專利名稱：一種含油微生物混合培養(yǎng)的方法
一種含油微生物混合培養(yǎng)的方法技術領域
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地說涉及一種利用含油酵母與自養(yǎng)產(chǎn)油微藻進行混合培養(yǎng)來獲得高細胞收獲量同時收獲微生物油脂的方法。
技術背景
隨著石油資源的日益緊缺、石油價格的不斷上漲、油品供需矛盾的日漸凸顯及環(huán)境污染問題的更加突出，多渠道開發(fā)可再生油脂資源成為必然。來自微生物油脂的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃燒充分、潤滑性好等性能，還具有可再生、易生物降解、儲運安全、抗爆性能好等特點，可作為石化能源的替代品。
文獻表明，在適宜的條件下，某些微生物生產(chǎn)并貯存的油脂占其生物總量的20% 以上，這類微生物被稱為含油微生物。已知細菌、酵母、霉菌、藻類中都有生產(chǎn)油脂的菌株。 微生物油脂又稱單細胞油脂，其脂肪酸組成與一般的植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸， 如棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等飽和與不飽和的脂肪酸為主。微生物發(fā)酵利用底物范圍較廣，可直接利用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、淀粉和纖維素水解液等。不但可提供新的油脂生產(chǎn)方法，而且可利用廉價廢棄生物質(zhì)，降低油脂生產(chǎn)成本，保護環(huán)境。因此，微生物油脂是潛在的動植物油脂替代資源。具有廣闊的應用前景。
除了含油酵母外，微藻是另外一類含油微生物，微藻富含蛋白質(zhì)、多糖、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分(如螺旋藻)，可用于食品、醫(yī)藥和能源方面；可以大量積累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其體內(nèi)脂肪酸含量可占干重的30% 60%。利用培養(yǎng)微藻來積累油脂資源， 已經(jīng)成為目前利用太陽能開發(fā)可再生資源最熱門的研究領域。不僅具有強大的市場潛力， 而且具有非凡的社會價值。
微生物發(fā)酵油脂的培養(yǎng)與制備方法一般采用酵母菌為發(fā)酵菌種 (CN200610113582. X)，經(jīng)過常規(guī)的微生物培養(yǎng)進行生物量積累，得到含油微生物菌體，進而處理該菌體，得到生物油脂。該技術過程采用單一微生物發(fā)酵培養(yǎng)過程，其生物油脂積累在細胞內(nèi)，細胞收獲量是制約油脂收獲量的關鍵因素。
微藻細胞生長方式分一般為光自養(yǎng)和異養(yǎng)碳源兩種，光自養(yǎng)過程要消耗CO2, CO2 的有效利用吸收，是實現(xiàn)理想培養(yǎng)效果的關鍵，同時存在補充CO2與光合作用產(chǎn)生O2的解吸、排出的問題。劉建國等“微藻規(guī)模培養(yǎng)的管道光生物反應器”(CN200410020978. O)及繆堅人等“一種微藻工業(yè)生產(chǎn)用光合生物反應器系統(tǒng)”(CN03128138. 9)均采用在光生物反應器系統(tǒng)中加入一種裝置方法，來實現(xiàn)CO2的補給，同時也能實現(xiàn)一定的氧解析效果。異養(yǎng)生長過程是利用有機碳源為底物替代自養(yǎng)過程中的CO2來進行微藻生物質(zhì)的積累，細胞生長速度較快，但細胞內(nèi)油脂積累水平缺比較地下。
