專利名稱：一種重組質粒及應用其制備的重組溶瘤腺病毒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉一種重組質粒及應用其制備的重組溶瘤腺病毒。
背景技術：
溶瘤病毒能特異性在腫瘤細胞中復制并裂解之，所釋放出來的病毒顆粒能感染更多的腫瘤細胞，而對正常機體細胞沒有殺傷作用，溶瘤病毒還可以作為載體，導入其他的抑癌基因或自殺基因等，發(fā)揮溶瘤和抑瘤的雙重作用，因此，溶瘤病毒或重組的溶瘤病毒成為臨床腫瘤治療有前景的方法之一。在各種溶瘤病毒中，溶瘤腺病毒(Oncolytic Adenovirus)備受青睞，因為腺病毒載體具有感染效率高，不與宿主細胞整合而誘發(fā)癌癥的優(yōu)點，因此在臨床腫瘤生物治療中應用最為廣泛。溶瘤病毒對腫瘤的特異性來源于兩方面，一是用基因工程技術剔除正常細胞中病毒復制的必需基因，二是插入組織或腫瘤特異啟動子(Tissue Specific Promotor, TSP)， 如插入端粒酶逆轉錄酶啟動子(TERTp)的Ad-TERT系統(tǒng)，經過上述改造的腺病毒的復制能力在腫瘤細胞中明顯強于正常細胞，所攜帶的腫瘤殺傷基因的表達隨病毒顆粒增多和在腫瘤中存在時間的延長而表達增加。溶瘤腺病毒Ad-TERTp應用很多如在該載體上插入治療基因apoptin后構成重組病毒Ad-TERTp-ElA-apoptin可以顯著抑制黑色素瘤細胞而非正常成纖維細胞NIH3T3 的生長，提高荷瘤裸鼠的存活率；在該載體上插入自殺基因HSK-TK后構成重組腺病毒 Ad. hTERT-ElA-TK,同樣也在細胞和荷瘤裸鼠實驗中證實它能抑制非小細胞肺癌而非正常細胞的生長。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種重組質粒及應用其制備的重組溶瘤腺病毒。本發(fā)明保護一種DNA片段，包括DNA片段甲和DNA片段乙；所述DNA片段甲包括TO 啟動子和1504-siRNA編碼DNA ；所述DNA片段乙包括TECTp啟動子、ElA基因(腺病毒早期復制基因簡稱ElA基因)和E1B5^(-E1B19K基因；所述U6啟動子如序列表的序列1自5， 末端第192至211位核苷酸所示；所述1504-siRNA編碼DNA如序列表的序列1自5’末端第271至291位核苷酸所示；所述TERTp啟動子如序列表的序列2自5，末端第9至第461 位核苷酸所示；所述ElA基因如序列表的序列2自5’末端第469至14M位核苷酸所示；所述E1B5^(-E1B19K基因如序列表的序列2自5，末端第1623至第3418位核苷酸所示。所述DNA片段甲具體可為如下(a)或(b)(a)序列表的序列1自5，末端第192至291位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列1所示的DNA分子。所述DNA片段乙具體可為如下(c)或(d)(c)序列表的序列2所示自5’末端第9至3418位核苷酸所示的DNA分子；
(d)序列表的序列2所示的DNA分子。所述DNA片段中(在所述DNA片段甲和所述DNA片段乙以外的區(qū)域)，還可包括抗性篩選基因。所述抗性篩選基因優(yōu)選為卡那霉素抗性基因。含有以上任一所述DNA片段的重組質?；蛑亟M腺病毒也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述重組質?？蔀槿缦?e)或(f)(e)在pshuttle穿梭質粒的多克隆位點插入所述DNA片段得到的重組質粒 psh-1504-TETPE ；(f)將pAdEasy-Ι載體的Left Arm和Right Arm重組位點之間的小片段取代為所述DNA片段得到的重組質粒pAd-1504-TETPE。