專(zhuān)利名稱(chēng)：一種培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌的方法，涉及一種顯著促進(jìn)丁酸梭菌持續(xù)生長(zhǎng)的含碳有機(jī)物組成成分。
背景技術(shù)：
丁酸梭菌，又名酪酸菌，它是一種專(zhuān)性厭氧芽胞桿菌，具有調(diào)節(jié)人體或動(dòng)物胃腸道菌群組成、預(yù)防和治療各種腹瀉、促生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫力等多重功效。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)丁酸梭菌的研究主要集中在醫(yī)學(xué)方面，飼料方面的研究也逐漸升溫。丁酸梭菌菌劑的活性與其數(shù)量密切相關(guān)，為推進(jìn)其應(yīng)用，關(guān)鍵是要解決菌種的高密度培養(yǎng)問(wèn)題。由于丁酸梭菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸類(lèi)代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致培養(yǎng)液的 PH值迅速下降；當(dāng)培養(yǎng)液的pH值降至4.5以下時(shí)，菌體的生長(zhǎng)繁殖就會(huì)受到抑制。因此， 采用傳統(tǒng)的菌種生產(chǎn)工藝，菌種的數(shù)量得不到保證，且生產(chǎn)成本高。高密度培養(yǎng)技術(shù)廣泛地應(yīng)用于各種微生物的生產(chǎn)中，它是指采用一定的工藝技術(shù)，維持微生物生長(zhǎng)的適宜條件，延長(zhǎng)微生物的指數(shù)增殖過(guò)程，從而得到高濃度的細(xì)胞。要實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌的高密度培養(yǎng)，必須解除其代謝產(chǎn)物有機(jī)酸對(duì)丁酸梭菌自身生長(zhǎng)的抑制作用。有針對(duì)性地解除這種抑制，實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌的高密度培養(yǎng)，已成為研究和開(kāi)發(fā)丁酸梭菌微生態(tài)制劑的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌的方法，有效提高培養(yǎng)物中的丁酸梭菌濃度，提高丁酸梭菌產(chǎn)品的質(zhì)量。本發(fā)明在常規(guī)液體培養(yǎng)基中添加尿素作為調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH的生理堿性鹽，并將尿素在液體培養(yǎng)基中的濃度控制在1.0-3.0 g/L范圍內(nèi)。用尿素作為生理堿性鹽替代碳酸鈉等緩沖劑緩解培養(yǎng)基PH快速下降，不僅能夠增加培養(yǎng)物中的丁酸梭菌T4濃度，而且能夠提高丁酸梭菌T4的質(zhì)量。如果添加的尿素濃度低于1. 0 g/L,由于濃度較低，會(huì)導(dǎo)致體系緩沖能力不足，丁酸梭菌T4產(chǎn)生的有機(jī)酸使培養(yǎng)基pH迅速下降，使丁酸梭菌T4自身的生長(zhǎng)受到抑制。當(dāng)尿素添加量高于3. 0 g/L,由于尿素本身水解后生成NH4+,高濃度的NH4+對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸菌的生長(zhǎng)同樣表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)顯示，在丁酸梭菌T4液體培養(yǎng)基中添加l.(T3.0 g/L的尿素， 是促進(jìn)丁酸梭菌"Γ4生長(zhǎng)的優(yōu)化控制方法。本發(fā)明研究確定一種能夠有效緩解培養(yǎng)基pH快速下降、改善細(xì)菌絮體形態(tài)和促進(jìn)丁酸梭菌T4快速持續(xù)生長(zhǎng)的生理堿性鹽。一方面可以緩解培養(yǎng)基pH快速下降對(duì)丁酸梭菌T4生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制，另一方面還可以改善細(xì)菌絮體形態(tài)、促進(jìn)丁酸梭菌T4的持續(xù)生長(zhǎng)。
本發(fā)明的工作原理是
