專利名稱：利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法
利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法技術領域
本發(fā)明屬于微藻生物技術領域，特別涉及一種利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法。
背景技術：
蝦青素(Astaxanthin)是一種鮮紅色脂溶性色素，屬于酮式類胡蘿卜素。大量實驗表明，蝦青素不但具有獨特的著色功能，而且還表現出超強的抗氧化特性和多種生物活性。由于突出的生理功能，蝦青素在水產及家禽養(yǎng)殖、食品、化妝品、醫(yī)藥等領域具有廣闊的應用前景，因此幾十年來利用各種途徑生產蝦青素一直是國內外普遍關注的熱點問題。
目前蝦青素的規(guī)?；a主要依靠化學手段人工合成，或是從甲殼類動物及其加工后的廢物、紅法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous,即以前的Phaffia rhodozyma)及雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)中提取生物合成的天然奸青素。由于生產技術難度高及菌種和藻種本身的限制，蝦青素的產量有限，遠遠不能滿足市場需求， 這也在一定程度上制約了天然蝦青素的廣泛應用。
小球藻Chlorella zofingiensis合成奸青素的能力自二十世紀90年代報道后引起了廣泛關注，被認為有可能成為新的天然蝦青素工業(yè)來源。1994年，Rise等首次報道了 C. zofingiensis在高光和氮缺乏的協(xié)同作用下,能夠在胞內大量合成并積累奸青素,用以抵御光氧化損傷。隨后，C. zofingiensis的奸青素合成模式、合成途徑、及其合成途徑上關鍵基因的表達調控機制陸續(xù)被報道出來。2005年，Ip和Chen首次發(fā)現了光照不是誘導C. zofingiensis奸青素積累的必要條件,在黑暗條件下C. zofingiensis仍然能以較快的速度合成奸青素，提出了暗異養(yǎng)培養(yǎng)C. zofingiensis生產奸青素的概念,并申請了美國專利(US2005214897-A1)。上述研究進展暗示,雖然小球藻C. zofingiensis和雨生紅球藻 H. pluvialis 一樣同屬單細胞綠藻,但二者的細胞生理生化特性和奸青素合成機制截然不同。因此，C. zofingiensis源奸青素的生產工藝不能照搬照抄現有的H. pluvialis源奸青素的生產模式和調控技術，必須專門針對C. zofingiensis細胞特性及其奸青素代謝調控機制建立一套新的工藝流程和設備，這是C. zofingiensis源奸青素產業(yè)化生產前必須首先完成的任務。發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法。
為實現上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為
一種利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法
(I)活化培養(yǎng)將小球藻(Chlorella zofingiensis)在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng), 獲得同步化生長的藻液，待用；
(2)誘導培養(yǎng)取步驟(1)中生長到處于指數生長期的藻液，并向藻液中添加植物激素和鐵離子，同時補充碳源和氮源進行培養(yǎng)，直至 藻體細胞內蝦青素的積累量最高時培養(yǎng)結束(取樣采用液相色譜法測定蝦青素積累量)，收集菌株細胞破壁提取蝦青素。
所述活化培養(yǎng)是將小球藻(C. zofingiensis)培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中振蕩發(fā)酵養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20-30°C，光強0-200 μ mol πΓΥ1，轉速100_200rpm，光暗比為 12-24h/12-24h。所述液體培養(yǎng)基為 Kuhl.BG-lUBBM, Basal、CZ-M1、KMl 中的一種。所述 Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、 O. 012mg/L 四水鑰酸銨、1000ml 水，pH 6. 5。