所述重組質粒psh-1504-TETPE的制備方法具體如下(1)在pshuttle穿梭質粒的KpnI和EcoRV酶切位點間插入所述DNA片段甲，得到重組質粒 pshuttle-1504-siRNA ；(2)在所述重組質粒pshuttle-1504-siRNA的NotI和MfeI酶切識別位點之間插入所述DNA片段乙，得到重組質粒psh-1504-TETPE。所述重組質粒pAd-1504-TETPE的制備方法具體如下①用限制性內切酶RneI酶切所述重組質粒psh-1504-TETPE，得線性DNA ；②將所述線性DNA和pAdEasy-Ι載體共轉染BJ5183細胞，得到重組質粒 pAd-1504-TETPE。所述重組腺病毒優(yōu)選為重組溶瘤腺病毒。所述重組溶瘤腺病毒具體可為將所述重組質粒pAd-1504-TETPE轉染哺乳動物細胞并表達得到的重組腺病毒。所述哺乳動物細胞優(yōu)選為細胞。所述重組腺病毒可用于制備抑制腫瘤細胞和/或抑制癌癥的藥物。本發(fā)明還保護一種抑制腫瘤細胞和/或抑制癌癥的藥物，它的活性成分為所述重組腺病毒。所述腫瘤細胞可為前列腺癌細胞或肝癌細胞。所述前列腺癌細胞優(yōu)選為C4-2B細胞。所述肝癌細胞優(yōu)選為7721細胞。所述抑制腫瘤細胞具體可為抑制腫瘤細胞的存活和
/或增殖和/或生長。所述癌癥可為前列腺癌細胞或肝癌。所述前列腺癌優(yōu)選為由C4-2B細胞引起的前列腺癌。所述肝癌優(yōu)選為由7721細胞引起的肝癌。EphA3基因在正常組織中限制性表達或低表達，在腫瘤組織中高表達或突變，參與腫瘤的增殖、遷移和血管形成等。pl504-siRNA是以EphA3基因為靶點的干擾RNA，可以顯著降低腫瘤細胞中的EphA3蛋白表達，還可以抑制腫瘤的增殖和遷移。本發(fā)明中，將DNA片段甲(自上游至下游包括兩個元件啟動子元件、 1504-siRNA編碼元件)和DNA片段乙(TERTp啟動子元件、ElA基因元件、E1B55K-E1B19K 基因元件)插入溶瘤腺病毒載體，得到了重組溶瘤腺病毒載體。將該重組溶瘤腺病毒載體轉染細胞并進行培養(yǎng)，可以得到含有重組溶瘤腺病毒的培養(yǎng)上清。該重組溶瘤腺病毒中，由腫瘤特異啟動子啟動(TERTp啟動子)腺病毒早期復制基因ElA的表達，即在正常細胞中不表達或表達量極低，當在腫瘤細胞中表達時同時表達1504-siRNA。該重組溶瘤腺病毒具有很好的腫瘤細胞特異性，能夠發(fā)揮溶瘤和抑瘤的雙重作用，具有很高的醫(yī)療價值。


圖1為pshuttle穿梭質粒的結構示意圖。圖2為pTO-1504-siRNA質粒的結構示意圖。圖3為重組質粒pshuttle-1504-siRNA的結構示意圖。圖4為pTE-TPE質粒的結構示意圖。圖5為重組質粒pshuttle-1504-TETPE的結構示意圖。圖6為pAdEasy-Ι載體的結構示意圖。圖7為重組質粒pAd-1504-TETPE的結構示意圖。圖 8 為 pshuttle-1504-siRNA(A)和 pshuttle-NC-siRNA (B)的酶切鑒定圖。圖 9 為 pshuttle-1504-TETPE(A)和 pshuttle-NC-TETPE (B)的酶切鑒定圖譜。圖 10 為 pAd-1504-TETPE(A)和 pAd-NC-TETPE (B)的酶切鑒定圖譜。圖11為pAd-1504-TETPE轉染細胞后出毒情況；A為轉染pAd-1504_TETPE的細胞；B為未轉染pAd-1504-TETPE的細胞。圖12為溶瘤腺病毒基因組PCR產物電泳鑒定圖譜。圖13為溶瘤腺病毒感染C4-2B細胞后EphA3表達情況。圖14為溶瘤腺病毒感染C4-2B細胞后ElA蛋白的表達情況。圖15為溶瘤腺病毒感染7721細胞和L02細胞后出現CPE的情況。圖16為Ad-TERTp-ElA-1504和Ad- Δ Ε1Α-1504感染C4-2B細胞后對細胞增殖的作用(MTT實驗)。