專利名稱：高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌及其構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血小板因子4 (platelet factor 4，PF4)屬趨化性細(xì)胞因子CXC亞家族，分子量約為7. 8KD，其基因定位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂。它在巨核細(xì)胞中合成，在α顆粒中包裝，在血小板處于粘附、聚集等活化狀態(tài)時(shí)以高分子量蛋白多糖-PF4復(fù)合物的形式從血小板中釋放。該因子與多種細(xì)胞的生物功能有關(guān)；如PF4高度親和肝素和帶負(fù)電細(xì)胞表面的葡糖胺多糖， 其在止血和血栓形成過程中起著重要作用。PF4能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成， 調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大NK細(xì)胞炎癥應(yīng)答等，從而抑制腫瘤血管形成和維持對(duì)腫瘤細(xì)胞的非特異性免疫應(yīng)答；PF4能降低正常造血干細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，而不影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性，其機(jī)制是PF4可逆性地抑制細(xì)胞增殖，將細(xì)胞阻止在S期，同時(shí)還保持細(xì)胞的生存力和活力。因此，PF4可作為造血細(xì)胞的防護(hù)劑用于腫瘤臨床治療中。另外，PF4的測(cè)定不僅作為體內(nèi)高凝狀態(tài)的敏感指標(biāo)，而且在多種疾患的診斷和預(yù)后的判斷中，PF4的測(cè)定也有相當(dāng)重要的臨床意義。近來研究發(fā)現(xiàn)血清PF4水平可作為胰腺癌病人存活和靜脈血栓栓塞形成的獨(dú)立指標(biāo)。因此其開發(fā)具有很好的科研和臨床價(jià)值；然而天然PF4是從人血小板中純化出來的，價(jià)格昂貴，產(chǎn)量少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足科研和臨床的需求。用基因工程方法生產(chǎn)PF4國(guó)內(nèi)外均有研究，且均有產(chǎn)品上市，但大都用單一拷貝進(jìn)行表達(dá)，規(guī)模較小，價(jià)格昂貴，產(chǎn)量有待提高。同時(shí)，PF4屬于小分子多肽，由于其相對(duì)分子質(zhì)量較小，在體內(nèi)易被迅速水解，半衰期短，因此在克隆、表達(dá)等過程中都會(huì)碰到不少困難。另外其表達(dá)量也少，在一定程度上制約了工業(yè)化生產(chǎn)。目前，采用構(gòu)建多拷貝表達(dá)載體的策略可以有效提高小分子多肽的表達(dá)量和穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種成本低、PF4表達(dá)量高的基因工程菌。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高效表達(dá)人PF4的基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種高效表達(dá)人PF4的基因工程菌，所述基因工程菌為大腸桿菌BL21 (DE3)，其攜帶的質(zhì)粒中含有η個(gè)表達(dá)人PF4的基因，η = 1，2，3，4，5或6 ；質(zhì)粒的啟動(dòng)子為IPTG誘導(dǎo)的 T7Lac啟動(dòng)子。優(yōu)選的是η = 4，5或6。高效表達(dá)人PF4的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟(1)人PF4基因的擴(kuò)增將人PF4基因根據(jù)大腸桿菌基因翻譯的偏愛密碼子進(jìn)行改造，以SEQ ID No. 1、SEQ IDNo. 2分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. 12序列；再以模板，以SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ IDNo. 13序列；再以SEQ IDNo. 13為模板，以SEQ IDNo. 5、SEQ IDNo. 6分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SEQ ID No. 16所示的人PF4的基因，將該基因克隆至pEASY_T3 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到pEASY-T3-PF4/DH5 α ；(2)PF4串聯(lián)單位及第一串聯(lián)單位的擴(kuò)增以質(zhì)粒pEASY-T3-PF4為模板，以SEQ ID No. 7,SEQ ID No. 8分別為上、下游引物， 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. 14序列；以SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. 15序列；以SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 15 分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PF4串聯(lián)單位序列，將所述串聯(lián)單位克隆至pEASY-Tl載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到pEASY-Tl_PF4/DH5 α ；以質(zhì)粒pEASY-Tl-PF4為模板，以SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 8分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得第一串聯(lián)單位序列，將所述第一串聯(lián)單位克隆至pEASY-Tl載體中， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到pEASY-Tl-f PF4/DH5 α ；所述串聯(lián)單位為EcoR I酶切位點(diǎn)_)(ho I酶切位點(diǎn)-SD序列-ATG起始密碼子-His標(biāo)簽-EK酶切位點(diǎn)-人PF4基因-TAATAA終止密碼子-Sal I酶切位點(diǎn)；所述串聯(lián)單位用序列表中SEQ ID No. 17表示；所述第一串聯(lián)單位為EcoR I酶切位點(diǎn)-ATG起始密碼子-His標(biāo)簽-EK酶切位點(diǎn)-人PF4基因-TAATAA終止密碼子-Sal I酶切位點(diǎn)；所述第一串聯(lián)單位用序列表中SEQ IDNo. 18 表示；(3)PF4多拷貝載體的構(gòu)建對(duì)質(zhì)粒pEASY-Tl-PF4進(jìn)行EcoR