驗(yàn)(例如，參照專利文獻(xiàn)14的記載)的方法等。或者也可以使用(c)使用生物素標(biāo)識(shí)的本發(fā)明的標(biāo)識(shí)探針，與試樣中的核酸雜交后，通過(guò)抗生物素蛋白結(jié)合載體捕捉試樣中的人型結(jié)核菌衍生的核酸的方法。另外，在本發(fā)明的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法中所使用的試劑中，可以使用通常在該領(lǐng)域中所使用的試劑類，例如緩沖劑等穩(wěn)定劑、防腐劑等不會(huì)妨礙共存試劑等的穩(wěn)定性、不會(huì)妨礙PCR或雜交反應(yīng)的試劑。另外，其濃度也適宜選擇通常在該領(lǐng)域中經(jīng)常使用的濃度范圍。如果列舉緩沖液的具體例子，完全可以列舉例如三羥甲基氨基甲烷緩沖液、磷酸緩沖液、佛羅那緩沖液、硼酸緩沖液、良好緩沖液(V、y K緩衝液)等在實(shí)施通常的PCR或雜交反應(yīng)時(shí)所使用的緩沖液，其PH也沒(méi)有特別的限制，通常優(yōu)選5 9。另外，根據(jù)需要，可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)、對(duì)應(yīng)酶的基質(zhì)(dNTP、rNTP等)、或者雙鏈嵌入劑(溴化乙錠、SYBR Green等)或者FAM或 TAMRA等標(biāo)識(shí)檢測(cè)物質(zhì)等。作為本發(fā)明涉及的人型結(jié)核菌檢測(cè)用試劑盒，可以列舉“包含含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4或序列號(hào)5所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為引物(本發(fā)明的引物)的人型結(jié)核菌檢測(cè)用試劑盒?！币镆部梢詾橥ㄟ^(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)的引物。上述試劑盒還可以包含使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)的本發(fā)明寡核苷酸作為標(biāo)識(shí)探針。另外，可以列舉“包含下述組成試劑的試劑盒，(1)含有序列號(hào)1或2所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為正向引物，(2)含有序列號(hào)3或4所述的核酸序列的部分或全部， 或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為反向引物”。 上述試劑盒還可以包含使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)本發(fā)明的寡核苷酸作為標(biāo)識(shí)探針。另外，可以列舉“包含本發(fā)明的寡核苷酸作為探針的人型結(jié)核菌檢測(cè)用試劑盒”。 所述探針也可以使用標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)。組成這些試劑盒的組成試劑的優(yōu)選方式和具體例子如前所述。另外，在本發(fā)明的人型結(jié)核菌的檢測(cè)用試劑盒中，也可以含有例如緩沖劑等穩(wěn)定劑、防腐劑等不會(huì)妨礙共存試劑等的穩(wěn)定性、不會(huì)妨礙PCR或雜交反應(yīng)的試劑。另外，其濃度也可以適合選擇通常在該領(lǐng)域中經(jīng)常使用的濃度范圍。如果列舉緩沖液的具體例子，完全可以列舉例如三羥甲基氨基甲烷緩沖液、磷酸緩沖液、佛羅那緩沖液、硼酸緩沖液、良好緩沖液等在實(shí)施常規(guī)PCR或雜交反應(yīng)時(shí)所使用的緩沖液，其PH也沒(méi)有特別的限制，通常優(yōu)選5 9的范圍。另外，根據(jù)需要，可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等)、對(duì)應(yīng)酶的基質(zhì)(dNTP、rNTP等)、或者雙鏈嵌入劑(溴化乙錠、SYBR Green等)或者FAM或 TAMRA等標(biāo)識(shí)檢測(cè)物質(zhì)等。以下列舉實(shí)施例，更加具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不會(huì)因此而受到任何的限制。 實(shí)施例實(shí)施例1(1)合成結(jié)核菌檢測(cè)用PCR引物使用ABI公司DNA合成儀392型，通過(guò)磷酰胺法，合成序列號(hào)2所示的序列(ACCTCACCTATGTGTCGACC，以下稱為IS_F6)禾Π序列號(hào)4所示的序列 (AACGTCTTTCAGGTCGAGTACG，以下稱為IS_R6)的寡核苷酸。