圖17為Ad-TERTp-ElA-1504對C4-2B和2BS細胞增殖的作用(MTT實驗)。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。MOI值代表感染病毒的數量與細胞數量的比值。pshuttle穿梭質粒為Stratagenge公司產品。細胞為美國ATCC公司產品。 C4-2B細胞(前列腺癌細胞，端粒酶陽性)% Urocore (Oklahoma City,OK,USA)公司產品。 7721細胞(肝癌細胞，端粒酶陽性)和L02細胞(正常肝細胞，端粒酶陰性)為南京凱基生物技術發(fā)展有限公司產品。2BS細胞(人胚肺成纖維細胞，端粒酶陰性)購自中國細胞庫典藏中心，編號為 QK10619。Adeasy Adenoviral Vector System 為(Stratagenge)公司產品，包括pAdEasy-Ι載體(Adeasy腺病毒骨架質粒)和BJ5183細胞。KpnI、EcoRV、NotI、 PmeI限制性核酸內切酶，pfuDNA聚合酶，T4DNA連接酶為Takala公司產品。MfeUacI限制性核酸內切酶為美國NEB公司產品。PCR產品回收試劑盒、細胞轉染試劑為Vigorous公司產品。ElA抗體，EphA3抗體為Santa cluz公司產品。鼠、兔二抗購自中杉金橋公司。1X70
6熒光倒置顯微鏡為Olympus公司產品。pTE-TPE 質粒參考文獻:Hong-yan Liu, Bing-Juan Han, Yu-Xu Zhong, et al. A three plasmide system for contruction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 2009，162,8—13。pTO-1504-siRNA質粒參考文獻武瑞琴博士論文，導師周建光，發(fā)表時間2009年 5月，軍事醫(yī)學科學院，受體酪氨酸激酶家族分子EphA3在前列腺癌進展中的作用研究。pTO-NC-siRNA質粒參考文獻武瑞琴的博士論文，導師周建光，發(fā)表時間2009年 5月，軍事醫(yī)學科學院，受體酪氨酸激酶家族分子EphA3在前列腺癌進展中的作用研究。實施例1、重組質粒的構建一、重組質粒 pAd-1504-TETPE 的構建1、重組質粒 pshuttle-1504-siRNA 的構建(1)用限制性內切酶KpnI和EcoRV雙酶切pshuttle穿梭質粒(結構示意圖見圖 1)，回收約6. 6kb的DNA片段。(2)以pU6-1504-siRNA質粒(結構示意圖見圖2)為模板，用T7和T3組成的引物對，在Pfu DNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，擴增產物用KpnI進行酶切，電泳回收約 400bp的酶切DNA片段(自上游至下游依次為U6啟動子和1504_siRNA編碼基因)。T7 :5， -TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3，；T3 :5， -ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAA-3，。T7引物下游第8-14核苷酸為KpnI的酶切位點，即GGTACC。(3)將步驟(1)的DNA片段和步驟O)的DNA片段在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接產物進行酶切鑒定(KpnI和NotI雙酶切；電泳圖見圖8A，箭頭標注的為約400bp 的靶片段)，得到重組質粒pshuttle-1504-siRNA。(4)將重組質粒pshuttle-1504-siRNA進行測序。