專利名稱：一株利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別是一株利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌及其發(fā)酵丁醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在化工生產(chǎn)中，丁醇是一種重要的精細化工原料，用途非常廣泛。既可用作溶劑， 生產(chǎn)鄰苯二甲酸二丁酯等增塑劑及丁醛、磷酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯等化學(xué)品，也被作為油脂、藥物和香料的萃取劑。在可替代石油的液體燃料上，丁醇由于具有高能量密度、低親水性、高辛烷值以及不易揮發(fā)等遠遠優(yōu)異于乙醇的特點，因而被認為是適宜替代石油的新一代液體燃料能源。石油能源危機引起了各國對未來能源供應(yīng)不足的普遍關(guān)注，并促使人類尋求可再生的生物基材料來代替石油。因而，利用生物發(fā)酵的方法來生產(chǎn)丁醇獲得了人們的青睞。在丁醇發(fā)酵生產(chǎn)過程中原料成本占了約60-70 %，是生物發(fā)酵丁醇推廣應(yīng)用的瓶頸。生物發(fā)酵丁醇的傳統(tǒng)原料是玉米。玉米是糧食類作物，價格高，而且市場供應(yīng)波動大。開發(fā)非糧、廉價的生物質(zhì)原料是丁醇生物發(fā)酵生產(chǎn)的迫切要求。木薯單位面積的生物產(chǎn)量高于絕大多數(shù)栽培作物，是中國華南地區(qū)栽種的主要作物之一。木薯已是南方地區(qū)酒精發(fā)酵的主要原料。但目前的丁醇發(fā)酵工業(yè)中使用的丁醇發(fā)酵菌株對于木薯原料的利用能力很弱。工業(yè)界和各個研究小組對于新型丁醇發(fā)酵菌株的研究一直沒有中斷。但現(xiàn)有的研究在對木薯的利用上面進展不大。如中國專利申請CN95111733.5公開了一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，其中涉及的產(chǎn)高丁醇梭菌利用玉米作為發(fā)酵原料，可以獲得丁醇的高比例生產(chǎn)。但是這個菌株在木薯為原料的培養(yǎng)基中發(fā)酵能力很弱，丁醇產(chǎn)量不高。而中國專利申請CN101353632A公開了一株丙酮丁醇梭菌及其篩選方法和用途，涉及到一個高丁醇產(chǎn)量的突變菌株的篩選，這個突變體對馬鈴薯淀粉具有高的利用能力。這些研究沒有涉及到利用木薯高產(chǎn)丁醇的菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌，其突出的優(yōu)勢在于以木薯作為原料具有高丁醇的生產(chǎn)能力。這個菌株具有很好的發(fā)酵優(yōu)化和遺傳改造前景，同時也具有重要的工業(yè)應(yīng)用價值。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案達到上述目的提供一株利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCCM 2011觀0，保藏日期2011年8月9日，地址中國武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)內(nèi)。所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以玉米為原料發(fā)酵丁醇中的應(yīng)用，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為含玉米淀粉的培養(yǎng)液。所述的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以木薯為原料發(fā)酵丁醇中的應(yīng)用，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為含木薯淀粉的培養(yǎng)液，所述含木薯淀粉的培養(yǎng)液中的木薯淀粉質(zhì)量百分含量為10%，0. 6g/L硫酸鎂、0. 5g/L的硫酸二氫鉀以及3g/L的醋酸銨。發(fā)酵的溫度為37°C。 本發(fā)明所提供的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1特性在于具有發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的能力。特別是在以木薯淀粉作為原料的發(fā)酵液中具有發(fā)酵丁醇達到 13. 02g/L的能力。
具體實施例方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。1、丙酮丁醇梭菌的分離純化采集自南寧郊區(qū)的植物根系土樣10份。將土樣裝入有IOmL的TYA培養(yǎng)基試管中， 培養(yǎng)基組成葡萄糖40克，牛肉膏2克，酵母膏2克，胰蛋白胨6克，醋酸銨3克，磷酸二氫鉀0. 5克，七水硫酸鎂0. 2克和七水硫酸鐵0. 01克，混合后，在沸水中加熱1分鐘，在厭氧培養(yǎng)箱中于37°C溫度下培養(yǎng)。定期觀察，挑出有氣泡產(chǎn)生的試管，在TYA培養(yǎng)基中加入1.5% 瓊脂，在平板中分離單菌落。單菌落轉(zhuǎn)移到含有質(zhì)量百分比為8%玉米粉培養(yǎng)基進行培養(yǎng)， 挑選出生長和產(chǎn)氣快速的菌株再轉(zhuǎn)移到8%木薯淀粉培養(yǎng)基中培養(yǎng)。從木薯培養(yǎng)基中挑選出一株生長速度快、丁醇產(chǎn)量高的菌株gxaslS-l。