專利名稱：肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及nifH基因的克隆與表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
白蟻Termite屬于節(jié)肢動(dòng)物門昆蟲綱有翅亞綱等翅目的昆蟲，是較為古老的社會(huì)性害蟲。每年因白蟻危害建筑物和農(nóng)作物所造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)千億美元以上?，F(xiàn)有的殺滅白蟻的藥劑均為化學(xué)藥劑，故都有很大的毒副作用，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。利用生物技術(shù)開發(fā)具有高效、無毒、殘效期長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境影響小的白蟻生物防治劑成為未來白蟻防治劑的主要方向。Termite屬于典型的寡氮營養(yǎng)型生物，其腸道固氮微生物的固氮作用是白蟻體內(nèi)氮素的主要來源。目前，科學(xué)家已從白蟻科、鼻白蟻科、木白蟻科、原白蟻科的部分屬中克隆得到了大量nifH基因序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，同一屬的白蟻腸道共生固氮菌nifH基因具有更近的親緣關(guān)系，不同白蟻腸道共生固氮菌nifH基因多樣性明顯不同。雖然已知白蟻腸道nifH基因具有較高多樣性，但僅有少量的nifH基因能夠被優(yōu)先轉(zhuǎn)錄并表達(dá)出來，大多數(shù)的nifH基因不能被表達(dá)。因此，在白蟻腸道內(nèi)克隆和表達(dá)nifH基因，對(duì)于了解白蟻的固氮機(jī)制和白蟻的生物防治提供新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法。肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法按以下步驟進(jìn)行一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min離心lmin，棄去上清，然后按照TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作方法提取基因組DNA ；二、以步驟一中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因nifH，然后與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH ；三、按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒的操作方法提取重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH和 pET28a質(zhì)粒，然后用EcoR I和Nde I分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T_nifH和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-nifH，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌；四、將含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 在37°C、150r/min的條件下培養(yǎng)16h，獲得培養(yǎng)菌液；五、取200 μ L培養(yǎng)菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 150r/min的條件下培養(yǎng)3h，然后加IPTG (異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)至終濃度為 0. 5mmol/L,在20°C、150r/min的條件下培養(yǎng)2h、3h、4h、5h、過夜，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；六、誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)；其中步驟一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HUB-IV-004，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，它的保藏編號(hào)為 CCTCC NO =M 2011312，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為 2011年9月15日；步驟二中PCR擴(kuò)增所用引物pi的核苷酸序列為5' -GAATTCTCAGGCCGC GTTTTCTTCAG-3 ‘，引物 p2 的核苷酸序列為5‘ -CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3 ‘；步驟二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No. 3所示；步驟四和五中含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為相同的培養(yǎng)基，每IOOOmL由50μ g的卡那霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、 IOgNaCl的和余量的水組成。本發(fā)明利用從白蟻腸道內(nèi)分離出的肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004研究基因nifH的克隆與表達(dá)，了解了白蟻的固氮機(jī)制，開發(fā)了可利用的固氮微生物資源及篩選，對(duì)開發(fā)人畜無毒、環(huán)保的殺白蟻生物藥劑具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。


圖1為本發(fā)明中nifH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M泳道:DNA Marker DL2000, 1泳道HUB-IV-004nifH擴(kuò)增片段；圖2為本發(fā)明中nifH基因在BL21中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析的電泳圖，其中M 泳道蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-6泳道IPTG誘導(dǎo)0h，lh，2h，3h，4h，16h的表達(dá)產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式
，還包括各具體實(shí)施方式