I和Β ο I雙酶切，回收大片段；對(duì)質(zhì)粒 pEASY-Tl-fPF4進(jìn)行EcoR I和Ml I雙酶切，回收小片段；連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，即可獲得 pEASY-Tl_2f PF4/DH5 α ；對(duì)質(zhì)粒pEASY-Tl-PF4進(jìn)行EcoR I和Β ο I雙酶切，回收大片段；對(duì)質(zhì)粒 pEASY-Tl-2fPF4進(jìn)行EcoR I和Ml I雙酶切，回收小片段；連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，即可獲得 pEASY-Tl-3fPF4/DH5 α ；如此反復(fù)進(jìn)行，獲得 pEASY-Tl_nfPF4/DH5 α，所述 η = 1，2，3，4，5 或 6 ；(4)構(gòu)建多拷貝人PF4的基因工程菌對(duì)質(zhì)粒pED8a(+)和pEASY_Tl_nfPF4進(jìn)行EcoR I和Ml I雙酶切，分別回收大、小片段，連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，最終獲得工程菌pET28a(+)-nfPF4/ BL21(DE3)，所述 η = 1，2，3，4，5 或 6。優(yōu)選的是所述η = 4，5或6。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明構(gòu)建了多拷貝人PF4的基因工程菌，與目前單拷貝的人PF4基因工程菌相比，大大提高了人PF4的表達(dá)量；(2)通過在人PF4基因的DNA序列的N端加入純化標(biāo)簽，只要進(jìn)行一次親和層析， 便可得到較純的人PF4融合蛋白，純化步驟簡(jiǎn)便，比傳統(tǒng)技術(shù)的多層層析更易于操作；(3)通過在人PF4基因的DNA序列的N端加入蛋白酶酶切位點(diǎn)，C端加入終止密碼子，只要進(jìn)行一次酶解便得到人PF4樣品，純化極為簡(jiǎn)便，得率高。
因而利用本發(fā)明的基因工程菌生產(chǎn)人PF4，產(chǎn)量高，純化工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。


圖1PF4基因的PCR擴(kuò)增；圖2PF4串聯(lián)單位的PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒pEASY_Tl_PF4的構(gòu)建；圖3PF4第一串聯(lián)單位的PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒pEASY_Tl_fPF4的構(gòu)建；圖 4 質(zhì)粒 pEASY-Tl_2fPF4 的構(gòu)建；圖 5 質(zhì)粒 pET28a (+) _2fPF4 的構(gòu)建。圖6重組質(zhì)粒pET28a(+)_nf PF4的EcoRI和Sal I雙酶切鑒定，圖中泳道 1 :TrMis5K DNA Marker :300bp,500bp,800bp,IOOObp,1500bp,2000bp, 3000bp，5000bp泳道2 :pET28a(+)-6f PF4 經(jīng) EcoR I、Sal I 雙酶切泳道3 :pET28a(+)-5f PF4 經(jīng) EcoR I、Sal I 雙酶切泳道4 :pET28a (+) ~4f PF4 經(jīng) EcoR I.Sal I 雙酶切泳道5 :pET28a(+)-3f PF4 經(jīng) EcoR I、Sal I 雙酶切泳道6 :pET28a (+) ~2f PF4 經(jīng) EcoR I.Sal I 雙酶切泳道7 :pET28a(+)-f PF4 經(jīng) EcoR I、Sal I 雙酶切泳道 8 :Trans5K DNA Marker (TransGene)圖7為pET28a(+)-nfPF4/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后全菌蛋白電泳結(jié)果，圖中泳道 1 Unstained Protein Molecular Weight Marker (fermentas)泳道2 :pET28a(+) /BL21 (DE3)全菌蛋白泳道3 :pET28a(+) -fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道4 :pET28a(+) -2fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道5 :pET28a(+) -3fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道6 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道7 :pET28a(+) -5fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白泳道8 :pET28a(+) -6fPF4/BL21 (DE3)全菌蛋白圖8為重組蛋白在pET28a(+)_4fPF4/BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)檢測(cè)及純化，圖中泳道 1 Unstained Protein Molecular Weight Marker (fermentas)泳道2 :pET28a(+) /BL21 (DE3)誘導(dǎo)后全菌蛋白泳道3 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)誘導(dǎo)前全菌蛋白泳道4 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后全菌蛋白泳道5 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后沉淀蛋白泳道6 :pET28a(+) -4fPF4/BL21 (DE3)誘導(dǎo)后上清蛋白泳道7 :His-PF4 蛋白圖9為EK酶酶切重組His_PF4蛋白結(jié)果，圖中泳道1 :His-PF4 酶切(酶 3ul)泳道2 :His-PF4 酶切(酶 Iul)泳道3:His_PF4
泳道 4 :PageRuler Unstained Low Range Protein Ladder (fermentas)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟下述的大腸桿菌DH5 α、BL21 (DE3)和質(zhì)粒pET28a(+)從市場(chǎng)購(gòu)得。限制性內(nèi)切酶 EcoRI.Xho I.Sal I購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司。T4 DNA連接酶、pEASY-Tl載體和 PEASY-T3載體購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。PCR引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。引物序列如下表1發(fā)明中所用引物序列表
