專利名稱：微量核酸樣本的文庫制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及微量核酸樣本的文庫制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
新一代測序技術(shù)(NGS)改變了以往對DNA/RNA樣本的分析模式，幾乎成為所有研究領(lǐng)域中必不可少的研究工具。新一代測序技術(shù)是通過對上百萬條DNA短片段的同時的平行測序，使得在短時間內(nèi)就能夠完成每個堿基的測序，且成本大幅度降低。NGS技術(shù)在很多方面得到應(yīng)用，如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、表觀基因組學(xué)、臨床診斷等。目前市場上新一代測序技術(shù)NGS平臺有好幾種，包括Illumina公司的GenomeAnalyzer、Hiseq、Miseq 系列測序平臺，Roche 公司的 454 測序平臺，Life Technologies 公司的SOLID測序平臺、Ion Torrent測序平臺等等。但是無論何種NGS平臺，在測序前都需對DNA/RNA樣本進行處理，制備成DNA片段文庫。通常情況下，文庫的制備需要微克級的起始DNA/RNA量，雖然經(jīng)優(yōu)化可以將建庫起始量降低，但對于單細(xì)胞或極微量的核酸樣本，仍無法直接進行文庫制備，因此嚴(yán)重阻礙了對單細(xì)胞和微量核酸測序的應(yīng)用。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)針對單細(xì)胞和微量核酸樣本的文庫構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對微量核酸樣本進行文庫制備的 方法和用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種使用上述方法的試劑盒及其用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備核酸文庫的方法，包括步驟a.提供一待測樣本，所述樣本含有的核酸總量為2皮克 I微克；b.對待測樣本進行D0P-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR)擴增，獲得第一 PCR擴增產(chǎn)物；C.用DOP-Amp弓I物對第一 PCR擴增產(chǎn)物進行第二次PCR擴增，獲得第二 PCR擴增產(chǎn)物；d.對獲得的第二 PCR擴增產(chǎn)物進行接頭連接PCR (adaptor-1 igation PCR)，獲得第三PCR擴增產(chǎn)物，即為核酸文庫。在另一優(yōu)選例中，所述的第三PCR擴增產(chǎn)物的5'端具有接頭，且3'端具有接頭。在另一優(yōu)選例中，還包括步驟(e):對第三PCR擴增產(chǎn)物依據(jù)片段大小進行選擇。在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中所述的樣本選自下組1-200個單細(xì)胞構(gòu)成的樣本，或含有1-200個單細(xì)胞的核酸樣本，或核酸總含量為2皮克 I微克的核酸樣本。在另一優(yōu)選例中，所述樣本選自下組
微量基因組DNA、免疫共沉淀產(chǎn)物DNA、游離DNA、cDNA、或其組合。 在另一優(yōu)選例中，所述DNA來自環(huán)境，更佳地，來自土壤和/或水體。在另一優(yōu)選例中，所述DNA來自體液或排泄物，更佳地，來自血漿和/或尿液。在另一優(yōu)選例中，所述的DNA經(jīng)化學(xué)或物理方法處理，更佳地，經(jīng)亞硫酸氫鹽處理。在另一優(yōu)選例中，步驟(b)使用帶有簡并寡核苷酸區(qū)的DOP引物對樣本DNA進行隨機擴增。在另一優(yōu)選例中，所述的DOP引物具有位于5'端的非簡并寡核苷酸區(qū)和位于中部的簡并寡核苷酸區(qū)和3'端的錨定區(qū)；或者位于5'端的非簡并寡核苷酸區(qū)和位于中部和3'端的簡并寡核苷酸區(qū)。在另一優(yōu)選例中，所述DOP引物的3'端錨定區(qū)的序列長度為2-12個核苷酸，較佳地4-8個核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述DOP引物的3'端錨定區(qū)任選自下組TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT。在另一優(yōu)選例中，所述DOP引物的5'端非簡并寡核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示,或與SEQ ID NO : 2所示序列的同源性彡50%。