間的任意組合。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法按以下步驟進(jìn)行一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min離心lmin，棄去上清，然后按照TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作方法提取基因組DNA ；二、以步驟一中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因nifH，然后與pMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH ；三、按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒的操作方法提取重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH和 pET28a質(zhì)粒，然后用EcoR I和Nde I分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T_nifH和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-nifH，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌；四、將含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 在37°C、150r/min的條件下培養(yǎng)16h，獲得培養(yǎng)菌液；五、取200 μ L培養(yǎng)菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 150r/min的條件下培養(yǎng)3h，然后加IPTG至終濃度為0. 5mmol/L，在20°C、150r/min的條件下培養(yǎng)2h、3h、4h、5h、過夜，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；六、誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)；其中步驟一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，它的保藏編號(hào)為 CCTCC NO =M2011312，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為 2011年9月15日；步驟二中PCR擴(kuò)增所用引物pi的核苷酸序列為5' -GAATTCTCAGGCCGC GTTTTCTTCAG-3 ‘，引物 p2 的核苷酸序列為5‘ -CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3 ‘；步驟二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQID No. 3所示；步驟四和五中含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為相同的培養(yǎng)基，每IOOOmL由50μ g的卡那霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、 IOgNaCl的和余量的水組成。本實(shí)施方式步驟二中獲得目的基因nifH 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)特異條帶的大小，大小為882bp，條帶清晰、完整，無DNA、RNA等污染，且此片段大小與預(yù)計(jì)的片段條帶大小基本吻合(見圖1)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，其氨基酸序列如SEQ IDNo. 4 所示。本實(shí)施方式步驟六中誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液通過SDS-PAGE分析過程為①、分別吸取誘導(dǎo)表達(dá)2h、3h、4h、5h、過夜的菌液10mL，4°C，12000r/min離心5min收集菌體，加入5mL PBS溶液12000r/min離心5min收集菌體，加入ImL PBS溶液，混勻，得菌體溶液；②、取 13 μ L菌體溶液，加入7 μ L上樣緩沖液，水浴煮沸5min，然后取10 μ L上樣于12% SDS-PAGE 凝膠，電泳完成后，凝膠在考馬斯亮藍(lán)染液中染色3h，再用脫色液脫色2-3次，直至背景透明，用凝膠成像儀分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。本實(shí)施方式步驟六中發(fā)現(xiàn)有特異性條帶(即為目的蛋白)出現(xiàn)，純化后經(jīng)質(zhì)譜分析表明，目的蛋白為固氮酶鐵蛋白，對(duì)其進(jìn)行純化與鑒定(1)將有特異性條帶(即為目的蛋白)從凝膠上切下，經(jīng)胰蛋白酶消化，注入毛細(xì)管中，用0. (ν/ν)流速為5μ L/min的乙酸洗脫5min ；(2)以P印MaplOO C18柱為分離柱，采用梯度洗脫，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定；先用97 %的溶劑A及3 %的溶劑B進(jìn)行洗脫，再用40 %的溶劑A及60 %的溶劑B洗脫，流速為300nL/ min，洗脫60min;溶劑A由0. (ν/ν)的乙酸、3% (ν/ν)乙腈和96.9% (ν/ν)Η20組成，溶劑 B 由 0.1% (ν/ν)的乙酸、96. 9% (ν/ν)乙腈和 3% (v/v)H2O 組成;(3)采用飛行時(shí)間串聯(lián)式質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS/MS分析；聚焦電壓和離子噴霧電壓分別設(shè)定為275ν和2600ν ；(4)采用IDA模式進(jìn)行分析；通過三個(gè)最活躍的離子碰撞誘導(dǎo)解離(CID)獲得m/ Z400-1200的檢測(cè)掃描；每一個(gè)IDA循環(huán)中檢測(cè)和MS/MS質(zhì)譜分析時(shí)間分別為Is和3s ；(5)數(shù)據(jù)庫搜索經(jīng)過膠內(nèi)酶解的肽段樣品，使用QSTAR XL hybrid quadrupole(Q) T0FMS/MS系統(tǒng)進(jìn)行nanoESI_MS/MS分析；所獲得的PMF及蛋白質(zhì)某些特征肽段的MS/MS數(shù)據(jù)，利用MASCOT搜索引擎對(duì)NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(NCBInr)進(jìn)行檢索肽質(zhì)量容忍度為士0. 3Da ；半胱氨酸衍生化、天門冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺作用、甲硫氨酸氧化為可變修飾；最大可容忍一個(gè)胰蛋白酶位點(diǎn)漏切。
具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟二中PCR擴(kuò)增的反
應(yīng)體系如下成分基因組DNA 引物 pi lOmmol/pL 引物 p2 lOmmol/pL IOxjEx Taq Buffer 0.4mmol/L dNTP
MgCl2 2mol/L Ex Taq DNA 聚合酶 5u/pL
ddH20
總體積
用量 0.5|iL 0.5|iL 0.5|iL 2.5|iL 0.5|iL
1.5|iL 0.3 μ
18.7|iL
25.0|iL PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共 35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸IOmin ；4°C保溫。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
如下
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中雙酶切的體系
成分
下
重組質(zhì)粒 pMD18-T-w；/ /、pET28a 質(zhì)粒
內(nèi)切酶 IOx TBuffer 1%BSA (牛血清白蛋白) 總體積
其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟三中連接的體系如
用量 14.0|iL