合成方法參照ABI公司手冊(cè)，通過(guò)在55°C下對(duì)寡核苷酸的氨水溶液加熱一晚實(shí)施各種寡核苷酸的脫保護(hù)。接著，通過(guò) Pharmacia公司生產(chǎn)的使用FPLC的陰離子交換柱色譜，對(duì)合成的寡核苷酸純化。(2)制備試樣使用如下所示的細(xì)菌，通過(guò)下述的方法提取、純化DNA，得到DNA試樣。細(xì)菌每一種都有臨床分離株，培養(yǎng)后，通過(guò)菌落的形狀和歷來(lái)的各種生化試驗(yàn)等就可以鑒別出菌種來(lái)。首先，對(duì)于分枝桿菌(MyccAacterium)屬細(xì)菌，使小川培養(yǎng)基上的菌落懸浮在純化水上，高壓滅菌釜處理(120°C · 2個(gè)大氣壓、20分鐘)后，經(jīng)菌體的粉碎處理(通過(guò)直徑 2mm玻璃珠進(jìn)行物理壓碎)，離心分離，得到上清液。由所得的上清液，使用(株)* 7 Y > 制的離子交換樹(shù)脂型DNA提取純化試劑盒Genomic-tip進(jìn)行DNA的提取、純化。另外，對(duì)于大腸桿菌，根據(jù)大腸桿菌的DNA提取方法的常規(guī)方法提取和純化DNA。所得的純化DNA最后配制成Ing/μ L(10mM Tris-HCl緩沖液、ρΗ8. 9)，作為DNA試樣。a 大腸桿菌(Escherichia coli)b 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結(jié)核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝!flif (Mycobacterium gordonae)h:斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)j 內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)(3) PCR使用上述(1)制備的IS_F6作為正向引物，IS_R6作為反向引物，如下所述進(jìn)行 PCR。首先，制備含有各ΙμΜ 的引物 IS_F6 和引物 IS_R6、1. 5mM MgCl2、80mM KCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. TritonX-100 (卜'J 卜 > X-100、聚氧乙烯辛苯基醚、 rohm-and-haas 公司商品名)、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 40 單位 /mL 的 Taq DNA聚合酶(株)二 7 # > ·夕一 >制)的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 9)，作為PCR用
反應(yīng)液。
在20μ L的PCR用反應(yīng)液中添加Ing DNA試樣用作PCR用試樣，通過(guò)MJ Research 公司的DNA熱循環(huán)儀(DNA Engine PCT200)，在下述反應(yīng)條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的PCR。PCR反應(yīng)條件熱變性94°C、0. 5分鐘退火55°C、1分鐘聚合反應(yīng)75°C、0. 5分鐘。(4)檢測(cè)5yL上述(3)所得的PCR后的反應(yīng)液進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳的電學(xué)條件為恒電壓100V，進(jìn)行30分鐘。操作方法和其他條件參照生物實(shí)驗(yàn)說(shuō)明的第2卷， p53-63(秀潤(rùn)社、中山廣樹(shù)著)中所述的一般使用的方法。接著，溴化乙錠染色后，使用UV 樣本攝影裝置FAS-III系統(tǒng)(東洋紡織(株)制)通過(guò)紫外線檢測(cè)熒光。另外，分子量標(biāo)記也與反應(yīng)液一起遷移，通過(guò)比較相對(duì)遷移程度，計(jì)算出被檢測(cè)的DNA片段的長(zhǎng)度。另外， 分子量標(biāo)記使用X174/HaeIII消化(標(biāo)記4、(株)二 7 # > ·夕一 >制)。(5)結(jié)果所得的電泳結(jié)果如圖1所示。在圖1中，各泳道的數(shù)字分別表示分別使用以下的試樣時(shí)的結(jié)果。M4 分子量標(biāo)記(標(biāo)記4)a 大腸桿菌(Escherichia coli)b 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結(jié)核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)j 內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi)m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)通過(guò)使用正向引物IS_F6和反向引物IS_R6進(jìn)行PCR，預(yù)計(jì)IS6110的核酸序列中的182個(gè)堿基對(duì)的DNA片段(序列號(hào)7)被復(fù)制。因此，182個(gè)堿基對(duì)的熒光條帶被證實(shí)則判斷為陽(yáng)性。