對菌株gxasl8-l的16s rDNA的序列分析表明，菌株gxasl8_l與Clostridium acetobutylicumATCC 824 的 16s ribosomal RNA 基因的相似性為 100%，因而 gxas 18-1 菌株為丙酮丁醇梭菌。2、以玉米為原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇將菌株gxas 18-1用TYA培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)M小時，作為發(fā)酵種子液。將發(fā)酵種子液按照體積百分比5%接種到裝有0. 5L質(zhì)量百分含量為10%的玉米粉的培養(yǎng)基的1. 3L發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵，通入氮氣來祛除氧。發(fā)酵溫度為37°C，在IOOrpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵時間為48小時。發(fā)酵液用氣相色譜測定丁醇含量。測定結(jié)果丁醇為11^6g/L，ABE總?cè)軇?17.92g/L03、以木薯為原料發(fā)酵產(chǎn)丁醇將菌株gxas 18-1用TYA培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)M小時，作為發(fā)酵種子液。將發(fā)酵種子液按照體積百分比5%接種到裝有0. 5L質(zhì)量百分含量為10%的木薯粉的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加有0. 6g/L硫酸鎂、0. 5g/L的硫酸二氫鉀以及3g/L的醋酸銨的1. 3L發(fā)酵罐中進行厭氧發(fā)酵，通入氮氣來祛除氧。發(fā)酵溫度為37°C在IOOrpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，發(fā)酵時間為48小時。發(fā)酵液用氣相色譜測定丁醇含量。測定結(jié)果丁醇為13. 07g/L, ABE總?cè)軇?1. 53g/L。在以木薯淀粉為原料的發(fā)酵液中，菌株gxas 18-1的丁醇發(fā)酵量不但大于玉米原料的發(fā)酵量，而且超過了野生型菌株耐受13g/L的丁醇極限。4、丁醇的測定方法氣相色譜檢測條件為樣品前處理12000轉(zhuǎn)/分離心1分鐘，取上清液200微升， 加入等體積(質(zhì)量分數(shù))的正丙醇作為內(nèi)標(biāo);Agilent 6800氣相色譜儀，色譜條件柱溫220°C，載氣N2，流速0. 7毫升/分鐘，壓力7萬帕斯卡，進樣量0. 2微升，檢測器氫火焰檢測器。
丁醇標(biāo)準(zhǔn)品購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，在如上色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間為3. 30分鐘。
權(quán)利要求
1.一株利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1，其特征在于，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M 2011280o
2.權(quán)利要求1所述的利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在發(fā)酵生產(chǎn)丁醇中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以玉米為原料發(fā)酵丁醇中的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基為含玉米淀粉的培養(yǎng)液。
4.權(quán)利要求1所述的利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) gxas 18-1在以木薯為原料發(fā)酵丁醇中的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基為含木薯淀粉的培養(yǎng)液，所述含木薯淀粉的培養(yǎng)液中的木薯淀粉質(zhì)量百分含量為10%， 0. 6g/L硫酸鎂、0. 5g/L的硫酸二氫鉀以及3g/L的醋酸銨，發(fā)酵的溫度為37°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株利用木薯為原料生產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌及其應(yīng)用。該丙酮丁醇梭菌保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，CCTCC M 2011280。這個菌株具有發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的能力，特別是在以木薯為原料的發(fā)酵培養(yǎng)基中丁醇的發(fā)酵量可以達到13.07g/L。
文檔編號C12N1/20GK102417888SQ20111031536
公開日2012年4月18日 申請日期2011年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月17日
發(fā)明者劉春宇, 左文樸, 龐浩, 裴建新, 黃志民, 黃日波 申請人:廣西科學(xué)院