在另一優(yōu)選例中，所述的DOP引物的Y端非簡并寡核苷酸長度為5_30bp，較佳地5-20bp，更佳地 6-13bp 。在另一優(yōu)選例中，所述的簡并寡核苷酸序列如(N)m所示，其中每個堿基位置上的N包括A、T、G和C，m為3-20的正整數(shù)。在另一優(yōu)選例中，，步驟(C)所述的DOP-Amp引物與步驟(b)所述的5’端非簡并寡核苷酸互補或基本上互補。在另一優(yōu)選例中，DOP-Amp引物序列結(jié)合于DOP引物5’端非簡并寡核苷酸區(qū)。在另一優(yōu)選例中，DOP-Amp引物序列如SEQ ID NO 2所示。在另一優(yōu)選例中，步驟(d)用接頭引物進行接頭連接PCR擴增。在另一優(yōu)選例中，所述的接頭引物為P5和P7，且P5和P7的3’端都具有可結(jié)合于DOP-Amp引物序列的非簡并寡核苷酸區(qū)，所述的非簡并寡核苷酸區(qū)的序列與SEQ ID NO 2所示序列相同或完全互補,或者與SEQ ID NO :2所示序列有> 80%的同源性。在另一優(yōu)選例中，所述的接頭引物P7還具有標(biāo)簽(barcode或index)序列。在另一優(yōu)選例中，步驟(e)中所述的依據(jù)片段大小進行選擇為在第三PCR擴增產(chǎn)物中選擇IOO-1OOObp長度的片段。在另一優(yōu)選例中，所述的依據(jù)片段大小進行選擇為在第三PCR擴增產(chǎn)物中選擇200-500bp長度的片段。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種檢測微量核酸樣本中核苷酸序列的方法，包括步驟(i)對于所提供的單細(xì)胞及微量核酸樣本，用本發(fā)明第一方面任一所述的方法制備所述樣本的核酸文庫；(ii)對所述核酸文庫中的片段進行測序和數(shù)據(jù)分析。在另一優(yōu)選例中，所述的測序為第二代高通量測序法，更佳地，所述第二代高通量測序法選自下組Roche454 FLX、Illumina Solexa或ABI SOLID測序平臺。在另一優(yōu)選例中，所述的測序包括步驟將需要測序的核酸文庫與測序芯片(flow cell)上固定的測序探針進行雜交，并進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用“邊合成-邊測序”法進行測序，獲得樣本中核苷酸序列信息。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種可用于本發(fā)明第一方面和第二方面任一方法的試劑盒，所述試劑盒包括(I)第一容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第一 PCR擴增的DOP引物；(2)第二容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第二 PCR擴增的DOP-Amp引物；(3)第三容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第三PCR擴增的接頭連接引物；(4)說明書。在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括用于進行PCR擴增所需的試劑、用于核酸純化的試劑、用于進行高通量測序的測序芯片(flow cell)、或其組合。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1顯示一個典型的構(gòu)建文庫及測序的流程示意圖。圖2顯示用DOP-PCR方法制備單細(xì)胞基因組DNA文庫接頭連接PCR產(chǎn)物的電泳圖。圖3顯示四個樣本(YH1，YH2，YH3，T21)的接頭連接PCR產(chǎn)物經(jīng)片段選擇和純化后，進行片段檢測的結(jié)果。圖3A為樣本YHl檢測結(jié)果，需要的主帶位于377bp ;圖3B為樣本YH2檢測結(jié)果，需 要的主帶位于326bp ;圖3C為樣本YH3檢測結(jié)果，需要的主帶位于339bp ;圖3D為樣本T21檢測結(jié)果，需要的主帶位于360bp。圖4顯示用DOP-PCR方法制備微量核酸樣本(IP產(chǎn)物DNA，Plasma DNA, cDNA，gDNA)的接頭連接PCR產(chǎn)物電泳膠圖。圖5顯示用DOP-PCR方法制備微量DNA/cDNA樣本的文庫，經(jīng)片段選擇和純化后片段檢測的結(jié)果。圖5A為微量基因組DNA-200pg檢測結(jié)果，圖5B為微量基因組DNA_40pg檢測結(jié)果，圖5C為免疫沉淀(IP)DNA-200pg檢測結(jié)果，圖K)為免疫沉淀(IP)DNA_40pg檢測結(jié)果，圖5E為cDNA-原濃度檢測結(jié)果，圖5F為cDNA-5-l檢測結(jié)果，圖5G為血漿游離DNA_200pg檢