由圖1的結(jié)果可以明白使用本發(fā)明的引物IS_F6和引物IS_R6進(jìn)行PCR，結(jié)果僅使用結(jié)核分枝桿菌作為試樣時(shí)(b)可確認(rèn)182個(gè)堿基對(duì)的熒光條帶，可以判斷為陽(yáng)性。與之相反，使用其他的分枝桿菌屬細(xì)菌或其他屬的細(xì)菌即大腸桿菌試樣作為試樣時(shí)(a和c s)，不能證實(shí)相應(yīng)的熒光條帶，完全可以判斷為陰性。如上，通過(guò)在PCR中使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物，判斷可以特異地檢測(cè)人型結(jié)核菌。另外，可以預(yù)期通過(guò)PCR等的核酸擴(kuò)增具有高靈敏度，不必要分離細(xì)菌，就可以直接在檢測(cè)中使用臨床材料，對(duì)人型結(jié)核菌的檢測(cè)最長(zhǎng)也就1日以內(nèi)即可以結(jié)束，而通過(guò)現(xiàn)有的培養(yǎng)細(xì)菌的檢測(cè)方法則需要花數(shù)周時(shí)間在培養(yǎng)上。實(shí)施例2(1)合成結(jié)核菌檢測(cè)用PCR引物使用與實(shí)施例1⑴相同的儀器，在相同的操作下，合成序列號(hào)1所示的序列(TGGGTAGCAGACCTCACCTAT，以下稱為IS_F5)禾Π序列號(hào)3所示的序列 (CGAGTACGCTTTCTTGTTGG,以下稱為 IS_R5)的寡核苷酸。(2)制備試樣使用實(shí)施例1 (2)中所得的DNA試樣。(3) PCR上述(1)制備的IS_F5用作正向引物、IS_R5用作反向引物，如下所述進(jìn)行PCR。首先，制備含有各ΙμΜ 的引物 IS_F5 和引物 IS_R5、1. 5mM MgCl2、80mM KCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. 1% TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和40單位/mL的Taq DNA聚合酶(株)二 ？ # > ·夕一 >制)的IOmM Tris-HCl緩沖液 (pH 8. 9)，作為PCR用反應(yīng)液。向20 μ L的PCR用反應(yīng)液中添加Ing DNA試樣用作PCR試樣，使用與實(shí)施例1 (3) 中使用的相同儀器，在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。(4)檢測(cè)在與實(shí)施例1(4)同樣的方法下，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，通過(guò)紫外線檢測(cè)熒光。(5)結(jié)果所得的電泳結(jié)果如圖2所示。在圖2中，各泳道數(shù)字分別表示分別使用以下試樣時(shí)的結(jié)果。Μ4 分子量標(biāo)記(標(biāo)記4)a 大腸桿菌(Escherichia coli)b 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結(jié)核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f 瘰疬分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)
j 胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi))m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)另外，通過(guò)使用正向引物IS_F5和反向引物IS_R5的PCR，預(yù)計(jì)IS6110的核酸序列中的178個(gè)堿基對(duì)的DNA片段(序列號(hào)6)被復(fù)制。因此，178個(gè)堿基對(duì)的熒光條帶被證實(shí)則判斷為陽(yáng)性。比較例1基于公知的IS6110序列，通過(guò)使用所制備的引物序列的檢測(cè)法(特表平 11-514522號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)11)進(jìn)行人型結(jié)核菌的檢測(cè)。