現(xiàn)有技術中 對于酵母微生物培養(yǎng)生產(chǎn)油脂和自養(yǎng)微藻進行CO2補給和氧解析過程來生產(chǎn)含油微藻生物質(zhì)以獲取油脂等方面都有所涉及，但都是含油微生物各自進行培養(yǎng)， 對于不同類型的含油微生物之間的混合協(xié)同培養(yǎng)方式來實現(xiàn)高效油脂收獲等方面的研究則未見報道。含油微生物培養(yǎng)過程中普遍存在著成本高、微生物細胞累計的慢、油脂含量低等不足。發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種含油酵母與微藻進行混合培養(yǎng)的方法，該方法具有提高微生物細胞收獲量及微生物油脂含量，降低成本，減化培養(yǎng)裝置等優(yōu)點。
一種含油微生物混合培養(yǎng)的方法，包括如下內(nèi)容將經(jīng)一級培養(yǎng)得到的含油酵母種子液和自養(yǎng)微藻種子液分別接入到含有混合培養(yǎng)基的生物反應器內(nèi)進行二級擴大培養(yǎng)， 所述的混合培養(yǎng)基成份以酵母細胞所需基礎培養(yǎng)基為主，同時添加微藻生長所需的無機鹽和微量元素，當擴大培養(yǎng)的含油酵母發(fā)酵液OD值為5-15，微藻發(fā)酵液OD值為2. 0-10時，將含油酵母發(fā)酵液和微藻發(fā)酵液接入到同一生物反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)。
本發(fā)明方法中所述的擴大培養(yǎng)及混合培養(yǎng)條件如下發(fā)酵溫度25°C 30°C ;通氣量O.1 vvm " . O vvm,攪拌轉速100 rpm ^OOrpm, pH 6· 5 7· 5,有機碳源質(zhì)量濃度為1. 0% 2. 0%。
本發(fā)明方法中，混合培養(yǎng)時加入的含油酵母發(fā)酵液和微藻發(fā)酵液可以任何體積混合，優(yōu)選的體積比為2 :1 1:2。
本發(fā)明方法中，酵母包括5 cerevisiae釀酒酵母、Λ glut in is粘紅酵母、 Trichosporon cutaneum皮狀絲孢酵母等。微藻包括小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻、娃藻等。
本發(fā)明方法中，光生物反應器可以是板式、管式、氣升攪拌式等封閉反應器。主要以通入的空氣為返混動力，通入的空氣進入光生物反應器時，優(yōu)選均勻設置多個補充點并在反應器內(nèi)設置擋板，實現(xiàn)均勻的氣體分布。該反應器還設置了培養(yǎng)體系二氧化碳和溶解氧量的測定裝置，根據(jù)需要調(diào)整通氣量，以獲得良好的效果。
本方法中pH控制酸中和劑為HCL、H2SO4, HNO3等常用無機酸，堿中和劑為NaOH、 NaHCO3等無機堿。
本發(fā)明方法中，所述的有機碳源可以是葡萄糖、果糖、淀粉、纖維素水解液等，該有機碳源的加入采用流加補充方式進行，根據(jù)培養(yǎng)液樣品成份分析，隨時檢測系統(tǒng)的有機碳源濃度水平，將配置好的有機碳源母液按消耗速度進行流加。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明一種含油微生物混合培養(yǎng)的方法具有如下優(yōu)點1、一般來說，不同的微生物在同一反應器內(nèi)很難進行混合培養(yǎng)，這不僅是因為不同的微生物其培養(yǎng)條件不同，而且微生物之間也會相互制約，本發(fā)明方法將含油酵母和自養(yǎng)微藻的一級種子培養(yǎng)液分別和混合培養(yǎng)基混合進行二級擴大培養(yǎng)，并將處于一定生長階段的擴大培養(yǎng)含油酵母發(fā)酵液與微藻發(fā)酵液進行混合培養(yǎng)，使含油酵母與自養(yǎng)微藻兩種產(chǎn)油微生物相互兼容性增強，因此能夠更好地在同一反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)；2、本發(fā)明方法中，混合培養(yǎng)過程中處于合適生長期的含油酵母釋放的二氧化碳能夠被自養(yǎng)微藻快速的吸收，兩種含油微生物優(yōu)勢細胞間產(chǎn)生共生的依存關系，建立起穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，實現(xiàn)了兩種含油微生物的高效生長過程，提高了油脂的積累含量，試驗結果表明相同條件下單位干細胞油脂收獲量分別從2. 58g/L提高到5. 12g/L ；3、本發(fā)明方法明顯提高了含油微藻的培養(yǎng)效率及質(zhì)量、大大降低了生產(chǎn)成本，可以為制備生物柴油提供高質(zhì)量的含油微生物原料， 適于工業(yè)應用。


