專利名稱：青藏高原野生大麥HsCIPK26基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種青藏高原野生大麥HsCIH^e基因。
背景技術(shù)：
目前，在已完成基因組測序工作的植物中，相關(guān)學者已從擬南芥中鑒定出沈個 AtCIPKs, 31個水稻OsCII3Ks, 43個玉米ZmCII3Ks, 27個胡楊PtCII3Ks,其他如棉花、番茄、葡萄、高粱等物種中也有相繼報道。根據(jù)已有的研究結(jié)果，植物cira主要參與各種逆境脅迫的信號傳導。由于目前大麥基因組測序仍未完成，無法確定其含有多少個HsCira基因，但理論上野生大麥基因組中至少應(yīng)包含31個HsCIPKs基因家族成員。從基因結(jié)構(gòu)上來看， AtCira基因分為多內(nèi)含子基因和少內(nèi)含子基因，通過轉(zhuǎn)錄表達和功能分析表明，Cira基因是否含有內(nèi)含子與其對應(yīng)的逆境脅迫沒有明顯關(guān)系。已有研究表明CBL與Cira之間并不是簡單的一對一關(guān)系，一個CBL可以與多個CII3K相結(jié)合，多個CBL也可以和一個CII3K互作， 一種脅迫可能引起多種CBL-CII3K互作。已有的研究證明，AtCIPKH基因可能參與糖信號調(diào)節(jié)途徑，0sCIPK2, OsCIPKlO, OsCIHQ 1和OsCII3KH基因在高鹽、低溫等逆境下表達量都有不同程度的變化，可能參與了多條逆境信號轉(zhuǎn)導途徑。表達序列標簽(expressed sequence tags，EST)是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200-600bp由于基因表達調(diào)控作用不同，同一個基因的 mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包含多個EST。EST既代表了基因cDNA的某一區(qū)段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式。電子克隆技術(shù)是生物學數(shù)據(jù)庫中EST數(shù)據(jù)庫、核酸序列數(shù)據(jù)庫、基因組數(shù)據(jù)庫，采用同源性序列比對和歸類分析、重疊區(qū)域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認為是相對應(yīng)基因的全長cDNA，根據(jù)所得的cDNA序列設(shè)計囊括開放閱讀框兩端的引物，進行RT-PCR克隆出相應(yīng)基因的方法。轉(zhuǎn)座子標簽法，DNA亞克隆，電子克隆(Cloning In Silico)，Tail-PCR, iPCR(Inverse PCR)，TD-PCR(Touchdown-PCR), RACE (cRACE、3，-RACE,5' -RACE)等技術(shù)都是分子克隆中常用的技術(shù)。此外隨著轉(zhuǎn)座子的深入研究及測序技術(shù)的飛躍發(fā)展，直接分離鑒定新基因的難度變得越來越小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明利用水稻OsCira同源基因序列設(shè)計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然后用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding sequence，⑶S)。運用生物信息學方法對目標基因進行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測。 提取野生大麥總RNA，制備cDNA和設(shè)計PCR引物，通過PCR技術(shù)克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，源于青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBL特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO :1的核苷酸序列定義。所述的青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，它在N端有一特異的催化結(jié)構(gòu)域，C端區(qū)域含有一個獨特的21-M個氨基酸組成的調(diào)節(jié)域即NAF結(jié)構(gòu)域，這兩個調(diào)節(jié)域的序列在所有CII3K中高度保守，，所述的青藏高原野生大麥HsCIH^6基因，其編碼SEQ ID NO :2定義的氨基酸序列本發(fā)明從青藏高原一年生野生大麥(Hordeum spontoneum C. Koch)中鑒定并分離出HsCIPI^6基因。


圖1為HsCIH^6電泳結(jié)果；圖2為pMD18T: :HsCIPK26陽性克隆鑒定結(jié)果；圖3為青藏高原一年生野生大麥HsCIH^e基因的蛋白結(jié)構(gòu)；圖4為青藏高原一年生野生大麥HsCIH^e基因的全序列；圖5本發(fā)明技術(shù)路線圖；圖6為本鹽誘導HsCIPI^6基因的Real-time PCR圖。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1HsCIH^6基因全序列的獲得1. 1引物設(shè)計(帶下劃線的為酶切位點序列)HsCIPK26-KpnI-F :CGGGGTACCATGGAAGACAGGAGTGTTTTGACCAAACHsCIPK26-XbaI-R :TGCTCTAGATTATTGTGGCAGTGGGGAGAAAGCATTTG表1反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，其特征在于源于青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBL特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID N0:1的核苷酸序列定義。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，其特征在于它在N端有一特異的催化結(jié)構(gòu)域，C端區(qū)域含有一個獨特的21-M個氨基酸組成的調(diào)節(jié)域即NAF結(jié)構(gòu)域， 這兩個調(diào)節(jié)域的序列在所有Cira中高度保守，，所述的青藏高原野生大麥HsCIH^e基因， 其編碼SEQ ID NO :2定義的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了青藏高原野生大麥HsCIPK26基因，其由SEQ ID NO1的核苷酸序列定義。利用水稻OsCIPK同源基因序列設(shè)計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然后用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding sequence，CDS)。運用生物信息學方法對目標基因進行結(jié)構(gòu)分析和功能預(yù)測。提取野生大麥總RNA，制備cDNA和設(shè)計PCR引物，通過PCR技術(shù)克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。
文檔編號C12N15/54GK102399799SQ201110321518
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者查笑君, 沈金秋, 潘建偉, 王文祥, 鄭仲仲 申請人:浙江師范大學