根據測序結果，對重組質粒 pshuttle-1504-siRNA進行結構描述如下在pshuttle穿梭質粒的KpnI和EcoRV酶切識別位點之間插入了 DNA片段甲。DNA片段甲的核苷酸序列如序列表的序列1所示(自5’末端第1至第6位核苷酸為Kpn I的酶切位點，第192至211位核苷酸為U6啟動子，第271至 291位核苷酸為1504-siRNA編碼DNA，第345至353位核苷酸為NotI的酶切位點)。重組質粒pshuttle-1504-siRNA的結構示意圖見圖3。2、重組質粒 pshuttle-1504-TETPE 的構建(1)用限制性內切酶MfeI酶切重組質粒pshuttle-1504-siRNA，回收約7kb的DNA 片段。(2)用限制性內切酶NotI酶切步驟(1)的DNA片段，回收約6. 6kb的DNA片段。(3)用限制性內切酶MfeI酶切pTE_TPE質粒(結構示意圖見圖4)，回收約3. 9kb 的DNA片段。(4)用限制性內切酶NotI酶切步驟(3)的DNA片段，回收約3832bp的DNA片段。(5)將步驟O)的DNA片段和步驟的DNA片段在T4DNA連接酶的作用下進行連接，連接產物進行酶切鑒定(KpnI單酶切；電泳圖見圖9A，箭頭標注的為約2200bp的靶片段)，得到重組質粒pshuttle-1504-TETPE。(6)將重組質粒pshuttle-1504-TETPE進行測序。根據測序結果，對重組質粒pshuttle-1504-TETPE 進行結構描述如下在重組質粒 pshuttle-1504-siRNA 的 NotI 和MfeI酶切識別位點之間插入了 DNA片段乙。DNA片段乙的核苷酸序列如序列表的序列2所示(自5’末端第1至第8位核苷酸為Not I的酶切位點，第9至第461位核苷酸為TERTp啟動子，第469至1妨4位核苷酸為腺病毒ElA基因，第1623至第3418位核苷酸為E1B5^(-E1B19K基因，第3833至3838位核苷酸為Mfe I的酶切位點)。重組質粒 pshuttle-1504-TETPE的結構示意圖見圖5。3、重組質粒 pAd-1504-TETPE 的構建(1)用限制性內切酶RneI酶切重組質粒pshuttle-1504-TETPE，回收線性DNA。(2)將步驟(1)的線性DNA和pAdEasy-Ι載體(結構示意圖見圖6)共轉染BJ5183 細胞，在含有濃度為50 μ g/ml卡那霉素細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞(線性DNA和pAdEasy-Ι載體在細胞中發(fā)生重組，重組位點為Left Arm和Right Arm)并提取質粒。(3)將提取的質粒進行I^cI酶切，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖10A，顯示4. 6kb 和301Λ兩條帶的質粒為陽性質粒(泳道4和泳道6)。(4)將步驟(3)的陽性質粒進行測序鑒定，獲得重組質粒pAd-1504-TETPE。重組質粒pAd-1504-TETPE的結構示意圖見圖7。二、重組質粒pAd-NC-TETPE的構建1、重組質粒 pshuttle-NC-siRNA 的構建(1)同步驟一的1的(1)。(2)以pU6-NC-siRNA質粒為模板，用T7和T3組成的引物對，在pfu DNA聚合酶的作用下進行PCR擴增，回收約400bp的DNA片段。(3)同步驟一的1的( ，連接產物進行酶切鑒定(KpnI和NotI雙酶切；電泳圖見圖8B，箭頭標注的為約400bp的靶片段)，得到重組質粒pshuttle-NC-siRNA。2、重組質粒 pshuttle-NC-TETPE 的構建用重組質粒pshuttle-NC-siRNA代替重組質粒pshuttle-1504-siRNA，其它同步驟一的2，連接產物進行酶切鑒定(KpnI單酶切；電泳圖見圖9B，箭頭標注的為約2200bp的靶片段)，得到重組質粒pshuttle-NC-TETPE。