圖1是本發(fā)明一種具體工藝流程示意圖。
其中1-微藻種子，2-酵母種子，3-微藻培養(yǎng)一級反應器，4-酵母培養(yǎng)一級反應器，5-微藻培養(yǎng)二級反應器，6-酵母培養(yǎng)二級反應器，7-混合培養(yǎng)反應器，8-酸堿中和劑， 9-進氣口，10-混合培養(yǎng)尾氣出口。
具體實施方式
下面結合實施例來進一步說明本發(fā)明方法的過程及效果，但不局限于以下實施例。
本方法中，所用培養(yǎng)基的組成如下微藻培養(yǎng)基(以每升計)
權利要求
1.一種含油微生物混合培養(yǎng)的方法，其特征在于包括如下內(nèi)容將經(jīng)一級培養(yǎng)得到的含油酵母種子液和自養(yǎng)微藻種子液分別接入到含有混合培養(yǎng)基的生物反應器內(nèi)進行二級擴大培養(yǎng)，所述的混合培養(yǎng)基成份以酵母細胞所需基礎培養(yǎng)基為主，同時添加微藻生長所需的無機鹽和微量元素，當擴大培養(yǎng)的含油酵母發(fā)酵液OD值為5-15，微藻發(fā)酵液OD值為2. 0-10時，將含油酵母發(fā)酵液和微藻發(fā)酵液加入到同一生物反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的擴大培養(yǎng)及混合培養(yǎng)條件如下發(fā)酵溫度25°C 30°C;通氣量O.1 vvm 1. O vvm，攪拌轉速100 rpm 400rpm，pH 6. 5 7. 5，有機碳源質(zhì)量濃度為1. 09Γ2. 0%。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的混合培養(yǎng)時加入的含油酵母發(fā)酵液 和微藻發(fā)酵液體積比為2 :1 1:2。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的酵母包括釀酒酵母、R. glutinis 粘紅酵母、cutaneum 皮狀絲抱酵母。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的微藻包括小球藻、葡萄藻、小環(huán)藻、娃藻。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的光生物反應器為板式、管式或氣升攪拌式。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的有機碳源為葡萄糖、果糖、淀粉、纖維素水解液，該有機碳源采用流加補充方式進行。
全文摘要
本發(fā)明公開一種含油微生物混合培養(yǎng)的方法，包括如下內(nèi)容將經(jīng)一級培養(yǎng)得到的含油酵母種子液和自養(yǎng)微藻種子液分別接入到含有混合培養(yǎng)基的生物反應器內(nèi)進行二級擴大培養(yǎng)，所述的混合培養(yǎng)基成份以酵母細胞所需基礎培養(yǎng)基為主，同時添加微藻生長所需的無機鹽和微量元素，當擴大培養(yǎng)的含油酵母發(fā)酵液OD值為5-15，微藻發(fā)酵液OD值為2.0-10時，將含油酵母發(fā)酵液和微藻發(fā)酵液加入到同一生物反應器內(nèi)進行混合培養(yǎng)。本發(fā)明方法具有提高微生物細胞收獲量及微生物油脂含量，降低成本，減化培養(yǎng)裝置等優(yōu)點。
文檔編號C12P7/64GK103045491SQ201110313849
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權日2011年10月17日
發(fā)明者王領民, 金平, 李曉姝, 師文靜, 張霖, 王崇輝, 高大成, 喬凱, 黎元生 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院