(1)合成結(jié)核菌檢測(cè)用PCR引物特表平11-514522中公開(kāi)的引物序列中，合成“TTCGGACCACCAGCACCTAACC” (序列號(hào)9、以下稱為IS_F2)和“CCTTCTTGTTGGCGGGTCCAG” (序列號(hào)10，以下稱為IS_R2)的寡核苷酸。合成使用與實(shí)施例1(1)同樣的儀器，在同樣的操作下進(jìn)行。(2)制備試樣 使用實(shí)施例1⑵所得的DNA試樣。(3) PCR上述(1)制備的IS_F2用作正向引物、IS_R2用作反向引物，如下所述進(jìn)行PCR。首先，制備含有各ΙμΜ 的引物 IS_F2 和引物 IS_R2、1. 5mM MgCl2、80mM KCl、 500 μ g/mL BSA、0. 膽酸鈉、0. 1% TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和40單位/mL的Taq DNA聚合酶(株)二 ？ # > ·夕一 >制)的IOmM Tris-HCl緩沖液 (pH 8. 9)，作為PCR用反應(yīng)液。向20 μ L的PCR用反應(yīng)液中添加Ing DNA試樣用作PCR用試樣，使用與實(shí)施例1 (3) 中使用的相同儀器，在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。(4)檢測(cè)在與實(shí)施例1(4)同樣的方法下，進(jìn)行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，通過(guò)紫外線檢測(cè)熒光。另外，分子量標(biāo)記使用λ/Hind III消化(標(biāo)記1)(Μ1泳道)或Χ174/ HaeIII消化(標(biāo)記4)(都是(株)二 ？ > ·夕一 >制)。(5)結(jié)果所得的電泳的結(jié)果如圖3-1所示。在圖3-1中，另外，各泳道的數(shù)字分別表示使用各個(gè)以下試樣時(shí)的結(jié)果。Ml 分子量標(biāo)記(標(biāo)記1)
M4 分子量標(biāo)記(標(biāo)記4)a:大腸桿菌(Escherichia coli)b 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，人型結(jié)核菌)c 堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kansasii)d 海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)e 猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)f : 分枝桿菌(Mycobacterium scrofulaceum)g 戈氏分枝桿菌(Mycobacterium gordonae)h 斯氏分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)i 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium)j Ifi ^feff(Mycobacterium intracellulare)k:胃分枝桿菌(Mycobacterium gastri)1 蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopi))m 無(wú)色分枝桿菌(Mycobacterium nonchromogenicum)η 地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)ο 次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)ρ 偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)q 龜分枝桿菌(Mycobacterium chelonei)r 月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)s :peregrinum 分枝桿菌(Mycobacterium peregrinum)另外，預(yù)計(jì)通過(guò)使用正向引物I S_F2、反向引物I S_R2進(jìn)行PCR所復(fù)制的是IS6110 的核酸序列中的197個(gè)堿基對(duì)的DNA片段。因此，197個(gè)堿基對(duì)的熒光條帶被證實(shí)則判斷為陽(yáng)性。