測結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次建立了一種對微量核酸樣本進行文庫制備的方法。用DOP引物對樣本中的DNA進行第一次擴增，DOP引物序列具有至少Y端的非簡并的核苷酸區(qū)和簡并核苷酸區(qū)；用DOP-Amp引物對第一 PCR產(chǎn)物進行第二次擴增，獲得第二PCR擴增產(chǎn)物；對第二 PCR擴增產(chǎn)物進行接頭連接PCR，獲得第三PCR擴增產(chǎn)物，第三PCR擴增產(chǎn)物的兩端帶有測序接頭，即為核酸文庫。對文庫進行片段大小選擇和高通量測序，能得到樣本中疾病相關(guān)的基因信息術(shù)語如本文所用，術(shù)語“含有”包括“具有(comprise) ”、“基本上由...構(gòu)成”和“由..·構(gòu)成”。如本文所用，術(shù)語“以上”和“以下”包括本數(shù)，例如“ 80 %以上“指彡80 %，“ 2 %以下”指彡2%。DOP-PCR(Degenerate Oligonucleotide Primed PCR)DOP-PCR簡并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)是一種對微量DNA或單細(xì)胞進行擴增的方法，包括(但不限于)低嚴(yán)謹(jǐn)度預(yù)擴增和高嚴(yán)謹(jǐn)度擴增兩個步驟。低嚴(yán)謹(jǐn)度擴增基于簡并寡核苷酸引物進行，目的是在DNA片段加上了一段固定序列作為PCR引物結(jié)合區(qū)；再用DOP-Amp弓I物對低嚴(yán)謹(jǐn)度擴增產(chǎn)物進行高嚴(yán)謹(jǐn)度擴增。所述的簡并寡核苷酸引物至少包括兩部分，從5’到3’分別為5’端非簡并核苷酸區(qū)及其下游的簡并引物區(qū)。在另一優(yōu)選例中，DOP引物序列如SEQ ID N0:1所示GCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNN，其中，GCTCTTCCGATCT 為 5’ 端的非簡并核苷酸區(qū)，NNNNNNNNNN為簡并序列區(qū)，簡并序列可記為(N)m，m為任選自3-20的正整數(shù)，N獨立地任選自A、T、G和C。在一個優(yōu)選例中，DOP引物序列還包括3’端錨定序列，如“TG”，“ATGTGG”，“TGTGG”，“GTCT”等。用簡并寡核苷酸引物對樣本進行擴增，獲得第一 PCR產(chǎn)物。所述的DOP-Amp引物序列與DOP引物的5’端非簡并核苷酸區(qū)基本上互補，在一個優(yōu)選例中，DOP-Amp引物序列 與5’端非簡并核苷酸區(qū)相同或完全互補或至少覆蓋了 5’端特定核苷酸序列的50%區(qū)域或與5’端特定核苷酸序列有> 80%同源性。在另一優(yōu)選例中，DOP-Amp 引物序列如 SEQ ID NO 2 所示:5，-GCTCTTCCGATCT-3’。用 DOP-Amp 引物對第一PCR產(chǎn)物進行擴增，獲得第二 PCR產(chǎn)物。將擴增獲得的第二 PCR產(chǎn)物直接進行電泳或檢測濃度，也可以制備成質(zhì)粒進行Sanger法測序，也可以用來進行后續(xù)建庫。引物如本文所用，術(shù)語“引物”指的是能與模板互補配對，在DNA聚合酶的作用合成與模板互補的DNA鏈的寡聚核苷酸的總稱。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸，引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)與模板上一條鏈上的一個特殊的序列互補。引物必須與模板上的一條鏈充分互補才能開始延伸，但引物的序列不必與模板的序列完全互補。t匕如，在一個3’端與模板互補的引物的5’端加上一段與模板不互補的序列，這樣的引物仍大致上與模板互補。只要有足夠長的引物能與模板充分的結(jié)合，非完全互補的引物也可以與模板形成引物-模板復(fù)合物，從而進行擴增。在本發(fā)明中，引物包括(但不限于)簡并引物、DOP-Amp引物、接頭引物。簡并引物為(N)m，m為任選自3-20的正整數(shù)，N任選自A、T、G和C，能夠通過堿基互補配對與樣本隨機結(jié)合，對樣本進行隨機片段化的擴增。DOP-Amp引物能與簡并寡核苷酸引物的特定核苷酸序列基本上互補，對簡并引物擴增的產(chǎn)物進一步擴增。接頭引物特異性識別DOP-Amp引物擴增產(chǎn)物的兩端，得到5’端和3’端分別為特異接頭的、可用于進一步測序的產(chǎn)物。接頭連接PCR(Adaptor-Ligation PCR)接頭連接PCR (Adaptor-Ligation PCR)是指在PCR同時將接頭加到模板DNA片段兩端，此處的“接頭”為高通量測序文庫的接頭序列。