所述誘導培養(yǎng)為取步驟(I)中生長到處于指數生長期的藻液，并向藻液中添加植物激素和鐵離子，同時補充碳源和氮源進行振蕩發(fā)酵養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20-30°C，光強0-200 μ mol HT2s-1,轉速100-200rpm，光暗比為12_24h/12_24h ;直至藻體細胞內蝦青素的積累量最高時培養(yǎng)結束(取樣采用液相色譜法測定蝦青素積累量)，采收細胞破壁提取蝦青素。
所述植物激素為茉莉酸甲酯、茉莉酸、油菜素內酯中的一種或幾種；并且其一次性添加或流加，流加量控制在O. 1-1. OrnM。所述鐵離子為亞鐵或三價鐵；并且其一次性添加或流加，流加量控制在O. 02-20mM。所述碳源為無機碳源和/或有機碳源；所述氮源為無機氮源和/或有機氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。 所述無機碳源為二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽中的一種或幾種；所述有機碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸鹽中的一種或幾種。所述無機氮源為硝酸鹽、銨鹽、氨水中的一種或幾種；所述有機氮源為尿素、酵母粉、蛋白胨中的一種或幾種。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明基于對小球藻C. zofingiensis中蝦青素合成代謝調控的研究，篩選出了蝦青素合成的有效促進劑(植物激素和鐵離子復合制劑)，實現了小球藻蝦青素的快速合成和高效積累。
本發(fā)明通過在細胞生長的指數期添加蝦青素合成促進劑(植物激素和鐵離子)， 同時適當補充碳源和氮源，在避免了這些物質過早加入對藻細胞生長的抑制作用的同時， 大幅提高了蝦青素的產量，是對照組的1. 5-7. 5倍。從中提取的蝦青素可用于水產及家禽養(yǎng)殖、食品、化妝品、醫(yī)藥等領域。本發(fā)明采用廉價原料，操作簡單，具有很高的推廣應用價值。
具體實施方式
實施例1
I)活化培養(yǎng)無菌條件下挑取小球藻C. zofingiensis單藻落到滅菌的Kuhl液體培養(yǎng)基中，而后將藻種按10% (體積比)接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中，在溫度為25 □ C,轉速為150rpm,光照強度為IOOymol IrT2S4連續(xù)光照的搖床 中振蕩培養(yǎng)。
Kuhl培養(yǎng)基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、0. 29mg/L七水硫酸鋅、0. 17mg/L 一水硫酸錳、0. 06mg/L硼酸、0. 002mg/L五水硫酸銅、0. 012mg/L四水鑰酸銨、1000ml水，pH 6. 5。
2)誘導培養(yǎng)取步驟⑴培養(yǎng)3天后中生長到處于指數生長期的藻液，在無菌條件下，向培養(yǎng)液內加入茉莉酸甲酯至終濃度O.1mM,氯化亞鐵至終濃度O. 2mM,葡萄糖至終濃度200mM，硝酸鉀至終濃度5mM。繼續(xù)培養(yǎng)9天后，藻細胞的生物量和蝦青素產量達到最高，培養(yǎng)結束，取樣采用液相色譜(HPLC)法測定(色譜儀采用Waters 2695自動抽氣進樣系統(tǒng)和Waters 2996紫外檢測器、二極管陣列檢測器(PDA);光譜掃描波長范圍為 300-700nm ;積分定量用檢測波長為450nm ;溫度4°C;進樣量20 μ I ;流速1. 2ml mirT1 ;色譜柱采用 Waters Spherisorb 0DS2 C18 反相柱(4. 6X 250mm, 5 μ m);流動相 A 采用乙腈 無水甲醇O.1M Tris-鹽酸(pH8.0)的體積比為84 2 14 ;流動相B采用無水甲醇 乙酸乙酯的體積比為68 32;洗脫梯度為100%4至100%8，1511^11;100%8，201^11)蝦青素產量。測得蝦青素產量高達28. 3mg/L。
同時以未添加植物激素和鐵離子作為對照I組，未添加植物激素和鐵離子、碳源、 氮源作為對照2組，采用液相色譜(HPLC)法測定本發(fā)明、對照組I和對照組2蝦青素產量， 測得本發(fā)明蝦青素產量為28. 3mg/L,是對照組I蝦青素產量的1. 8倍，是對照組2蝦青素產量的7.1倍。
實施例2
I)活化培養(yǎng)無菌條件下挑取小球藻C. zofingiensis單藻落到滅菌的Kuhl液體培養(yǎng)基中，而后將藻種按10% (體積比)接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中，在溫度25 □ C,轉速為150rpm,光照強度為IOOymol IrT2S4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)。
