專利名稱：一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，特別是涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
蕎麥?zhǔn)且环N藥食同源的植物，有苦蕎和甜蕎兩種。由于苦蕎其籽粒、根、莖、葉及花等多種器官中都含有大量黃酮類物質(zhì)，因而被譽(yù)為“降血糖、降血壓、降血脂”的三降食品。 隨著其營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值的不斷發(fā)現(xiàn)，苦蕎麥植物資源越來越受到人們的青睞。由于苦蕎麥植物自花授粉的特點(diǎn)使其在生產(chǎn)育種上人工雜交難以成功，因此目前苦蕎麥在育種方面仍未獲得重大突破。目前借助發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的研究已成為近些年的研究熱點(diǎn)。發(fā)根農(nóng)桿菌中含有致使植物產(chǎn)生毛狀根的Ri質(zhì)粒，在Vir區(qū)基因產(chǎn)物的協(xié)助下，Ri 質(zhì)粒中的T-DNA片段能轉(zhuǎn)移進(jìn)植物核基因組中，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化成功的植物產(chǎn)生大量的毛狀根。 毛狀根具有生長速度快，不需要添加外源激素，并能提供大量可藥用的次生代謝產(chǎn)物的特征。農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上攜帶的生根基因不僅能使被感染植物部位產(chǎn)生大量的毛狀根，而且由產(chǎn)生的毛狀根還可以獲得再生的轉(zhuǎn)化植株，這些植株可表現(xiàn)出許多穩(wěn)定遺傳的表現(xiàn)變異。目前已有關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蕎麥植物遺傳轉(zhuǎn)化方面研究的報(bào)道，如黃萱的博士論文《小麥NBS-LRR抗性基因克隆以及基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苦蕎遺傳轉(zhuǎn)化》和金紅的論文《關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌A4對(duì)蕎麥的遺傳轉(zhuǎn)化》。從這些報(bào)道可發(fā)現(xiàn)， 目前在由發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)蕎麥植物的遺傳轉(zhuǎn)化中所采用的外植體只有子葉、莖尖和下胚軸較幼嫩的植物器官。采用植物幼嫩器官作為外植體，雖然因細(xì)胞壁較薄，能促使農(nóng)桿菌的 T-DNA更易進(jìn)入被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中而使其轉(zhuǎn)化成功；但另一方面，由于植物幼嫩器官的細(xì)胞分化程度較低，細(xì)胞中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物也較低，所以誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物的含量也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法能產(chǎn)生含有大量次生代謝產(chǎn)物的毛狀根。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的解決方案由如下步驟構(gòu)成菌種的活化培養(yǎng)將農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 2天后，用接種環(huán)挑取生長良好的單菌接入YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)1 2天至菌液0D_ = 0. 2 0. 6，所述農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 1601，培養(yǎng)溫度為25 30°C ； 無菌苗的獲得將苦蕎種子的種皮剝?nèi)?，先?5%的酒精消毒30 60s，再用 0. 升汞消毒3 lOmin，然后用無菌水沖洗2 5次后，接種于不加激素的MS培養(yǎng)基上， 在22 28°C、光照強(qiáng)度1000 20001x，、每天光照8 12h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)選取葉齡在2 30天、生長狀況良好的苦蕎麥無菌苗葉片作為外植體，先將外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+2，4-D 0. 5 4mg · L^+6-BA 0. 1 1. 5mg · L^+NAA 0 Img · L—1+乙磺酸0 Ig · L—1+蔗糖15 50g · L—1中進(jìn)行0 4天的預(yù)培養(yǎng)，然后將其取出放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中浸染2 18min，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉(zhuǎn)入不加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行0 4 天的共培養(yǎng)，接著再轉(zhuǎn)入含有頭孢噻肟鈉200 500mg/L的脫菌水中浸洗2 6min，然后用無菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉(zhuǎn)接入除菌培養(yǎng)基MS+頭孢噻肟鈉300 600mg/L+瓊脂6 8g/L+蔗糖15 40g/L中進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，直到產(chǎn)生大量毛狀根。上述不加激素的MS培養(yǎng)基為MS+瓊脂6 8g/L+蔗糖15 50g/L。本發(fā)明由于采用分化程度相對(duì)較高且黃酮類物質(zhì)含量最高的苦蕎葉片作為外植體，因此大大提高了毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量，為苦蕎麥有效組分的快速生產(chǎn)提供了一種新的途徑。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1(1)菌種的活化培養(yǎng)將發(fā)根農(nóng)桿菌Ril601劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 天后，用接種環(huán)挑取生長良好的單菌接入YEB液體培養(yǎng)基中，于28°C振蕩培養(yǎng)1天左右至菌液 OD600 = 0 . 5 ；(2)無菌苗的獲得將苦蕎種子的種皮剝?nèi)?，放在超凈工作臺(tái)上，先用75%的酒精消毒40s，再用0. 