接頭引物是接頭連接PCR的重要組成部分。在一個優(yōu)選例中，接頭引物包括(但不限于)P5接頭引物和P7接頭引物。所述的P5接頭引物具有如SEQ ID NO :3所示的序列AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ;P7具有SEQ ID NO :4_7所示的任一序列；CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中 XXXXXX 為標(biāo)簽(barcode)序列，標(biāo)簽(barcode)用于區(qū)分不同的樣本。P5接頭和P7接頭具有結(jié)合測序平臺Flow cell,用于測序的序列。高通量測序基因組的“再測序”使得人類能夠盡早地發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)基因的異常變化，有助于對個體疾病的診斷和治療進行深入的研究。本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？梢圆捎萌N第二代測序平臺進行高通量測序454 FLX(Roche 公司)、Solexa Genome Analyzer (IIIumina 公司)和Applied Biosystems公司的SOLID等。這些平臺共同的特點是極高的測序通量,相對于傳統(tǒng)測序的96道毛細(xì)管測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列，根據(jù)平臺的不同，讀取長度從25bp到450bp不等，因此不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取IG到14G不等的堿基數(shù)。其中，Solexa高通量測序包括DNA簇形成和上機測序兩個步驟PCR擴增產(chǎn)物的混合物與固相載體上固定的測序 探針進行雜交，并進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用“邊合成-邊測序法”進行測序,從而得到樣本中疾病相關(guān)核酸分子的核苷酸序列。DNA簇的形成是使用表面連有一層單鏈引物(primer)的測序芯片(flow cell),單鏈狀態(tài)的DNA片段通過接頭序列與芯片表面的引物通過堿基互補配對的原理被固定在芯片的表面，通過擴增反應(yīng)，固定的單鏈DNA變?yōu)殡p鏈DNA，雙鏈再次變性成為單鏈，其一端錨定在測序芯片上，另一端隨機和附近的另一個引物互補從而被錨定，形成“橋”;在測序芯片上同時有上千萬個DNA單分子發(fā)生以上的反應(yīng)；形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴增引物，在擴增芯片的表面再次擴增，形成雙鏈，雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次成為橋，稱為下一輪擴增的模板繼續(xù)擴增；反復(fù)進行了 30輪擴增后，每個單分子得到1000倍擴增，稱為單克隆的DNA 簇。DNA簇在Solexa測序儀上進行邊合成邊測序，測序反應(yīng)中，四種堿基分別標(biāo)記不同的熒光，每個堿基末端被保護堿基封閉，單次反應(yīng)只能加入一個堿基，經(jīng)過掃描，讀取該次反應(yīng)的顏色后，該保護集團被除去，下一個反應(yīng)可以繼續(xù)進行，如此反復(fù)，即得到堿基的精確序列。在Solexa多重測序(Multiplexed Sequencing)過程中會使用Index(標(biāo)簽orbarcode)來區(qū)分樣品，并在常規(guī)測序完成后，針對Index部分額外進行7個循環(huán)的測序，通過Index的識別，最多可以在I條測序甬道中區(qū)分12種不同的樣品。本發(fā)明提供了一種制備單細(xì)胞及微量核酸的文庫的方法，所述方法包括(但不限于)下述步驟1.獲得樣本；2.對樣本 DNA 進行 DOP-PCR ;3.對 DOP-PCR 擴增產(chǎn)物進行 Adaptor-Ligation PCR ；PCR產(chǎn)物經(jīng)片段大小選擇和純化，片段大小選擇及純化是指選取一定大小范圍的DNA片段，并進行純化，片段大小選擇的方法可以是在瓊脂糖凝膠電泳后切取一定大小范圍的DNA片段膠塊，進行回收純化，純化后即得到由單細(xì)胞及微量核酸制備的文庫。在另一優(yōu)選例中，還可以對所述文庫進行測序，較佳地使用高通量測序。本發(fā)明一個典型的流程示意圖見圖1。