在厭氧條件下，丁酸梭菌T4利用大分子有機(jī)化合物作為碳源和能源進(jìn)行自身生長(zhǎng)和代謝，其代謝末端產(chǎn)物包含丁酸和氫氣等，丁酸在溶液中會(huì)離解出氫離子使培養(yǎng)基氫離子濃度升高，培養(yǎng)物的PH持續(xù)下降。當(dāng)PH低于丁酸梭菌T4自身所能承受的閾值時(shí)，丁酸梭菌T4的生長(zhǎng)和代謝便會(huì)受到抑制。當(dāng)向培養(yǎng)基中添加尿素時(shí)，尿素首先在丁酸梭菌T4尿素水解酶的作用下水解出 CO2和NH4+,由于1分子的尿素產(chǎn)生1分子的(X)2和2分子的NH4+,因此，尿素水解后培養(yǎng)體系的氫離子濃度降低，PH升高。根據(jù)尿素的這種特性可將其作為一種促進(jìn)發(fā)酵產(chǎn)酸菌生長(zhǎng)的生理堿性鹽，緩解丁酸梭菌T4產(chǎn)酸時(shí)pH下降過(guò)快而對(duì)自身生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用。另外， 尿素還能夠改善丁酸梭菌T4絮體形態(tài)，從而支持丁酸梭菌T4的持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)。因此，添加尿素對(duì)丁酸梭菌T4的生長(zhǎng)具有雙重促進(jìn)作用。本發(fā)明的有益效果是
添加尿素作為生理堿性鹽可在較高程度上緩解因培養(yǎng)物pH快速降低而對(duì)丁酸梭菌T4 生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用，同時(shí)，能夠改善丁酸梭菌T4絮體形態(tài)，使丁酸梭菌T4在發(fā)酵產(chǎn)酸的條件下持續(xù)生長(zhǎng)，最終達(dá)到較高的細(xì)胞濃度。促進(jìn)了工業(yè)化生產(chǎn)出超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌 T4菌液。


圖1是添加不同緩沖劑對(duì)丁酸梭菌T4細(xì)胞濃度的影響。圖2是添加不同緩沖劑對(duì)培養(yǎng)基pH的影響。
具體實(shí)施例方式首先配制丁酸梭菌T4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其組成為(g/L)葡萄糖10，酵母粉2，蛋白胨 2，NaCl 4,MgS04 ·7Η20 0. 1，F(xiàn)eSO4 · 7Η20 0. 1，L-半胱氨酸 0. 5，微量元素液[MnSO4 ‘ 7Η20 0. 01，CaCl2 · 2Η20 0. 01, ZnSO4 · 7Η20 0. 05，NaMoO4 0· 01，H3BO3 0· 01，CoCl2 · 6Η20 0. 2， AlK(SO4)2 0.01] 10 mL，維生素液[抗壞血酸0.025，鈷銨素0.01，葉酸0.01，肌酸0.025] 10 mL，刃天青(0. 1%) 1 mL，初始pH調(diào)節(jié)為7. 2。將配制好的丁酸梭菌T4培養(yǎng)基放入500 mL具塞錐形瓶?jī)?nèi)在124°C下滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫后，通過(guò)0.45 ym濾膜加入不同濃度的緩沖劑，以不加入緩沖劑的空白作為對(duì)照，考察不同類(lèi)型緩沖劑對(duì)丁酸梭菌T4 生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)在溫度37 °C，轉(zhuǎn)速120 rpm的搖床中進(jìn)行，每5 h取樣分析細(xì)胞濃度及 pH，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。從圖1可以看出，添加緩沖物質(zhì)能不同程度的增加細(xì)菌的細(xì)胞濃度。在本實(shí)驗(yàn)中， 丁酸梭菌T4接種后沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的延遲期，接種后細(xì)胞濃度即開(kāi)始增長(zhǎng)。在最初的5 h 內(nèi)，添加緩沖物質(zhì)與不添加緩沖物質(zhì)對(duì)細(xì)胞濃度的影響不大，其細(xì)胞濃度均在0. 4 g/L左右，這是因?yàn)樵谧畛醯? h內(nèi)，培養(yǎng)基中的pH變化較小，所有培養(yǎng)基中的pH均維持在6. 0 以上，已知丁酸梭菌T4適宜生長(zhǎng)的pH在7. 2^4. 5之間，因此，此時(shí)丁酸梭菌T4生長(zhǎng)基本不受PH的限制。在5 10內(nèi)，添加緩沖物質(zhì)的培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度增加明顯，其中添加尿素對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的促進(jìn)最顯著，培養(yǎng)至10 h時(shí)，丁酸梭菌T4細(xì)胞濃度達(dá)到1.11 g/L，與不加緩沖物質(zhì)的空白相比，其細(xì)胞濃度提高了 1倍。培養(yǎng)10 h后，不加緩沖物質(zhì)的空白中細(xì)胞增長(zhǎng)趨于停止，至培養(yǎng)結(jié)束的25 h止，細(xì)胞濃度僅增加了 0.09 g/L。添加緩沖物質(zhì)的培養(yǎng)基中細(xì)菌細(xì)胞濃度在10 h后仍然能夠保持一定的增長(zhǎng)速度，至培養(yǎng)結(jié)束的25 h時(shí)，添加尿素的培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度可達(dá)到1. 