Kuhl培養(yǎng)基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨、1000ml水，pH 6. 5。
2)誘導培養(yǎng)取步驟⑴培養(yǎng)3天后中生長到處于指數生長期的藻液，在無菌條件下，向培養(yǎng)液內加入茉莉酸甲酯至終濃度O. 2mM,氯化亞鐵至終濃度O. 2mM,葡萄糖至終濃度200mM，硝酸鉀至終濃度5mM。繼續(xù)培養(yǎng)9天后，藻細胞的生物量和蝦青素產量達到最高，培養(yǎng)結束，取樣采用液相色譜(HPLC)法測定(色譜儀采用Waters 2695自動抽氣進樣系統(tǒng)和Waters 2996紫外檢測器、二極管陣列檢測器(PDA);光譜掃描波長范圍為 300-700nm ;積分定量用檢測波長為450nm ;溫度4°C;進樣量20 μ I ;流速1. 2ml mirT1 ;色譜柱采用 Waters Spherisorb 0DS2 C18 反相柱(4. 6X 250mm，5 μ m);流動相 A 采用乙腈: 無水甲醇O.1M Tris-鹽酸(pH8.0)的體積比為84 2 14 ;流動相B采用無水甲醇 乙酸乙酯的體積比為68 32;洗脫梯度為100%4至100%8，1511^11;100%8，201^11)蝦青素產量。測得蝦青素產量高達29. 9mg/L。
同時以未添加植物激素和鐵離子作為對照I組，未添加植物激素和鐵離子、碳源、 氮源作為對照2組，采用液相色譜(HPLC)法測定本發(fā)明、對照組I和對照組2蝦青素產量， 測得本發(fā)明蝦青素產量為29. 9mg/L,是對照組I蝦青素產量的1. 9倍，是對照組2蝦青素產 量的7. 5倍。
實施例3
I)活化培養(yǎng)無菌條件下挑取小球藻C. zofingiensis單藻落到滅菌的Kuhl液體培養(yǎng)基中，而后將藻種按10% (體積比)接種量，接種到含IOOml無菌Kuhl培養(yǎng)基的250ml 三角瓶中，在溫度25 □ C,轉速為150rpm,光照強度為IOOymol IrT2S4連續(xù)光照的搖床中振蕩培養(yǎng)。
Kuhl培養(yǎng)基配方10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L 二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨、1000ml水，pH 6. 5。
2)誘導培養(yǎng)取步驟⑴培養(yǎng)3天后中生長到處于指數生長期的藻液，在無菌條件下，向培養(yǎng)液內加入茉莉酸甲酯至終濃度O. 4mM,氯化亞鐵至終濃度O. 2mM,葡萄糖至終濃度200mM，硝酸鉀至終濃度5mM。繼續(xù)培養(yǎng)9天后，藻細胞的生物量和蝦青素產量達到最高，培養(yǎng)結束，取樣采用液相色譜(HPLC)法測定(色譜儀采用Waters 2695自動抽氣進樣系統(tǒng)和Waters 2996紫外檢測器、二極管陣列檢測器(PDA);光譜掃描波長范圍為 300-700nm ;積分定量用檢測波長為450nm ;溫度4°C;進樣量20 μ I ;流速1. 2ml mirT1 ;色譜柱采用 Waters Spherisorb 0DS2 C18 反相柱(4. 6 X 250mm，5 μ m);流動相 A 采用乙腈: 無水甲醇O.1M Tris-鹽酸(pH8.0)的體積比為84 2 14 ;流動相B采用無水甲醇 乙酸乙酯的體積比為68 32;洗脫梯度為100%4至100%8，1511^11;100%8，201^11)蝦青素產量。測得蝦青素產量高達29. 9mg/L?！?br> 同時以未添加植物激素和鐵離子作為對照I組，未添加植物激素和鐵離子、碳源、 氮源作為對照2組，采用液相色譜(HPLC)法測定本發(fā)明、對照組I和對照組2蝦青素產量， 測得本發(fā)明蝦青素產量為29. 8mg/L,是對照組I蝦青素產量的1. 9倍，是對照組2蝦青素產量的7. 4倍。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式
，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內，根據本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于 (1)活化培養(yǎng)將小球藻(Chlorellazofingiensis)在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng),獲得同步化生長的藻液，待用； (2)誘導培養(yǎng)取步驟(I)中生長到處于指數生長期的藻液，并向藻液中添加植物激素和鐵離子，同時補充碳源和氮源進行培養(yǎng)，直至藻體細胞內蝦青素的積累量最高時培養(yǎng)結束(取樣采用液相色譜法測定蝦青素積累量)，采收細胞破壁提取蝦青素。