3、重組質粒pAd-NC-TETPE的構建用重組質粒pshuttle-NC-TETPE代替重組質粒pshuttle-1504-TETPE，其它同步驟一的3，重組后質粒I^cI酶切鑒定電泳圖見圖10B，顯示4. 6kb和301Λ兩條帶的質粒為陽性質粒(泳道1和泳道幻，得到重組質粒pAd-NC-TETPE。根據測序結果，重組質粒pAd-NC-TETPE與重組質粒pAd-1504_TETPE的差別僅在于用NC-siRNA編碼基因(序列表的序列3自5’末端第386至第406位核苷酸)代替了 1504-siRNA編碼基因。三、重組質粒pAd-AElA-1504的構建用重組質粒pshuttle-1504-siRNA 代替重組質粒 pshuttle-1504-TETPE，其它同步驟一的3，得到重組質粒pAd- Δ EIA-1504。四、重組質粒pAd- Δ ElA-NC的構建用重組質粒pshuttle-NC-siRNA代替重組質粒pshuttle-1504-TETPE，其它同步驟一的3，得到重組質粒pAd- Δ EIA-NC。
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實施例2、重組溶瘤腺病毒的制備一、重組溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-1504的制備1、用限制性內切酶I^acI酶切重組質粒pAd-1504_TETPE，回收約301Λ的DNA片段， 轉染細胞，二氧化碳孵箱中37°C培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中可以觀察到細胞形態(tài)變腫脹和變圓，細胞核占據細胞的大部分，此類細胞逐漸向四周增加，繼而漂起，出現一片空白斑，則說明有病毒病變灶(Cytopathogenic effect,CPE)產生。培養(yǎng)第10天的照片見圖11。轉染重組質粒pAd-1504-TETPE的細胞出現噬斑，即細胞變圓腫脹，連成串狀，呈葡萄狀，中間出現空斑(左側白框所示)。正常細胞只是更加緊密，而不會變圓。2、待細胞大部分病變并且1/2 1/3細胞從底部脫落時(培養(yǎng)7_10天)收集細胞，2000rpm離心2min,棄上清，用PBS緩沖液在6孔板中(0. 5ml/孔)重懸細胞。3、將細胞在-80°C冰箱和37°C水浴鍋中反復凍融4次(每次凍融的方法為-80°C 處理5min，然后37°C水浴處理5min，解凍后進行渦流震蕩，使病毒從病變細胞中充分釋放)；第4次凍融后的凍融液室溫12000rpm離心lOmin，收集上清(含有重組溶瘤腺病毒 Ad-TERTp-ElA-1504,又稱 Ad-TERTp-ElA-1504 初毒液)，_80°C凍存。4、取 30 μ 1 (25-50 μ 1 均可)Ad-TERTp-ElA-1504 初毒液，感染 IXlO6 個 293A 細胞，發(fā)生完全CPE時(本處為36小時，實際應用中24-48小時均可)收集細胞，進行步驟 2和3，獲得Ad-TERTp-ElA-1504第二代病毒液；重復上述步驟，獲得Ad-TERTp-ElA-1504 第三代病毒液、Ad-TERTp-ElA-1504第四代病毒液、Ad-TERTp-ElA-1504第五代病毒液和 Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液。二、重組溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-NC的制備用重組質粒pAd-NC-TETPE代替重組質粒pAd-1504_TETPE，其它同步驟一。