專利名稱：轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件定性PCR檢測(cè)方法及其衍生產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化事件特異性序列。
背景技術(shù)：
番木瓜環(huán)斑花葉病毒(papaya ringspot virus, PRSV)是為害番木瓜的世界性毀滅病害，一旦受到侵染，便無(wú)法防治，包括清除病株、遷移檢疫控制植株、應(yīng)用殺蟲劑防治昆蟲傳播病毒等措施均不能有效地控制。20世紀(jì)90年代初夏威夷大學(xué)的Fitch等將I5RSV 一種溫和突變體編碼的衣殼蛋白(Coat protein，CP)基因轉(zhuǎn)入番木瓜，獲得抗I3RSV的轉(zhuǎn)基因植株SunUp，并培養(yǎng)出其Fl雜交品種Rainbow，并于1997年經(jīng)美國(guó)FDA組織批準(zhǔn)進(jìn)人商品化生產(chǎn)，番木瓜是第一個(gè)被批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因抗病植物，在美國(guó)廣泛種植。目前在我國(guó)商業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因番木瓜，僅有華南農(nóng)業(yè)大學(xué)李華平教授選育的高抗病毒的轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)一號(hào)”，已于2006年獲得農(nóng)業(yè)部授權(quán)環(huán)境安全證書，并在廣東省廣泛種植。隨著全世界轉(zhuǎn)基因番木瓜研究和實(shí)驗(yàn)的廣泛進(jìn)行，轉(zhuǎn)基因番木瓜及其產(chǎn)品的非法生產(chǎn)和銷售活動(dòng)事件頻頻發(fā)生，其中綠色和平在2008年、2009年、2010年都發(fā)現(xiàn)我國(guó)市場(chǎng)上銷售的國(guó)產(chǎn)木瓜部分均為轉(zhuǎn)基因木瓜，隨后發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)一號(hào)”的生產(chǎn)超出了農(nóng)業(yè)部唯一允許的廣東省，已經(jīng)在海南非法種植。為了切實(shí)監(jiān)督市場(chǎng)上可能存在的轉(zhuǎn)基因番木瓜，維護(hù)我國(guó)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)，加強(qiáng)我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)制度實(shí)行。目前 “華農(nóng)一號(hào)”番木瓜的轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法已經(jīng)有報(bào)道出現(xiàn)，而商業(yè)化最早、流通最廣的轉(zhuǎn)基因番木瓜陽(yáng)-1未見有轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法的報(bào)道。由于PCR法能夠高效的擴(kuò)增低拷貝數(shù)的外源DNA，是核酸現(xiàn)行首選的檢測(cè)方法。針對(duì)PCR方法又分為篩選檢測(cè)、基因特異性檢測(cè)、結(jié)構(gòu)特異性檢測(cè)、轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)。一、 篩選檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因通用的外源基因啟動(dòng)子和終止子為靶序列；二、基因特異性檢測(cè)，由于很多轉(zhuǎn)基因載體使用相同外源基因，比如抗除草劑基因EPSPS、PAT、BAR分別轉(zhuǎn)入大豆、玉米、煙草、小麥、油菜等不同的作物中；三、結(jié)構(gòu)特異性檢測(cè)，是利用外源轉(zhuǎn)入基因原件之間的邊界序列特征，能夠有效鑒定類似基因元件的不同載體序列，而且基因元件序列容易獲得，引物設(shè)計(jì)方便；四、事件特異性檢測(cè)，是以轉(zhuǎn)基因元件之間，其中轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)是以外源基因與植物基因組相連接區(qū)域?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，這樣連接區(qū)域?qū)Σ煌D(zhuǎn)基因株系都是特異的，并且在基因組上是單拷貝，因此該類檢測(cè)方法具有高度的特異性。目前已經(jīng)建立轉(zhuǎn)化體特異性檢測(cè)方法的轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體包括M0N810、M0N863、NK603、T25、TC1507、Btll、Btl76、 GA21、M0N513、M0N1445。經(jīng)過(guò)對(duì)現(xiàn)有專利和其他文獻(xiàn)查閱，尚未發(fā)現(xiàn)任何關(guān)于轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件外源插入載體序列及旁側(cè)序列，也未有此轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法。該P(yáng)CR方法能夠利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1。本發(fā)明首先提供了一種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)DNA片段， 其堿基序列如SEQ. NO. 1所示，由來(lái)源于番木瓜基因組序列的第1至1432堿基和來(lái)源于外源載體序列的第1433至3780個(gè)堿基共同組成。