專利名稱:一株乳酸乳球菌乳亞種及其在枯萎病防治中的應用的制作方法
技術領域:
本發(fā)明涉及一株乳酸乳球菌乳亞種及其在枯萎病防治中的應用,特別涉及乳酸乳球菌乳亞種抗枯2號及其在防治香蕉枯萎病中的應用。
背景技術:
植物枯萎病是一種世界性的真菌土傳病害,病原菌從根部危害作物,引起維管束病害,造成植株枯死,在植株的整個生長期均可發(fā)病。植物枯萎病會嚴重影響作物的產量,以瓜類枯萎病為例,病田一般減產20% 30%,嚴重的情況下可減產50% 60%,甚至絕產。香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)是破壞香蕉維管束導致植株死亡的毀滅性病害。其病菌腐生能力很強,在土壤中可長期存活。香蕉枯萎病是典型的土傳病害,侵染來源主要是帶菌的吸芽、病株殘體及帶菌土壤。香蕉枯萎病1996年在廣州市開始發(fā)生。近幾年來,該病擴散蔓延速度快,發(fā)病程度逐年加重。2000年全市香蕉發(fā)病面積97. 33 hm2,主要發(fā)生在番禹區(qū)萬頃沙鎮(zhèn);2001年發(fā)病面積377. 33hm2 ;2002年發(fā)病面積1266. 67hm2 ;2003年全市香蕉種植面積11666. 67hm2, 發(fā)病面積3855. 93hm2。廣州市春植蕉香蕉枯萎病在6—7月開始發(fā)病,8—9月病害逐步加重,10—11月為發(fā)病高峰期;秋植蕉發(fā)病高峰期在翌年6月份,植株發(fā)病后死亡率高。香蕉外觀發(fā)病癥狀往往表現(xiàn)在抽蕾期至掛果期,因而容易造成失收,經濟損失較為嚴重。發(fā)病重的蕉田第一年發(fā)病率為10%,第二年發(fā)病率為20% — 30%,第三年發(fā)病率達70%以上,遭此危害的蕉田基本上不能繼續(xù)種植香蕉。目前,主要通過選育抗菌新品種、輪作及最廣泛的化學藥劑防治。選育抗病新品種需要的時間長,得到的抗病品種不一定優(yōu)質、高產,種植的經濟效益低下。輪作同樣受到經濟、土地等因素的影響,難以實現(xiàn)?;瘜W藥劑防治會造成農藥殘留,且防治效果不佳。生物防治枯萎病具有環(huán)境友好,防治效果好等優(yōu)點,越來越受到人們的歡迎。如木霉對多種病菌具有很好的抑制作用;叢枝菌根真菌(AM)可與植株根系建立互惠共生體,選擇性抑制部分病原微生物,減少枯萎病的發(fā)生率,促進植株生產、提高產量、改善品質,提高植株的抗逆性。此外,還有非致病尖孢鐮刀菌,可以誘導植株產生針對枯萎病原菌的抗性,可以減輕枯萎病的影響。但是非致病尖孢鐮刀菌使用不當,則會引起更為嚴重的枯萎病,后果嚴重。江蘇省農業(yè)科學院陳志誼等經過多年生物防治水稻病害的研究獲得了防治水稻紋枯病的效果達50 .0% 81 .0 %的枯草芽孢桿菌B-916菌株,現(xiàn)已在江蘇等地得到廣泛推廣。黑龍江省科學院應用微生物研究所研發(fā)的枯草芽孢桿菌水劑主要防治瓜類及保護地蔬菜枯萎病、立枯病和豆類根腐病,已在黑龍江等地進行推廣應用。目前乳酸乳球菌乳亞種在生產實際中主要應用于如酸奶、硬干酪和軟干酪等乳制品生產上的發(fā)酵環(huán)節(jié)。
國內外均未報導乳酸乳球菌乳亞種可用于枯萎病,特別是香蕉枯萎病的防治。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株乳酸乳球菌乳亞種。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述乳酸乳球菌乳亞種在生物防治香蕉枯萎病中的應用。本發(fā)明的乳酸乳球菌乳亞種(ZaciococcM lactis subsp. Laciis)抗枯2號,于 2011年7月8日送至位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心并登記入冊,保藏號為CCTCC NO :M2011M4,培養(yǎng)物的活性由保藏中心于2011年7月14日檢測完畢,結果為存活。本發(fā)明的菌株,易于培養(yǎng),使用方便,對香蕉枯萎病有很好的防治作用。
