專利名稱：紅豆杉干細胞培養(yǎng)、分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明具 體涉及一種植物干細胞分離方法，特別涉及一種紅豆杉干細胞培養(yǎng)、分離方法。
背景技術(shù)：
從藥用植物紅豆杉中提取的藥用成份紫杉醇對于多種癌癥的治療有著重要的應(yīng)用價值和前景。由于野生紅豆杉是珍稀保護植物，法律禁止砍伐。生產(chǎn)上采用大量種植紅豆杉的辦法為分離提取紫杉醇提供原料。但由于紅豆杉生長周期長，占用耕地；又由于只有紅豆杉樹皮中才含有紫杉醇，且含量極低，大約10噸樹皮中才能提取I公斤紫杉醇，所以這種傳統(tǒng)的生產(chǎn)技術(shù)的成本極高。另外，提煉紫杉醇的過程中，由于有外加的化學(xué)溶劑，導(dǎo)致提煉后余下不能清除的有毒殘余物，超出指定的劑量而影響治療的功效?，F(xiàn)有技術(shù)是通過離體懸浮培養(yǎng)紅豆杉的細胞來生產(chǎn)紫杉醇，這種方法不受紅豆杉生長季節(jié)的限制就可以通過規(guī)?；a(chǎn)來獲得紫杉醇。通常取紅豆杉的莖或葉片為外殖體在特定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過脫分化階段誘導(dǎo)成具有分裂能力的愈傷細胞，進一步將該細胞懸浮培養(yǎng)來生產(chǎn)紫杉醇。但目前已有的技術(shù)在分離紅豆杉細胞時，均采用已經(jīng)分化的組織器官為外殖體，通過離體培養(yǎng)階段的培養(yǎng)(脫分化過程)將其誘導(dǎo)為具有分化能力的愈傷細胞。但這種細胞的本質(zhì)是來源于已經(jīng)分化的體細胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不強。在工業(yè)化量產(chǎn)過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)細胞系退化，分裂能力弱，很難進行超大體積的培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種紅豆杉干細胞培養(yǎng)、分離方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，提供一種具有無限分裂能力且分裂能力強的處于未分化狀態(tài)的紅豆杉干細胞的培養(yǎng)、分離方法，該干細胞由于本身的性質(zhì)，在通過離體懸浮培養(yǎng)方法可以進行超大體積的培養(yǎng)，得到大量的干細胞，從而可以大量生產(chǎn)紫杉醇。本發(fā)明解決問題采用的技術(shù)方案是:紅豆杉干細胞培養(yǎng)、分離方法，其特征在于:首先將東北紅豆杉的直徑為I厘米的當(dāng)年生嫩枝經(jīng)過0.1 %的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內(nèi)的外殖體切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，25°C黑暗下培養(yǎng)；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基為含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，每兩周繼代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細胞。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明中培養(yǎng)的干細胞是處于未分化狀態(tài)的細胞，具有無限分裂的能力，所以懸浮培養(yǎng)中如果采用干細胞將可以避免脫分化體細胞的缺點，可以得到大量的干細胞，從而可以大量的生產(chǎn)紫杉醇，滿足患者的需要。


圖1是本發(fā)明紅豆杉外植體切段圖；圖2是本發(fā)明紅豆杉形成層干細胞誘導(dǎo)增殖圖；圖3是 本發(fā)明紅豆杉干細胞繼代增殖圖。
具體實施例方式實施例1:本發(fā)明紅豆杉干細胞的培養(yǎng)、分離方法，首先將東北紅豆杉的直徑為I厘米的當(dāng)年生嫩枝經(jīng)過0.1 %的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內(nèi)的外殖體切片(見附圖1)，放置在含有0.5mg.L-1毒莠定與0.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，25°C黑暗下培養(yǎng)。由于形成層的干細胞分裂速度快，導(dǎo)致形成層干細胞團自然與外殖體其余部分分裂開來(見附圖2)，這種干細胞團質(zhì)地致密，表面較光滑平整。兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)(見附圖3)。繼代培養(yǎng)基為含有0.5mg.L-1毒莠定與0.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基，每兩周繼代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細胞。實施例2:首先將東北紅豆杉的直徑為I厘米的當(dāng)年生嫩枝經(jīng)過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內(nèi)的外殖體切片，放置在含有0.2mg.L-1毒莠定與1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，25°C黑暗下培養(yǎng)；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基為含有0.2mg.L-1毒莠定與1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，每兩周繼代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細胞。實施例3:首先將東北紅豆杉的直徑為I厘米的當(dāng)年生嫩枝經(jīng)過0.1%的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內(nèi)的外殖體切片，放置在含有2.0mg.L-1毒莠定與0.2mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，25°C黑暗下培養(yǎng)；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基為含有2.0mg.L-1毒莠定與0.2mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，每兩周繼代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細胞。另外可以考慮通過顯微操作分離莖尖生長點、根尖生長點或形成層出的干細胞，然后直接在離體條件下培養(yǎng)分離出來的干細胞。但這種方案的操作難度較大，成功的幾率很低。針對已有的紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)體系中體細胞的缺點，本發(fā)明注重培養(yǎng)和分離紅豆杉的干細胞。因為干細胞是處于未分化狀態(tài)的細胞，具有無限分裂的能力，且分裂能力強，所以懸浮培養(yǎng)中如果采用干細胞進行培養(yǎng)將可以避免脫分化體細胞的缺點，且短期內(nèi)可以得到大量的干細胞，有利于紫杉醇的大量生產(chǎn)，滿足患者的需求。
權(quán)利要求
1.紅豆杉干細胞培養(yǎng)、分離方法，其特征在于:首先將東北紅豆杉的直徑為I厘米的當(dāng)年生嫩枝經(jīng)過0.1 %的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內(nèi)的外殖體切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，25°C黑暗下培養(yǎng)；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基為含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上， 每兩周繼代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細胞。
全文摘要
紅豆杉干細胞培養(yǎng)、分離方法，其特征在于首先將東北紅豆杉的直徑為1厘米的當(dāng)年生嫩枝經(jīng)過0.1％的升汞消毒處理10分鐘，然后從嫩枝上切下包含周皮、韌皮部和形成層在內(nèi)的外殖體切片，放置在含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，25℃黑暗下培養(yǎng)；兩周后將形成層明顯增殖的外殖體取出，分離形成層干細胞并轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)基為含有0.2-2.0mg.L-1毒莠定與0.2-1.5mg.L-1萘乙酸的B5培養(yǎng)基上，每兩周繼代一次，短期內(nèi)可以獲得大量的干細胞。本發(fā)明中培養(yǎng)的干細胞是處于未分化狀態(tài)的細胞，具有無限分裂的能力，可以得到大量的干細胞，從而可以大量的生產(chǎn)紫杉醇，滿足患者的需要。
文檔編號C12N5/02GK103087974SQ20111033083
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者黃濤 申請人:鷺港生物藥業(yè)有限公司