三、重組腺病毒Ad- Δ Ε1Α-1504 (與Ad-TERTp-ElA-1504相比，缺失早期復制基因 ElA和腫瘤特異啟動子TERTp)的構建用重組質粒ρΑ(1-ΔΕ1Α-1504代替重組質粒pAd-1504_TETPE，其它同步驟一。四、重組腺病毒Ad-AElA-NC(與Ad-TERTp-ElA-NC相比，缺失早期復制基因ElA 和腫瘤特異啟動子TERTp)的構建用重組質粒pAd-Δ ElA-NC代替重組質粒pAd-1504_TETPE，其它同步驟一。五、重組溶瘤腺病毒的鑒定1、PCR 鑒定分別將Ad-TERTp-ElA-1504第三代病毒液和Ad-TERTp-ElA-NC第三代病毒液進行如下鑒定(1)取IOOul病毒液，加入10 μ 1 10mg/ml的蛋白酶Κ，10μ 1 10% SDS溶液以及 4 μ 10. 5mol/L EDTA溶液，于37°C放置過夜。(2)酚-氯仿抽提獲得基因組DNA。(3)取Iul基因組DNA作為模板，用Fl和Rl組成的引物對進行PCR擴增。F1 5，-CCACGGAGGTGTTATTACCG-3，；Rl 5，-CACCGCACATTACAGAGTCG-3，。Fl和Rl的靶序列為腺病毒ElA基因，目的片段約200bp。PCR擴增的退火溫度為 55 "C。CN 102399777 A
說明書
7/8頁結果見圖12。泳道1和泳道2為Ad-TERTp-ElA-1504第三代病毒液，泳道3為 Ad-TERTp-ElA-NC第三代病毒液。2、WesternBlot 鑒定(l)EphA3表達的鑒定分別將Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液和Ad-TERTp-ElA-NC第六代病毒液進行如下鑒定(設置不加入病毒液的空白對照)在6孔板中鋪C4-2B細胞(3. 5 X IO5/孔)，次日換5% FBS培養(yǎng)基，加入病毒液(Μ0Ι = 10)，感染4 后提取蛋白進行WiesternBlot (采用EphA3抗體)，檢測EphA3基因的表達。結果見圖13。被Ad-TERTp-ElA-1504病毒液感染的細胞中EphA3基因表達明顯低于被Ad-TERTp-ElA-NC病毒液感染的細胞，也明顯低于和空白對照組的細胞。結果表明，重組溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-1504具有抑制腫瘤細胞內源性EphA3表達的作用。O) ElA表達的鑒定分別將Ad-TERTp-EIA-1504第六代病毒液、Ad-TERTp-ElA-NC第六代病毒液、 Ad- Δ Ε1Α-1504第四代病毒液、Ad- Δ ElA-NC第四代病毒液進行如下鑒定(設置不加入病毒液的空白對照)在6孔板中鋪C4-2B細胞(3. 5 X IO5/孔)，次日換5 % FBS培養(yǎng)基，加入病毒液，感染4 后提取蛋白進行WiesternBlot (采用ElA抗體)，檢測ElA基因的表達。Ad-AE1A-1504病毒液設置MOI = 100和MOI = 200兩個轉染劑量組。Ad-AElA-NC 設置MOI = 200 —個轉染劑量組。Ad-TERTp-ElA-1504設置MOI = 10—個轉染劑量組。 Ad-TERTp-ElA-NC設置MOI = 10 一個轉染劑量組。結果見圖14。在MOI為10條件下，當Ad-TERTp-ElA-1504病毒液和 Ad-TERTp-ElA-NC病毒液感染C4-2B細胞后，可檢測到ElA基因的表達。在MOI為100-200 條件下，Ad- Δ EIA-1504病毒液和Ad- Δ ElA-NC病毒液感染C4-2B之后，均未檢測到ElA的表達。結果表明，Ad-TERTp-ElA-1504 和 Ad-TERTp-ElA-NC 中帶有 ElA 區(qū)。