升汞消毒5min，然后用無菌水沖洗4次后，接種于MS固體培養(yǎng)基上，在 25°C、光照強(qiáng)度12001x，、每天光照IOh的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，獲得苦蕎麥無菌苗；(3)遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)選取葉齡在12天左右、生長狀況良好的苦蕎麥無菌苗葉片作為外植體，先將外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基MSiZd-DZmg^L-1+6-BA 0. 3mg'L^+NAA 0. Img ·Γ1+ 乙磺酸0. 5g · Γ1+蔗糖30g · Γ1中，在25°C預(yù)培養(yǎng)3天，然后將其取出放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中浸染12分鐘，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基MS+瓊脂6. 8g/L+蔗糖30g/L上進(jìn)行2天的共培養(yǎng)，接著再轉(zhuǎn)入含有頭孢噻肟鈉400mg/L的脫菌水中浸洗5min，然后用無菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉(zhuǎn)接入除菌培養(yǎng)基MS+頭孢噻肟鈉500mg/L+瓊脂6. 8g/L+蔗糖30g/L鈉中進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)25天后產(chǎn)生大量毛狀根。實(shí)施例2將實(shí)施例1步驟(3)中所選取的外植體改為葉齡為30天、生長狀況良好的苦蕎麥葉片，其它步驟同實(shí)施例1 ；培養(yǎng)25天后統(tǒng)計(jì)毛狀根轉(zhuǎn)化率低于實(shí)施例1。說明處于不同生長階段的外植體，在用農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的過程中，組成器官的細(xì)胞所處于的感受態(tài)是不同的；通常生長期越長的器官，其細(xì)胞的分化程度也就越高，細(xì)胞也就越不容易調(diào)整到農(nóng)桿菌T-DNA易于進(jìn)入的感受狀態(tài)，因而會(huì)使毛狀根的轉(zhuǎn)化率較低。實(shí)施例3本實(shí)施例省去了實(shí)施例1步驟(3)中所述的預(yù)培養(yǎng)步驟，將從苦蕎麥無菌苗上選取的葉片直接浸染到農(nóng)桿菌液中進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)處理，其它步驟同實(shí)施例1，培養(yǎng)25天后統(tǒng)計(jì)毛狀根轉(zhuǎn)化率明顯低于實(shí)施例1。說明在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)處理可以有效地減輕農(nóng)桿菌在轉(zhuǎn)化過程中對(duì)外植體產(chǎn)生的傷害，并能使外植體細(xì)胞調(diào)整到適宜農(nóng)桿菌誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的狀態(tài)。實(shí)施例4
本實(shí)施例省去了實(shí)施例1步驟(3)中所述的共培養(yǎng)步驟，其它步驟同實(shí)施例1，培養(yǎng)25天后統(tǒng)計(jì)毛狀根轉(zhuǎn)化率明顯低于實(shí)施例1。說明取消共培養(yǎng)步驟雖然也能產(chǎn)生毛狀根，但毛狀根轉(zhuǎn)化率較低。
權(quán)利要求
1. 一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于包括如下步驟 菌種的活化培養(yǎng)將農(nóng)桿菌劃線接種于YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 2天后，用接種環(huán)挑取生長良好的單菌接入YEB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)1 2天至菌液OD6tltl = 0. 2 0. 6，所述農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌Ril601，培養(yǎng)溫度為25 30°C ；無菌苗的獲得將苦蕎種子的種皮剝?nèi)?，先?5%的酒精消毒30 60s，再用0. 升汞消毒3 lOmin，然后用無菌水沖洗2 5次后，接種于不加激素的MS培養(yǎng)基上，在22 28°C、光照強(qiáng)度1000 20001x，、每天光照8 12h的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)選取葉齡在2 30天、生長狀況良好的苦蕎麥無菌苗葉片作為外植體， 先將外植體接種于預(yù)培養(yǎng)基MS+2，4-D 0. 5 4mg · L_1+6-BA 0· 1 1. 5mg · I^+NAA O Img -L"1+乙磺酸O Ig 蔗糖15 50g -L"1中進(jìn)行O 4天的預(yù)培養(yǎng)，然后將其取出放入上述制得的農(nóng)桿菌菌液中浸染2 18min，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，取出外植體， 用無菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液，再轉(zhuǎn)入不加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行O 4天的共培養(yǎng)，接著再轉(zhuǎn)入含有頭孢噻肟鈉200 500mg/L的脫菌水中浸洗2 6min，然后用無菌濾紙吸干脫菌水后，將其轉(zhuǎn)接入除菌培養(yǎng)基MS+頭孢噻肟鈉300 600mg/L+瓊脂6 8g/L+ 蔗糖15 40g/L中進(jìn)行除菌培養(yǎng)，每隔5-7天轉(zhuǎn)接一次，直到產(chǎn)生大量毛狀根。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苦蕎麥葉片的遺傳轉(zhuǎn)化方法，該方法包括如下步驟(1)將發(fā)根農(nóng)桿菌接入YEB培養(yǎng)基中，制備所需的菌液；(2)將苦蕎種子接種于不加激素的MS培養(yǎng)基中獲得無菌苗；(3)取無菌苗葉片作為外植體，將外植體通過預(yù)培養(yǎng)后，浸入已活化的農(nóng)桿菌菌液中，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸后，取出外植體轉(zhuǎn)入不加激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，最后轉(zhuǎn)接入含有頭孢噻肟鈉的除菌培養(yǎng)基中進(jìn)行除菌培養(yǎng)，直到產(chǎn)生大量毛狀根。本發(fā)明可大大提高毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102352378SQ20111032438
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月23日
發(fā)明者孫雁霞, 張紅玉, 彭鐮心, 湯有舉, 王躍華, 胡一冰, 趙鋼, 鄔曉勇, 鄒亮, 陳燕 申請(qǐng)人:成都大學(xué)