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為大腸桿菌BL21(DE3)，其攜帶的質(zhì)粒中含有η個(gè)表達(dá)人PF4的基因，η = 1，2，3，4，5或6 ；質(zhì)粒的啟動(dòng)子為IPTG誘導(dǎo)的T7Lac啟動(dòng)子，所述人血小板因子4為人PF4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌，其特征在于所述η優(yōu)選4，5或6。
3.權(quán)利要求1的高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)人PF4基因的擴(kuò)增將人PF4基因根據(jù)大腸桿菌基因翻譯的偏愛密碼子進(jìn)行改造，以SEQ ID No. 1、SEQ IDNo.2分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. 12序列；再以 SEQ ID No. 12為模板，以SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到 SEQ ID No. 13 序列；再以 SEQ ID No. 13 為模板，以 SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 6 分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SEQ ID No. 16所示的人PF4的基因，將該基因克隆至 PEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到pEASY-T3_PF4/DH5 α ；(2)PF4串聯(lián)單位及第一串聯(lián)單位的擴(kuò)增以質(zhì)粒PEASY-T3-PF4為模板，以SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 8分別為上、下游引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. 14序列；以SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 10分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到SEQ ID No. 15序列；以SEQ ID No. 14、SEQ ID No. 15分別為上、下游引物，兩者互為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PF4串聯(lián)單位序列，將所述串聯(lián)單位克隆至pEASY-Tl載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，得到pEASY-Tl_PF4/DH5 α ；以質(zhì)粒pEASY-Tl-PF4為模板，以SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 8分別為上、下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得第一串聯(lián)單位序列，將所述第一串聯(lián)單位克隆至pEASY-Tl載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，得到 pEASY-Tl_fPF4/DH5 α ；所述串聯(lián)單位為=EcoR I酶切位點(diǎn)-Bio I酶切位點(diǎn)-SD序列-ATG起始密碼子-His標(biāo)簽-EK酶切位點(diǎn)-人PF4基因-TAATAA終止密碼子-Sal I酶切位點(diǎn)；所述串聯(lián)單位用序列表中SEQ ID No. 17表示；所述第一串聯(lián)單位為=EcoR I酶切位點(diǎn)-ATG起始密碼子-His標(biāo)簽-EK酶切位點(diǎn)-人 PF4基因-TAATAA終止密碼子-Sal I酶切位點(diǎn)；所述第一串聯(lián)單位用序列表中SEQ IDNo. 18 表不。(3)PF4多拷貝載體的構(gòu)建對(duì)質(zhì)粒PEASY-T1-PF4進(jìn)行EcoR I和Β ο I雙酶切，回收大片段；對(duì)質(zhì)粒pEASY-Tl-f PF4進(jìn)行EcoR I和Ml I雙酶切，回收小片段；連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，即可獲得 pEASY-T l-2f PF4/DH5 α ；對(duì)質(zhì)粒pEASY-Tl-PF4進(jìn)行EcoR I和Β ο I雙酶切，回收大片段；對(duì)質(zhì)粒 pEASY-Tl-2fPF4進(jìn)行EcoR I和Ml I雙酶切，回收小片段；連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 α，即可獲得 pEASY-Tl-3fPF4/DH5 α ；如此反復(fù)進(jìn)行，可獲得 pEASY-Tl_nfPF4/DH5 α， 所述 η = 1，2，3，4，5 或 6 ；(4)構(gòu)建多拷貝人PF4的基因工程菌對(duì)質(zhì)粒pED8a(+)和pEASY-Tl-nf PF4進(jìn)行EcoR I和Ml I雙酶切，分別回收大、小片段，連接大、小片段，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，最終獲得工程菌pET2M (+) -nfPF4/ BL21(DE3)，所述 η = 1，2，3，4，5 或 6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述η優(yōu)選4，5或6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)人血小板因子4的基因工程菌及其構(gòu)建方法，所述工程菌的構(gòu)建方法為(1)人PF4基因的擴(kuò)增；(2)PF4串聯(lián)單位的擴(kuò)增；(3)PF4多拷貝載體的構(gòu)建；(4)構(gòu)建多拷貝人PF4的基因工程菌。本發(fā)明構(gòu)建了多拷貝人PF4的基因工程菌，與目前單拷貝的人PF4基因工程菌相比，大大提高了人PF4的表達(dá)量；通過在人PF4基因的DNA序列的N端加入純化標(biāo)簽，只要進(jìn)行一次親和層析，便可得到較純的人PF4融合蛋白，純化步驟簡(jiǎn)便，比傳統(tǒng)技術(shù)的多層層析更易于操作；通過在人PF4基因的DNA序列的N端加入蛋白酶酶切位點(diǎn)，C端加入終止密碼子，只要進(jìn)行一次酶解便得到人PF4樣品，純化簡(jiǎn)便，得率高。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102363763SQ20111032194
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者吳偉, 房振江, 段毅濤, 王喆, 甘一如, 黃鶴 申請(qǐng)人:天津大學(xué)