3、病毒CPE鑒定將Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液進行如下鑒定(設置不加入病毒液的空白對照)在6孔板中鋪7721細胞或L02細胞(4X105/孔)，次日換5 % FBS培養(yǎng)基，加入病毒液 (Μ0Ι = 10)，感染 48h 后觀察 CPE。結果見圖15。端粒酶陽性的肝癌細胞7721出現大量的CPE(白框所示)，而正常細胞L02很少出現CPE現象。結果表明，Ad-TERTp-ElA-1504可以特異性的殺死端粒酶陽性的腫瘤細胞，具有溶瘤病毒的特性。4、病毒功能鑒定(1)分別將Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液、Ad-TERTp-ElA-NC第六代病毒液、 Ad- Δ Ε1Α-1504第四代病毒液、Ad- Δ ElA-NC第四代病毒液進行如下鑒定(設置不加入病毒液的空白對照)在96孔板中鋪C4-2B細胞(5000個細胞/孔)，次日換5% FBS-1640培養(yǎng)基，加入病毒液(Μ0Ι = 1)，設置3個復孔，自感染開始計時，每隔M小時取樣進行MTT試驗，測定相對細胞存活率，細胞存活率=實驗組的0D490/空白對照組0D490。結果見圖16。Ad-TERTp-EIA-1504 病毒液和 Ad-TERTp-ElA-NC 病毒液對 C4-2B 細胞的生長均有明顯的抑制作用。Ad- Δ Ε1Α-1504病毒液和Ad- Δ ElA-NC病毒液對 C4-2B細胞則無明顯抑制作用。以上結果表明，攜帶EphA3干擾序列的重組溶瘤腺病毒Ad-TERTp-ElA-1504與單純溶瘤病毒Ad-TERTp-ElA-NC或者單純應用EphA3干擾序列的腺病毒Ad- Δ Ε1Α-1504相比，其腫瘤抑制作用顯著增強。(2)將Ad-TERTp-ElA-1504第六代病毒液進行如下鑒定(設置不加入病毒液的空白對照)在96孔板中鋪C4-2B細胞或2BS細胞(5000個細胞/孔)，次日換5% FBS-1640 培養(yǎng)基，加入病毒液(設置MOI = 0. 25、1、5三個劑量組)，每組設置3個復孔，自感染開始計時，每隔M小時取樣進行MTT試驗，測定相對細胞存活率，細胞存活率=實驗組的0D490/ 空白對照組0D490。結果見圖17。在病毒MOI值為0.25、1、5條件下，隨著病毒量的增加，可見 Ad-TERTp-ElA-1504病毒液對C4-2B的抑制作用明顯增強(圖17A)，而對2BS細胞的抑制作用不明顯(圖17B)。當MOI值為5時，感染后第7天時，對C4-2B細胞存活的抑制作用可達到90%，而對2BS細胞的抑制作用則不明顯?？梢夾d-TERTp-ElA-1504溶瘤腺病毒能特異性抑制腫瘤細胞的生長。
權利要求
1.一種DNA片段，包括DNA片段甲和DNA片段乙；所述DNA片段甲包括TO啟動子和 1504-siRNA編碼DNA ；所述DNA片段乙包括TERTp啟動子、ElA基因和E1B55K-E1B19K基因；所述U6啟動子如序列表的序列1自5’末端第192至211位核苷酸所示；所述 1504-siRNA編碼DNA如序列表的序列1自5，末端第271至291位核苷酸所示；所述TERTp啟動子如序列表的序列2自5’末端第9至第461位核苷酸所示；所述ElA 基因如序列表的序列2自5，末端第469至1妨4位核苷酸所示；所述E1B5^(-E1B19K基因如序列表的序列2自5’末端第1623至第3418位核苷酸所示。
2.如權利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段甲為如下(a)或(b)(a)序列表的序列1自5’末端第192至291位核苷酸所示的DNA分子；(b)序列表的序列1所示的DNA分子；所述DNA片段乙為如下(c)或(d)(c)序列表的序列2所示自5’末端第9至3418位核苷酸所示的DNA分子；(d)序列表的序列2所示的DNA分子。