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法，所述方法是根據(jù) SEQ NO. 1 所不的序列(番木瓜 Ckrica papaya L. papaya, pawpaw, tree melon )設(shè)計(jì)特異性引物，PCR反應(yīng)中的正向引物依據(jù)SEQ NO. 1中1-1432個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)，反向引物依據(jù)SEQ NO. 1中1433-3780個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增獲得目的片段，則待測(cè)樣品含有轉(zhuǎn)基因番木瓜陽(yáng)-1轉(zhuǎn)化事件來(lái)源的成分；若擴(kuò)增未獲得目的片段，則待測(cè)樣品不含有轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件來(lái)源的成分。所述特異性引物如下 55-l-F:5， - ACAATCCCTTCTGTCGTGTA-3’ 55-l-R:5， - TCCATAGTTGCCTGACTCCC-3，， 所述目的片段長(zhǎng)度為275 bp。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明首次公布轉(zhuǎn)基因番木瓜陽(yáng)-1轉(zhuǎn)化事件外源插入基因組位點(diǎn)的旁側(cè)序列信
息；
2.本發(fā)明首次確認(rèn)轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件插入位點(diǎn)的旁側(cè)序列總不同堿基的來(lái)源，確定了外源載體序列和番木瓜基因組序列的結(jié)合位點(diǎn)；
3.利用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的序列特征，建立轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性定性PCR檢測(cè)方法；
4.本發(fā)明適用于對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1(包括雜種Fl代和后代)及其衍生產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和標(biāo)識(shí)制度管理。


圖1為轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件插入載體的T-DNA區(qū)域結(jié)構(gòu)圖； 圖2為轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè)電泳其中M-Marker DLlOObp，泳道1 轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)一號(hào)”；泳道2 轉(zhuǎn)基因番木瓜 16-0-1 ；泳道3 轉(zhuǎn)基因玉米Btll ；泳道4 轉(zhuǎn)基因玉米Tcl507 ；泳道5 轉(zhuǎn)基因玉米M0N810 ； 泳道6 轉(zhuǎn)基因玉米M0N863 ；泳道7 轉(zhuǎn)基因玉米T25 ；泳道8 轉(zhuǎn)基因大豆A5M7-127 ；泳道 9 轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12 ；泳道10 科豐6號(hào)；泳道11 :T55_1水稻；12 陰性對(duì)照為非轉(zhuǎn)基因番木瓜；13 提取空白對(duì)照；14 環(huán)境空白對(duì)照。圖3轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件PCR靈敏度檢測(cè)電泳其中M-Marker DLlOObp，泳道1_2、泳道3_4、泳道5_6、泳道7_8、泳道9_10、泳道 11-12，分別為轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1的DNA與非轉(zhuǎn)基因番木瓜DNA溶液按照不同比例混合配成DNA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、5%、1%、0. 5%、0· 1%的樣品。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些試試?yán)齼H用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例1
轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件外源插入旁側(cè)序列克隆 1實(shí)驗(yàn)材料 1.1植物材料
轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜55-1、轉(zhuǎn)基因番木瓜“華農(nóng)一號(hào)”、轉(zhuǎn)基因番木瓜16-0-1、非轉(zhuǎn)基因番木瓜紅妃2號(hào)，本實(shí)驗(yàn)室保存，其余轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻等標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源于農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心。1.2酶與試劑
分子生物學(xué)試劑，如 dNTPs、Taq DNA 聚合酶、10XPCR Buffer、Genome Walker Universal Kit購(gòu)自Takara大連寶生物公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒和PCR產(chǎn)物克隆試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。引物合成和克隆測(cè)序有南京金斯瑞生物科技有限公司完成。其余生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1.3實(shí)驗(yàn)儀器
PCR擴(kuò)增儀5333 德國(guó)Eppendorf公司，核酸電泳儀DYY-8C 北京六一儀器廠，凝膠成像系統(tǒng) Gel Doc XR :BI0-Rad 生產(chǎn)。2實(shí)驗(yàn)方法和過(guò)程 2. 1基因組DNA提取
基因組DNA提取按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19495. 3-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸提取純化方法。2. 2基因組DNA濃度和純度的檢測(cè)