如從實(shí)施例2中所得的圖2的結(jié)果可以明白使用本發(fā)明的引物IS_F5、引物IS_ R5時(shí)，僅僅使用人型結(jié)核菌(b)作為試樣時(shí)可以證實(shí)178個(gè)堿基對(duì)的熒光條帶，可以判斷為陽(yáng)性。對(duì)此，在使用其他的分枝桿菌屬細(xì)菌或其他屬細(xì)菌大腸桿菌作為試樣時(shí)(a和c s)，沒(méi)有觀察到相應(yīng)的熒光條帶，完全可以判斷為陰性。另一方面，如從比較例1中所得的圖3-1的結(jié)果可以明白，使用公知的引物IS_F2、 引物IS_R2進(jìn)行PCR時(shí)，可以判斷人型結(jié)核菌作為試樣時(shí)為陽(yáng)性，除此之外，在使用無(wú)色分枝桿菌作為試樣(m)和次要分枝桿菌作為試樣時(shí)(ο)，也可以證實(shí)具有顯著的條帶，這被判斷為假陽(yáng)性。在圖3-1中將使用無(wú)色分枝桿菌作為試樣時(shí)(m)的條帶以虛線圍成的圓表示。 另外，將使用次要分枝桿菌作為試樣時(shí)(ο)的條帶以箭頭指向的虛線圓圈表示。S卩，在比較例1的方法中，判定為難以特異地檢測(cè)人型結(jié)核菌。因此，從比較例1的電泳結(jié)果尤其注意到了被判斷為與人型結(jié)核菌的陽(yáng)性條帶和擴(kuò)增片段大小非常相似的次要分枝桿菌試樣(ο)。圖3-1中箭頭處，尤其顯示了該條帶。為了進(jìn)一步分析該P(yáng)CR產(chǎn)物，在切下遷移部分的PCR產(chǎn)物、進(jìn)行DNA純化后，使用ABI公司的序列試劑盒根據(jù)PCR-直接序列法進(jìn)行序列分析。所得的序列如圖3-2所示。圖3-2所示的序列中，部分(b)的人型結(jié)核菌衍生的 PCR產(chǎn)物的序列作為第一核苷酸序列(1st Nucleotide kquence)，序列表的上段所示(序列號(hào)12)。另外，由部分(ο)所得的次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale)衍生的PCR 產(chǎn)物的序列作為第二核苷酸序列Ond Nucleotide kquence)，序列表的下段所示(序列號(hào) 13)。DNA片段的序列分析結(jié)果證實(shí)了這是次要分枝桿菌(Mycobacterium triviale) 衍生的核酸序列，對(duì)于人型結(jié)核菌特有的IS6110的核酸序列而言，其僅與比較例1使用的引物IS_F2和引物IS_R2的序列部位一致。因此，使用該公知的引物IS_F2、引物IS_R2進(jìn)行PCR時(shí)，發(fā)現(xiàn)人型結(jié)核菌以外的核酸序列也擴(kuò)增，證實(shí)了在引物的設(shè)計(jì)上存在明顯的缺
點(diǎn)ο由上可知使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物，通過(guò)PCR進(jìn)行人型結(jié)核菌的檢測(cè)，與使用現(xiàn)有技術(shù)的引物進(jìn)行結(jié)核菌的檢測(cè)法相比，可以排除假陽(yáng)性的判斷，在特異地且高精度地檢測(cè)人型結(jié)核菌方面，與現(xiàn)有技術(shù)的引物和使用它們的人型結(jié)核菌的檢測(cè)法相比，非常優(yōu)異。實(shí)施例3通過(guò)實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增體系檢測(cè)結(jié)核菌(1)合成結(jié)核菌檢測(cè)用PCR引物使用與實(shí)施例1(1)相同的儀器，在同樣的操作下，合成IS_F5和IS_R5的寡核苷酸。(2)制作結(jié)核菌檢測(cè)用探針由通過(guò)使用IS_F5和IS_R5作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的序列號(hào)6的寡核苷酸序列，設(shè)計(jì)用作探針的序列“ACCGACGCCTACGCTCGCAG”，合成該序列的寡核苷酸(以下稱為IS_ F5R5_FAMTAM。序列號(hào)11)。在該寡核苷酸的5'末端結(jié)合報(bào)告染料FAM，3'末端結(jié)合報(bào)告消光體TAMRA，得到標(biāo)識(shí)的寡核苷酸探針(TaqMan fluorescent probe,applied biosystems japan -^WjfjjlJ )。(3)制備PCR用DNA試樣對(duì)于實(shí)施例1(2)中制備的結(jié)核分枝桿菌試樣所得的DNA試樣，通過(guò)測(cè)定其吸光度測(cè)定試樣中的DNA量。所得的DNA量通過(guò)與已知的結(jié)核分枝桿菌的基因組DNA量比較，確定試樣中的基因組DNA量(基因組拷貝數(shù))。得到IO8個(gè)拷貝/ μ L的基因組DNA。