3.如權利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于所述DNA片段中，還包括抗性篩選基因；所述抗性篩選基因優(yōu)選為卡那霉素抗性基因。
4.含有權利要求1至3中任一所述DNA片段的重組質粒或重組腺病毒。
5.如權利要求4所述的重組質粒，其特征在于所述重組質粒為如下(e)或(f)(e)在pshuttle穿梭質粒的多克隆位點插入權利要求1至3中任一所述DNA片段得到的重組質粒psh-1504-TETPE ；(f)將pAdEasy-Ι載體的LeftArm和Right Arm重組位點之間的小片段取代為權利要求1至3中任一所述DNA片段得到的重組質粒pAd-1504-TETPE ；所述重組質粒psh-1504-TETPE優(yōu)選為通過如下方法制備得到的重組質粒(1)在pshuttle穿梭質粒的KpnI和EcoRV酶切位點間插入權利要求1或2所述DNA 片段甲，得到重組質粒pshuttle-1504-siRNA ；(2)在所述重組質粒pshuttle-1504-siRNA的NotI和MfeI酶切識別位點之間插入權利要求1或2所述DNA片段乙，得到重組質粒psh-1504-TETPE。
6.如權利要求5所述的重組質粒，其特征在于所述重組質粒pAd-1504-TETPE的制備方法如下①用限制性內切酶PmeI酶切所述重組質粒psh-1504-TETPE，得線性DNA；②將所述線性DNA和pAdEasy-Ι載體共轉染BJ5183細胞，得到重組質粒 pAd-1504-TETPE。
7.如權利要求4所述的重組腺病毒，其特征在于所述重組腺病毒為將權利要求5或 6所述重組質粒pAd-1504-TETPE轉染哺乳動物細胞并表達得到的重組腺病毒；所述哺乳動物細胞優(yōu)選為細胞。
8.權利要求4或7所述重組腺病毒在制備抑制腫瘤細胞和/或抑制癌癥的藥物中的應用。
9.一種抑制腫瘤細胞和/或抑制癌癥的藥物，其特征在于它的活性成分為權利要求4或7所述重組腺病毒。
10.如權利要求8所述的應用，或如權利要求9所述的藥物，其特征在于 所述腫瘤細胞為前列腺癌細胞或肝癌細胞；所述前列腺癌細胞優(yōu)選為C4-2B細胞；所述肝癌細胞優(yōu)選為7721細胞；所述癌癥為前列腺癌細胞或肝癌；所述前列腺癌優(yōu)選為由C4-2B細胞引起的前列腺癌；所述肝癌優(yōu)選為由7721細胞引起的肝癌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組質粒及應用其制備的重組溶瘤腺病毒。本發(fā)明中，將DNA片段甲(自上游至下游包括兩個元件U6啟動子元件、1504-siRNA編碼元件)和DNA片段乙(TERTp啟動子元件、E1A基因元件、E1B55K-E1B19K基因元件)插入溶瘤腺病毒載體，得到了重組溶瘤腺病毒載體。將該重組溶瘤腺病毒載體轉染細胞并進行培養(yǎng)，可以得到含有重組溶瘤腺病毒的培養(yǎng)上清。該重組溶瘤腺病毒中，由腫瘤特異啟動子啟動(TERTp啟動子)腺病毒早期復制基因E1A的表達，即在正常細胞中不表達或表達量極低，當在腫瘤細胞中表達時同時表達1504-siRNA。該重組腺病毒具有很好的腫瘤細胞特異性，能夠發(fā)揮溶瘤和抑瘤的雙重作用，具有很高的醫(yī)療價值。
文檔編號C12N7/01GK102399777SQ20111032239
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權日2011年10月21日
發(fā)明者周建光, 趙亞麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所