2.按權利要求1所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述活化培養(yǎng)是將小球藻(C. zof ingiensis)培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中振蕩發(fā)酵養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度 20-30°C，光強 0-200 μ mol nT2s4，轉速 100_200rpm，光暗比為 12_24h/12_24h。
3.按權利要求1或2所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基為Kuhl、BG-11、BBM、Basal、CZ-MUKMl中的一種。
4.按權利要求3所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述Kuhl培養(yǎng)基為10g/L葡萄糖、lg/L硝酸鉀、89mg/L十二水磷酸氫二鈉、621mg/L二水磷酸二氫鈉、246mg/L七水硫酸鎂、9. 3mg/L EDTA、6. 9mg/L七水硫酸亞鐵、14. 7mg/L 二水氯化鈣、O. 29mg/L七水硫酸鋅、O. 17mg/L 一水硫酸錳、O. 06mg/L硼酸、O. 002mg/L五水硫酸銅、O. 012mg/L四水鑰酸銨、IOOOml水，pH 6. 5。
5.按權利要求3所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述誘導培養(yǎng)為取步驟(I)中生長到處于指數生長期的藻液，并向藻液中添加植物激素和鐵離子，同時補充碳源和氮源進行振蕩發(fā)酵養(yǎng)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20-30 □ C，光強0-200 μ mol HT2s-1,轉速100-200rpm，光暗比為12_24h/12_24h ;直至藻體細胞內蝦青素的積累量最高時培養(yǎng)結束(取樣采用液相色譜法測定蝦青素積累量)，采收細胞破壁提取蝦青素。
6.按權利要求1或5所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述植物激素為茉莉酸甲酯、茉莉酸、油菜素內酯中的一種或幾種；并且其一次性添加或流加，流加量控制在O. 1-1. OmM。
7.按權利要求1或5所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述鐵離子為亞鐵或三價鐵；并且其一次性添加或流加，流加量控制在0. 02—20mMo
8.按權利要求1或5所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述碳源為無機碳源和/或有機碳源；所述氮源為無機氮源和/或有機氮源；并且其一次性添加或流加，碳源和氮源添加量控制在C/N比100-300。
9.按權利要求7所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述無機碳源為二氧化碳、碳酸鹽、碳酸氫鹽中的一種或幾種；所述有機碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乙醇、醋酸鹽中的一種或幾種。
10.按權利要求7所述的利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法，其特征在于所述無機氮源為硝酸鹽、銨鹽、氨水中的一種或幾種；所述有機氮源為尿素、酵母粉、蛋白胨中的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明屬于微藻生物技術領域，特別涉及一種利用植物激素和鐵離子誘導小球藻合成蝦青素的方法。具體為將小球藻在液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，獲得同步化生長的藻液，待用；取上述生長到處于指數生長期的藻液，并向藻液中添加植物激素和鐵離子，同時補充碳源和氮源進行培養(yǎng)，直至藻體細胞內蝦青素的積累量最高時培養(yǎng)結束(取樣采用液相色譜法測定蝦青素積累量)，采收細胞破壁提取蝦青素。本發(fā)明簡單易行、成本低廉、能顯著增加蝦青素的產量，從而大大提高小球藻生產蝦青素的效率。
文檔編號C12P23/00GK103045709SQ20111032100
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權日2011年10月14日
發(fā)明者王艷, 秦松 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所