7 g/L，是空白的2. 61倍。從圖2可以看出，添加緩沖物質(zhì)能在一定程度上減緩培養(yǎng)基pH的降低。培養(yǎng)至5 h時(shí)，不添加緩沖物質(zhì)的培養(yǎng)基pH已從初始的7. 2降至6. 0，添加緩沖物質(zhì)的培養(yǎng)基pH均在6. 7以上，其中以添加尿素的效果最顯著，培養(yǎng)基的pH維持在6. 86。5 10h時(shí)不添加緩沖劑的空白PH迅速降至4. 0，添加磷酸鹽緩沖液的培養(yǎng)基pH降至5. 4，而添加碳酸鹽和尿素的培養(yǎng)基PH維持在6.0以上。至培養(yǎng)結(jié)束的25 h時(shí)，除了添加碳酸鈉作緩沖劑的培養(yǎng)基，其它體系的PH均降低到3. 5以下，如此低的pH必然會(huì)對(duì)丁酸梭菌T4的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用，使丁酸梭菌T4生長(zhǎng)基本處于停滯狀態(tài)，發(fā)酵結(jié)束。總體來(lái)看，添加緩沖劑能使培養(yǎng)基的PH較長(zhǎng)時(shí)間的停留在4. 0以上，這樣能給丁酸梭菌T4生長(zhǎng)提供更足夠的生長(zhǎng)時(shí)間。其中，以碳酸鈉對(duì)PH的緩解效果最佳，但添加碳酸鈉并不能獲得最高的細(xì)胞濃度，反而以添加尿素的效果最佳。這可能是因?yàn)槟蛩爻四軌蜃鳛樯韷A性鹽調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH，還能夠改善細(xì)菌絮體形態(tài)，促進(jìn)丁酸梭菌T4持續(xù)生長(zhǎng)。綜合圖1和圖2的結(jié)果，添加緩沖劑減緩培養(yǎng)基pH降低能有效促進(jìn)丁酸梭菌T4 生長(zhǎng)，但僅從控制PH角度促進(jìn)丁酸梭菌T4生長(zhǎng)其細(xì)胞濃度增加有限，表現(xiàn)在添加碳酸鈉后，丁酸梭菌T4生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)培養(yǎng)基pH仍能保持在4. 5左右，而此時(shí)細(xì)胞濃度僅能達(dá)到0. 9 g/L。而采用尿素作為緩沖劑時(shí)，雖然培養(yǎng)基的pH最終也會(huì)降低到3. 5以下，但是細(xì)胞濃度的升高幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于采用碳酸鈉作為緩沖劑時(shí)的升高幅度。因此，在丁酸梭菌T4液體培養(yǎng)基中添加1. 0 3. 0 g/L的尿素，是促進(jìn)丁酸梭菌T4生長(zhǎng)的優(yōu)化控制方法。另外，添加尿素后獲得的批式培養(yǎng)的細(xì)胞濃度可達(dá)到連續(xù)培養(yǎng)或在線PH控制獲得的丁酸梭菌T4細(xì)胞濃度，這在丁酸梭菌T4的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)上具有非常重要的意義。
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌的方法，其特征在于在常規(guī)丁酸梭菌培養(yǎng)基中添加尿素作為生理堿性鹽促進(jìn)丁酸梭菌生。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將尿素在液體培養(yǎng)基中的濃度控制在 l.(T3. 0 g/L 范圍內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌T4的方法。其特征在于在常規(guī)丁酸梭菌T4培養(yǎng)基中采用尿素作為生理堿性鹽促進(jìn)丁酸梭菌T4生長(zhǎng)；并將尿素在液體培養(yǎng)基中的濃度控制在1.0~3.0g/L范圍內(nèi)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于既能在一定程度上緩解因培養(yǎng)基pH降低過(guò)快而對(duì)丁酸梭菌T4生長(zhǎng)產(chǎn)生的抑制作用，同時(shí)又可以促進(jìn)丁酸梭菌T4持續(xù)生長(zhǎng)，最終達(dá)到較高的細(xì)胞濃度。促進(jìn)了工業(yè)化生產(chǎn)出超高細(xì)胞濃度丁酸梭菌T4液。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102329761SQ201110324228
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2011年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月24日
發(fā)明者王興祖 申請(qǐng)人:沈陽(yáng)建筑大學(xué)