接著使用IOmM ρΗ8· 9 的 Tris-HCl 緩沖液，制備稀釋成 IO5, IO4, IO3, IO2,10，5，2 個(gè)拷貝/ μ L的稀釋系列的DNA試樣作為PCR用DNA試樣。(4)實(shí)時(shí) PCR上述(1)制備的IS_F5用作正向引物，IS_R5用作反向引物，如下所述進(jìn)行實(shí)時(shí) PCR。即，制備含有各IyM的引物IS_F5和引物IS_R5、195nM上述(1)制備的熒光標(biāo)識(shí)探針 IS_F5R5_FAMTAM、1. 5mM MgCl2,80mM KCl、500y g/mL BSA、0. 1 %膽酸鈉、0. 1 % TritonX-100、分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 40 單位 /mL 的 iTaq DNA 聚合酶 (株)二 7 # > · ”一 >制)的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 9)作為反應(yīng)液。向20 μ L反應(yīng)液中添加1 μ L各稀釋系列的DNA試樣作為PCR用試樣，將其加入到 96孔反應(yīng)板(微擴(kuò)增光學(xué)96孔反應(yīng)板、7 7 K 才* ；^〒Λ 1 ” \ ^ >社制)的孔中，使用I^aqManTMpCR專用熱循環(huán)檢測(cè)器(ABI7000、mi卜KJ才〉7歹Λ文” \ )、>社制)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。反應(yīng)在95°C保溫10分鐘后，在95°C反應(yīng)15秒鐘和60°C反應(yīng)1分鐘并循環(huán)進(jìn)行50個(gè)循環(huán)，測(cè)定每次循環(huán)的報(bào)告染料的發(fā)光量。另外，通過(guò)使用測(cè)定時(shí)所用熱循環(huán)儀將供測(cè)定的96孔反應(yīng)板每一板的相對(duì)熒光強(qiáng)度比數(shù)值化的功能求得發(fā)光量。(5)結(jié)果和分析按照實(shí)時(shí)PCR法進(jìn)行的常規(guī)方法制成校正曲線。S卩，對(duì)各PCR用DNA試樣，相對(duì)PCR循環(huán)數(shù)(χ軸)繪制報(bào)告染料的發(fā)光量(to、y 軸)而制作擴(kuò)增曲線。接著，選擇發(fā)光量隨指數(shù)函數(shù)擴(kuò)增的1 部，引出臨界線(Th)。Th和各PCR用DNA試樣的發(fā)光量交叉的點(diǎn)為臨界循環(huán)(Ct)值。接著，相對(duì)使用的各PCR用DNA 試樣的基因組拷貝數(shù)(χ軸、對(duì)數(shù)值)繪制Ct值(y軸)，對(duì)各個(gè)Ct值，所得的近似曲線為校正曲線。所得的校正曲線如圖4所示。y = -3. 555x+39. 13R2 = 0.996由以上可知由于通過(guò)實(shí)時(shí)PCP可以檢測(cè)發(fā)光，那么在PCR中使用本發(fā)明的寡核苷酸作為引物，由該擴(kuò)增區(qū)域的序列設(shè)計(jì)標(biāo)識(shí)引物，通過(guò)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，可以檢測(cè)人型結(jié)核菌。另外，從可以制作校正曲線看出通過(guò)使用本發(fā)明的引物和探針的實(shí)時(shí)PCR法，可以進(jìn)行人型結(jié)核菌的定量。另外，從圖4可以看出在使用本發(fā)明的引物和探針的實(shí)時(shí)PCR 法中，在人型結(jié)核菌基因組DNA的初期量為2個(gè)拷貝的情況下，也可以進(jìn)行人型結(jié)核菌的檢測(cè)。另外，在利用實(shí)時(shí)PCR法時(shí)，由于實(shí)時(shí)地監(jiān)視該熒光強(qiáng)度，可以正確地測(cè)定模板 DNA的初期量，有效地進(jìn)行人型結(jié)核菌的檢測(cè)。實(shí)施例4利用使用多個(gè)引物對(duì)在一支管中同時(shí)地?cái)U(kuò)增多個(gè)片段的多重PCROmiltiplex PCR)反應(yīng)，嘗試進(jìn)行以人型結(jié)核菌、鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)),胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare))和堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii))為對(duì)象的結(jié)核病與非結(jié)核性抗酸菌病(non-tuberculosis Mycobacteriosis，NTM 癥)的同時(shí)診斷(識(shí)別診斷)。