圖1是本發(fā)明菌株對香蕉枯萎病的抑制作用效果圖。
具體實施例方式、菌株的篩選
該菌株分離來源于蔥葉,在室內無菌條件下用75%酒精對新鮮蔥葉進行表面消毒,后用鑷子撕下一小塊蔥葉,再將蔥葉放置于NA培養(yǎng)基(其成分如下蛋白胨10g/L、肉膏粉3g/ L、氯化鈉5g/L、瓊脂15g/L、pH7. 3士0. 2)上,放置時蔥的葉肉組織貼于培養(yǎng)基,表面朝上。 后將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng),2天后再進行培養(yǎng)物純化,經過2-3次純化后得到純的單菌株培養(yǎng)物??箍?號的形態(tài)特征
1、菌落表面光滑半透明,邊緣整齊;
2、球狀或卵圓形,有時因細胞伸長而似桿狀。抗枯2號的生理生化特征
1、革蘭氏陽性;
2、厭氧生長試驗呈陽(+)性;
3、接觸酶實驗呈陰(一)性;
4、氧化酶實驗呈陰(一)性
5、明膠液化試驗呈陰(一)性;
6、硝酸鹽還原試驗呈陰(一)性;
7、耐鹽性試驗4%NaCl呈陽(+)性,6. 5%NaCl呈陰(一)性;
8、淀粉水解實驗呈陰(一)性;
9、乳糖、麥芽糖和核糖呈陽(+)性,甘露醇、棉籽糖、蜜二糖和松三糖呈陰(一)性;
10、生長溫度在15°C時呈陰(一)性,37和40°C時呈陽(+)性,50°C時呈陰(一)性;
11、糖醇類發(fā)酵試驗D-葡萄糖和L-阿拉伯糖呈陽性,D-甘露醇、D-木糖和葡萄糖產氣呈陰(一)性;
12、精氨酸水解呈陽(+)性。根據以上形態(tài)特征及生理生化實驗結果,查《伯杰細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定》可知抗枯2號與Zaciococctts lactis subsp. Lactis (乳酸乳球菌乳亞種)最相似??箍?號的分子分類學地位
提取抗枯2號的16S rRNA,測序,其序列如SEQ ID NO 1所示。實序承\(zhòng)與Lactococcus lactis subsp. Lactis (乳酸乳球菌乳亞種)的同源性達99. 9%,是一種乳酸乳球菌乳亞種菌株。抗枯2號的抗枯萎病實驗
在室內無菌條件下將每ml含3. 7\107個乳酸乳球菌乳亞種03^%% lactis subsp. Lacii1S)的菌液涂在NA培養(yǎng)基上,蓋上培養(yǎng)皿自然晾干后,取直徑為0.8cm香蕉枯萎病菌放置于平板中央,并將放置在未涂乳酸乳球菌乳亞種(L^tococcm lactis subsp. Lactis)菌液的NA培養(yǎng)基上的處理作空白對照組。96小時后觀察不同處理組的香蕉枯萎病病原菌的生長情況,并測量其直徑的大小。表1乳酸乳球菌乳亞種(Laciococcws lactis subsp. Laciis )對香蕉枯萎病菌的生長抑制作用
權利要求
1.乳酸乳球菌乳亞種抗枯2號,其保藏號為CCTCCNO :M2011244o
2.權利要求1所述的乳酸乳球菌乳亞種抗枯2號在防治枯萎病中的應用。
3.權利要求1所述的乳酸乳球菌乳亞種抗枯2號在防治香蕉枯萎病中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了乳酸乳球菌乳亞種抗枯2號,其保藏號為CCTCCNOM2011244。該菌株易于培養(yǎng),使用方便,可很好的防治香蕉枯萎病。
文檔編號C12R1/01GK102399716SQ20111031660
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權日2011年10月18日
發(fā)明者廖永林, 張揚, 張振飛, 李燕芳, 肖漢祥 申請人:廣東省農業(yè)科學院植物保護研究所