試劑盒本發(fā)明還提供了一種用于微量核酸樣本的文庫制備的試劑盒，所述試劑盒包括(I)第一容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第一 PCR的DOP引物；(2)第二容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第二 PCR的DOP-Amp引物；(3)第三容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第三PCR的接頭連接引物；(4)說明書。在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，試劑盒還包括用于進行PCR擴增所需的試劑、用于核酸純化的試劑、用于進行高通 量測序的測序芯片(flow cell)、或其組合。本發(fā)明的主要優(yōu)點包括1.通過DOP引物對樣本中的DNA進行第一次擴增，能夠全面覆蓋樣本的DNA片段；2. DOP引物序列具有至少5'端的非簡并核苷酸區(qū)及其下游的簡并寡核苷酸區(qū)，獲得的擴增產(chǎn)物帶有特定的核苷酸序列，加入DOP-Amp引物，能夠?qū)︻A(yù)擴增產(chǎn)物進行第二次擴增，且第二次擴增為高嚴(yán)謹(jǐn)性擴增，大大提高靈敏度；3.第三次PCR中使用接頭接頭連接引物在片段兩端加入接頭，可以直接用于下一步測序；4.可以同時對多個樣品建庫和檢測，且沒有熒光背景的干擾；5.不受物種的限制，人、動物、微生物、植物等都可以進行個體式建庫和檢測；6.試驗費用低，靈敏度高、精確度高、重復(fù)性好。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例1DOP-PCR方法制備單細(xì)胞基因組DNA文庫本實施例以血液中的單個淋巴細(xì)胞為例，借助DOP-PCR的方法制備單細(xì)胞基因組DNA文庫。1.樣本來源血液單細(xì)胞樣本分別來自于一個正常人(YH，炎黃計劃樣本)和一個唐氏綜合癥患者(T21)的外周血。2.單細(xì)胞分離
用口吸管方法共分離出3個YH和I個T21外周血單個淋巴細(xì)胞，置于含2 μ I堿性細(xì)胞裂解液(200mM KOH, 50mM DTT)的PCR管中，_80°C凍存30分鐘以上。3.第一次PCR (低嚴(yán)謹(jǐn)度擴增，DOP預(yù)擴增):DOP預(yù)擴增將含單細(xì)胞的PCR管于65°C處理15分鐘，之后加入DOP反應(yīng)液進行DOP預(yù)擴增反應(yīng)。本實施例以pfx DNA聚合酶進行擴增。DOP反應(yīng)體系見表I。表權(quán)利要求
1.一種制備核酸文庫的方法，其特征在于，包括步驟 a.提供一待測樣本，所述樣本含有的核酸總量為2皮克 I微克； b.對待測樣本進行DOP-PCR擴增，獲得第一PCR擴增產(chǎn)物；c.用DOP-Amp弓I物對第一PCR擴增產(chǎn)物進行第二次PCR擴增，獲得第二 PCR擴增產(chǎn)物；d.對獲得的第二PCR擴增產(chǎn)物進行接頭連接PCR，獲得第三PCR擴增產(chǎn)物，即為核酸文庫； 較佳地，所述的第三PCR擴增產(chǎn)物的5'端具有接頭，且3'端具有接頭。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括步驟(e) 對第三PCR擴增產(chǎn)物依據(jù)片段大小進行選擇。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述的樣本選自下組 1-200個單細(xì)胞構(gòu)成的樣本，或 含有1-200個單細(xì)胞的核酸樣本，或 核酸總含量為2皮克 I微克的核酸樣本； 較佳地，所述樣本選自下組微量基因組DNA、免疫共沉淀產(chǎn)物DNA、游離DNA、cDNA、或其組合； 或所述DNA具有選自下組的一個或多個特征 所述DNA來自環(huán)境，更佳地，來自土壤和/或水體； 所述DNA來自體液或排泄物； 所述DNA來自來自血漿和/或尿液； 所述DNA經(jīng)化學(xué)或物理方法處理； 所述DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(b)使用帶有簡并寡核苷酸區(qū)的DOP引物對樣本DNA進行隨機擴增； 所述的DOP引物具有選自下組的一個或多個特征 所述的DOP引物具有位于5'端的非簡并寡核苷酸區(qū)和位于中部的簡并寡核苷酸區(qū)和3'端的錨定區(qū)； 所述的DOP引物具有位于5'端的非簡并寡核苷酸區(qū)和位于中部和3'端的簡并寡核苷酸區(qū)； 所述DOP引物的3'端錨定區(qū)的序列長度為2-12個核苷酸； 所述DOP引物的3'端錨定區(qū)的序列長度為4-8個核苷酸； 所述DOP引物的3'端錨定區(qū)任選自下組TG、ATGTGG、TGTGG，或GTCT ； 