(1)引物的合成(i)合成結(jié)核菌檢測(cè)用PCR引物在與實(shí)施例1(1)同樣的操作下，制備IS_F5(序列號(hào)1)和IS_R6 (序列號(hào)4)，分別作為正向引物、反向引物。(ii)合成鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)檢測(cè)用PCR引物在與實(shí)施例1 (1)同樣的操作下，制備特開(kāi)平11-69999號(hào)公報(bào)權(quán)利要求5所述的“鳥(niǎo)19千道爾頓蛋白質(zhì)基因區(qū)域中特異的寡核苷酸引物”MAV19K Fl (CGGCTGTTCGAGTGGCAACAAGTC，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中序列號(hào)15所示。以下稱為“鳥(niǎo)分枝桿菌 (M. avium)檢測(cè)用引物 _Fw” )，和 MAV19K Rl (CCGTCGATGATGACCTTGGTCCC,本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中序列號(hào)16所示。以下稱為“鳥(niǎo)分枝桿菌(Mavium)檢測(cè)用引物_Rv”)，分別作為正向引物和反向引物。(iii)合成胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)檢測(cè)用PCR引物在與實(shí)施例1 (1)同樣的操作下，制備特開(kāi)平11-69999號(hào)公報(bào)權(quán)利要求6所述的 “胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)si基因區(qū)域中特異的寡核苷酸引物”rpslFl (CGGGACAAGGTCGCCAAGGTCAAGA，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中序列號(hào)17所示。以下稱為“胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)檢測(cè)用引物-Fw)，，，和rps IRl (GGGATGTAGGCCGTCACCTCAAC，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中序列號(hào)18所示。以下稱為“胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)檢測(cè)用引物_Rv”，分別作為正向引物和反向引物。(iv)合成堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)檢測(cè)用PCR引物在與實(shí)施例1 (1)同樣的操作下，制備特開(kāi)平11-155589號(hào)中所述的由堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)的KATS2序列所設(shè)計(jì)的引物即圖1所示引物15的、沿5‘方向移動(dòng)1堿基的序列(GTCCCTGGCTGCTCTTGA，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中序列號(hào)19所示。以下稱為“堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)檢測(cè)用引物-Fw) ”，和引物(Primer) E3 (GCTGGTGGAGATGGAGATGTT，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中序列號(hào)20所示。以下稱為“堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)檢測(cè)用引物-Rv”， 分別作為正向引物和反向引物。(2)制備試樣使用實(shí)施例1(2)中所得的人型結(jié)核菌、鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)、胞內(nèi)分枝桿菌 (M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)的 DNA 試樣。(3) PCR制備含有最終濃度為各ΙμΜ的上述(1)合成的正向引物和反向引物、 IOmM Tris-HCl (ρΗ8. 9) U. 5mM MgCl2、80mM KCl、500yg/mL BSA、0. 1 % 膽酸鈉、0. 1 % TritonX-100,分別為 0. 2mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 和 40 單位 /mL 的 iTaq DNA 聚合酶 (二 , ^ ”一 >制)的溶液，作為PCR反應(yīng)用溶液。