取2. 0 μ L DNA用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并用生物型分光光度計(jì)測(cè)定 DNA濃度和純度，將其用TE稀釋到終濃度為100 ng/yL，-20°C保存?zhèn)溆谩?. 3轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1旁側(cè)序列獲得
Genome Walking也是一種擴(kuò)增已知序列旁側(cè)未知區(qū)域序列的方法，主要步驟為基因組DNA酶切、與接頭連接、進(jìn)行三次巢式PCR擴(kuò)增等。本實(shí)施例采用Genome Walking的方法獲得了轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性序列。具體步驟參照Genome Walker Universal Kit試劑盒說(shuō)明書，本實(shí)施例進(jìn)行了部分改進(jìn)，主要操作步驟如下 2. 3. 1基因組DNA酶切
分別用 Drgi, Pvu II , Stu I，EcoRV, Sca I 和 Sma I 酶切 55-1 基因組 DNA，標(biāo)記為 DLl DL6。酶切體系為基因組 DNA, 25 μ L ； 10 X Buffer, 5 μ L ；內(nèi)切酶，5 μ L ；ddH20 為15 μ L ；總體積為50 UL0 37°C水浴5 h,取出離心管，低速離心10 s，繼續(xù)水浴過(guò)夜。 然后各取3 μ L進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)酶切是否完全。2. 3. 2膠回收產(chǎn)物純化
按照膠回收試劑盒說(shuō)明書純化酶切產(chǎn)物。2. 3. 3 連接
連接反應(yīng)體系純化的酶切產(chǎn)物，6 μ L ；接頭，2 UL5IOX連接Buffer，2 μ L ； T4DNA 連接酶，0.5 uL;ddH20,9. 5 μ L ；總體積為20 μ L?；旌戏磻?yīng)液16°C連接過(guò)夜，然后70°C 變性15 min。
2. 4 PCR 擴(kuò)增
根據(jù)Genome Walker Universal Kit試劑盒說(shuō)明書合成如下引物序列 SP1-5' -TGGCGGTAACAAGAAAGGGA-3‘，SP2-5' -AACTGCATCAGCCGATTATC-3‘， SP3-5’ -TAATGTTCTGCGACGCTCAC-3’。以連接混合液為模板，利用試劑盒提供的引物APl分別和SP1、SP2、SP3進(jìn)行三輪PCR擴(kuò)增，其余PCR反應(yīng)體系組分見表1。表1 PCR反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)DNA片段，其特征在于其堿基序列如SEQ. NO. 1所示，由來(lái)源于番木瓜基因組序列的第1至1432堿基和來(lái)源于外源載體序列的第1433至3780個(gè)堿基共同組成。
2.—種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法，其特征在于根據(jù)SEQ NO. 1 所示的序列設(shè)計(jì)特異性引物，PCR反應(yīng)中的正向引物依據(jù)SEQ NO. 1中1-1432個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)，反向引物依據(jù)SEQ NO. 1中1433-3780個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增獲得目的片段，則待測(cè)樣品含有轉(zhuǎn)基因番木瓜陽(yáng)-1轉(zhuǎn)化事件來(lái)源的成分；若擴(kuò)增未獲得目的片段，則待測(cè)樣品不含有轉(zhuǎn)基因番木瓜陽(yáng)-1轉(zhuǎn)化事件來(lái)源的成分。
3.如權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述特異性引物如下55-l-F:5， - ACAATCCCTTCTGTCGTGTA-3’55-l-R:5， - TCCATAGTTGCCTGACTCCC-3，。
4.如權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法，其特征在于所述目的片段長(zhǎng)度為275 bp。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件特異性PCR檢測(cè)方法，首先涉及一種轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件外源插入載體旁側(cè)DNA片段，其堿基序列如SEQ.NO.1所示，由來(lái)源于番木瓜基因組序列的第1至1432堿基和來(lái)源于外源載體序列的第1433至3780個(gè)堿基共同組成。根據(jù)SEQNO.1所示的序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)待測(cè)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增獲得目的片段，則待測(cè)樣品含有轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1轉(zhuǎn)化事件來(lái)源的成分。本發(fā)明能夠利用普通的PCR儀器、試劑快速準(zhǔn)確鑒別出轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1，適用于對(duì)轉(zhuǎn)基因番木瓜55-1(包括雜種F1代和后代)及其衍生產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和標(biāo)識(shí)制度管理。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102311954SQ201110316550
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月18日
發(fā)明者張華 , 王恒波, 許莉萍, 郭晉隆, 陳如凱, 陳平華, 高三基 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)