EcoR I Ι.Ομ ； Nde I Ι.Ομ 2.0|iL 2.0|iL 20.0μ 。
成分
IOxT4 DNA連接酶緩沖液酶切后的pET28a質(zhì)粒
酶切后的重組質(zhì)粒
T4DNA連接酶
無菌水總體積
其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同<
7
用量 1.0|iL 1.0|iL 5.0|iL
1.0|iL 2.0|iL 10.0|iL
權(quán)利要求
1.肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法，其特征在于肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法按以下步驟進(jìn)行一、取3mL肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004的菌液，以12000r/min離心lmin，棄去上清，然后按照TIANGEN公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作方法提取基因組DNA ；二、以步驟一中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因nifH，然后與 PMD18-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH ；三、按照TIANGEN質(zhì)粒小提試劑盒的操作方法提取重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH和pET28a 質(zhì)粒，然后用EcoR I和Nde I分別對(duì)重組質(zhì)粒pMD18-T_nifH和pET28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切， 回收所需目的片段，連接并構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-nifH，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌；四、將含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在 37°CU50r/min的條件下培養(yǎng)16h，獲得培養(yǎng)菌液；五、取200μ L培養(yǎng)菌液加入到20mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、150r/min 的條件下培養(yǎng)3h，然后加IPTG至終濃度為0. 5mmol/L,在20°C、150r/min的條件下培養(yǎng)2h、 3h、4h、5h、過夜，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；六、誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)，即完成肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)；其中步驟一中肺炎克雷伯氏菌HUB-IV-004，它為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HUB-IV-004，屬于克雷伯菌屬(Klebsiella)，它的保藏編號(hào)為 CCTCC NO =M 2011312，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年9月15日；步驟二中 PCR擴(kuò)增所用引物pi的核苷酸序列為5‘ -GAATTCTCAGGCCGCGTTTTCTTCAG-3‘，引物p2的核苷酸序列為5 ‘ -CATATGATGACCATGCGTCAATGCG-3 ‘；步驟二中目的基因nifH的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；步驟四和五中含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為相同的培養(yǎng)基，每 IOOOmL由50 μ g的卡那霉素、IOg的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、IOgNaCl的和余量的水組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法，其特征在于步驟二中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下成分用量基因組DNA0.5|iL引物 pi lOmmol/pL0.5|iL引物 p2 lOmmol/pL0.5|iLIOxjEx Taq Buffer2.5|iL0.4mmol/L dNTP0.5|iLMgCl2 2mol/L1.5μ Ex Taq DNA 聚合酶 5ιι/μ 0.3 μ ddH2018.7|iL總體積25.0|iLPCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min ；94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共35 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸IOmin ；4°C保溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法，其特征在于步驟三中雙酶切的體系如下成分用量重組質(zhì)粒 pMD18-T-w；/ /、pET28a 質(zhì)粒14.0|iL內(nèi)切酶EcoR I 1.0|iL; Nde I Ι.Ομ IOx TBuffer2.0|iL1%BSA (牛血清白蛋白)2.0|iL 總體積20.0|iL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法，其特征在于步驟三中連接的體系如下成分用量IOxT4 DNA連接酶緩沖液1.0|iL酶切后的pET28a質(zhì)粒1.0|iL酶切后的重組質(zhì)粒5.0|iLT4DNA 連接酶1.0|iL無菌水2.0|iL總體積10.0|iL 。
全文摘要
肺炎克雷伯氏菌nifH基因的克隆與表達(dá)方法，它涉及nifH基因的克隆與表達(dá)方法。方法提取肺炎克雷伯氏菌的基因組DNA；PCR擴(kuò)增獲得目的基因nifH，與載體連接，獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-nifH；提取質(zhì)粒，雙酶切后構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-nifH，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得含有質(zhì)粒PET28a-nifH的大腸桿菌；然后接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)菌液；然后加入到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后加IPTG培養(yǎng)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)有特異性條帶出現(xiàn)即完成。本發(fā)明對(duì)開發(fā)人畜無毒、環(huán)保的殺白蟻生物藥劑具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102352364SQ20111031889
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月19日
發(fā)明者張小燕, 趙凱 申請(qǐng)人:黑龍江大學(xué)