所述DOP引物的5'端非簡并寡核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示； 所述DOP引物的5'端非簡并寡核苷酸序列與SEQ ID NO :2所示序列的同源性> 50%;所述的DOP引物的5'端非簡并寡核苷酸長度為5-30bp，較佳地5-20bp，更佳地6_13bp ； 所述的簡并寡核苷酸序列如(N) m所示，其中每個堿基位置上的N包括A、T、G和C，m為3-20的正整數(shù)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(c)所述的DOP-Amp引物與步驟(b)所述的5’端非簡并寡核苷酸互補或基本上互補；較佳地，DOP-Amp引物序列結(jié)合于DOP引物5’端非簡并寡核苷酸區(qū)； 或較佳地，DOP-Amp引物序列如SEQ ID NO 2所示。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(d)用接頭引物進行接頭連接PCR擴增； 較佳地，所述的接頭引物為P5和P7，且P5和P7的3’端都具有可結(jié)合于DOP-Amp引物序列的非簡并寡核苷酸區(qū)，所述的非簡并寡核苷酸區(qū)的序列與SEQID NO 2所示序列相同或完全互補，或者與SEQ ID NO 2所示序列有彡80%的同源性； 或優(yōu)選地，所述的接頭引物P7具有標(biāo)簽序列。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(e)中所述的依據(jù)片段大小進行選擇為在第三PCR擴增產(chǎn)物中選擇IOO-1OOObp長度的片段； 較佳地，所述的依據(jù)片段大小進行選擇為在第三PCR擴增產(chǎn)物中選擇200-500bp長度的片段。
8.—種檢測微量核酸樣本中核苷酸序列的方法，其特征在于，包括步驟 (i)對于所提供的單細(xì)胞及微量核酸樣本，用權(quán)利要求1-7任一所述的方法制備所述樣本的核酸文庫； ( )對所述核酸文庫中的片段進行測序和數(shù)據(jù)分析； 較佳地，所述的測序為第二代高通量測序法；更佳地，所述第二代高通量測序法選自下組Roche454 FLX、Illumina Solexa 或 ABI SOLID 測序平臺。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的測序包括步驟 將需要測序的核酸文庫與測序芯片上固定的測序探針進行雜交，并進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；對所述測序簇用“邊合成-邊測序”法進行測序,獲得樣本中核苷酸序列信息。
10.一種可用于權(quán)利要求1-9任一方法的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 (1)第一容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第一PCR擴增的DOP引物； (2)第二容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第二PCR擴增的DOP-Amp引物； (3)第三容器以及位于容器內(nèi)的用于進行第三PCR擴增的接頭連接引物； (4)說明書； 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括用于進行PCR擴增所需的試劑、用于核酸純化的試劑、用于進行高通量測序的測序芯片、或其組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及微量核酸樣本的文庫制備方法及其應(yīng)用，所述方法包括用DOP(Degenerate Oligonucleotide Primed)引物對樣本中的DNA進行第一次擴增，DOP引物序列具有至少5′端非簡并核苷酸區(qū)和3′端簡并核苷酸區(qū)；用DOP-Amp引物對第一PCR產(chǎn)物進行第二次擴增，獲得第二PCR擴增產(chǎn)物；對第二PCR擴增產(chǎn)物進行接頭連接PCR(adaptor-ligation PCR)，獲得第三PCR產(chǎn)物，兩端帶有測序接頭的第三PCR產(chǎn)物即為核酸文庫。所述文庫可以進行片段大小選擇和高通量測序，得到樣本中疾病相關(guān)的基因信息。本發(fā)明還提供一種試劑盒及其在所述微量核酸樣本文庫制備的用途。
文檔編號C12Q1/68GK103060924SQ20111031606
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者殷旭陽, 張春雷, 蔣慧, 張秀清 申請人:深圳華大基因科技有限公司, 深圳華大基因研究院