向20 μ L的PCR用反應(yīng)液中，如下面表1所述分別添加1 μ L (0 1000個(gè)拷貝)DNA 試樣，制備PCR用試樣(1) (7)，對(duì)于各個(gè)試樣，使用與實(shí)施例1(3)中使用的儀器相同的儀器，在同樣的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR。另外，在表1中，avium表示鳥(niǎo)分枝桿菌(M. avium)、 intracellulare ^:7^Ifi ^I^lflii (Μ. intracellulare)、kansasii 7^ Sif^I^lflii (Μ. kansasii)。另外，X分別表示不加DNA試樣的情況，0分別表示加入DNA試樣的情況， 0下0內(nèi)的數(shù)字表示加入的DNA試樣的濃度(拷貝數(shù))。[表 1]
權(quán)利要求
1.由以下組成的人型結(jié)核菌檢測(cè)用引物對(duì)(i)由序列號(hào)2所述的核酸序列或者其互補(bǔ)序列組成的，并且與人型結(jié)核菌的IS6110 基因的核酸序列雜交的引物；和( )由序列號(hào)4所述的核酸序列或者其互補(bǔ)序列組成的，并且與人型結(jié)核菌的IS6110 基因的核酸序列雜交的引物。
2.權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)被標(biāo)識(shí)。
3.權(quán)利要求2所述的引物對(duì)，其中標(biāo)識(shí)物質(zhì)選自放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)或生物素。
4.人型結(jié)核菌檢測(cè)用試劑盒，其包含權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
5.權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中引物通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)。
6.權(quán)利要求4所述的試劑盒，所述試劑盒還包含以由序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)7所述的核酸序列、或者序列號(hào)2、序列號(hào)4或序列號(hào)7所述核酸序列的互補(bǔ)序列組成的，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸作為探針。
7.權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中探針通過(guò)標(biāo)識(shí)物質(zhì)標(biāo)識(shí)。
8.權(quán)利要求4所述的試劑盒，所述試劑盒由以下組合組成由序列號(hào)2所述的核酸序列或其互補(bǔ)序列組成的引物、由序列號(hào)4所述的核酸序列或其互補(bǔ)序列組成的引物、和由序列號(hào)7所述的核酸序列或者其互補(bǔ)序列組成的探針。
9.權(quán)利要求4所述的試劑盒，所述試劑盒由以下組合組成由序列號(hào)2所述的核酸序列或其互補(bǔ)序列組成的引物、由序列號(hào)4所述的核酸序列或其互補(bǔ)序列組成的引物、和由序列號(hào)7所述核酸序列或者其互補(bǔ)序列組成的寡核苷酸的5’末端以報(bào)告色素標(biāo)識(shí)的，3’末端以猝滅劑染料色素標(biāo)識(shí)的標(biāo)識(shí)探針。
全文摘要
本發(fā)明以提供排除診斷上的假陽(yáng)性的新穎的結(jié)核菌檢測(cè)用引物和探針，以及提供使用它們簡(jiǎn)便、迅速并且高靈敏度地檢測(cè)人型結(jié)核菌的方法為課題，涉及含有序列號(hào)1、序列號(hào)2、序列號(hào)3、序列號(hào)4、序列號(hào)5、序列號(hào)6、序列號(hào)7或序列號(hào)8所述的核酸序列的部分或全部，或其互補(bǔ)序列的部分或全部，并且與人型結(jié)核菌的IS6110基因的核酸序列雜交的寡核苷酸；含有所述寡核苷酸的人型結(jié)核菌檢測(cè)用引物和探針；以及以使用該引物和探針為特征的人型結(jié)核菌的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102329880SQ20111031319
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月26日
發(fā)明者石川友一 申請(qǐng)人:和光純藥工業(yè)株式會(huì)社