專利名稱：一株降解酞酸酯的真菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境有機污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株降解酞酸酯的真菌及其在受污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鄰苯二甲酸酯又名酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs)，是由一個剛性平面芳烴和兩個可塑的非線性脂肪側(cè)鏈組成，通常用酞酸酐與各種醇類之間的酯化反應(yīng)獲得。PAh「泛存在于水體、土壤及空氣中。隨著塑料薄膜的廣泛農(nóng)用，以及大量城鎮(zhèn)污水和垃圾被排放到農(nóng)田，酞酸酯(phthalic acid esters, PAEs)已成為農(nóng)田土壤中最常見的有機污染物之一，是“第二個全球性PCB污染物”。由于PAEs的雌激素效應(yīng)，以及致畸、致癌和致突變特性，對生態(tài)環(huán)境、食品安全和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。人類通過皮膚、呼吸、食物鏈等途徑長期接觸環(huán)境雌激素PAEs，可對人體造成慢性危害，主要表現(xiàn)為生殖毒性。美國 EPA已經(jīng)列出了 6種PAEs作為優(yōu)控物。在我國環(huán)境優(yōu)先污染物中有3種肽酸酯化合物鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)。因此，修復(fù) PAEs污染的水土環(huán)境已成為研究的熱點。盡管PAEs能夠通過物理作用、臭氧氧化、紫外光解等途徑降解和轉(zhuǎn)移，但是微生物降解是環(huán)境界中PAh礦化的主要途徑。生物修復(fù)被認(rèn)為是目前去除環(huán)境中有機物的最經(jīng)濟有效的方法。近年來，PAEs的細(xì)菌降解已得到廣泛研究，但真菌降解PAEs的報道較少。與細(xì)菌相比，絲狀真菌具有較強的穿透力，可深入接觸土壤顆粒內(nèi)部污染物，因而對污染物的降解率會較高；另外，菌絲生長可將土壤穿出眾多微小孔隙，有利于營養(yǎng)物質(zhì)流通。利用叢枝菌根真菌(AM)可以促進PAh在土壤中的降解、降低其在植物中的殘留，但是AM需與特殊寄主植物的根系結(jié)合這一特性將限制這一技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對于根系未能接觸到的土壤中的污染物來說，可能降解困難。另外，目前以單一 PAE為降解對象的報道較多，但對于實際土壤環(huán)境而言，PAE污染往往是多種單體同時存在的復(fù)合污染，生物修復(fù)過程將由于污染物之間的相互作用、以及微生物與植物共同作用等變得更為復(fù)雜。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有PAEs污染土壤、水體環(huán)境修復(fù)技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一株能高效、快速降解PAEs的真菌。本發(fā)明的另一目的在于提供上述真菌在污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一株降解酞酸酯的真菌，是棒束梗霉(Isaria sp.)F3,已于2011年8月四日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi))，其簡稱為CCTCC，保藏編號為 CCTCC No. M 2011299。
上述的菌株F3來源于廣東省某地PAEs污染農(nóng)田的耕層(0 20cm) 土，經(jīng)人工富集、篩選及純化所得到，菌株命名為F3。該菌株具有以下分類學(xué)特征在察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 菌落直徑2. 5cm,絲絨狀至毛狀，米黃色，反面桔黃色；在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7d菌落直徑km， 絲絨狀至毛狀，米白色，反面桔黃色；在查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)7d直徑2. 5-3. Ocm,絨毛狀，白色，反面桔黃色。電子顯微鏡下觀察，該菌株菌體的形態(tài)為氣生菌絲透明，分生孢子單細(xì)胞，長橢圓形至棱形、細(xì)柱形。此外，該菌株的18S rDNA序列與Isaria(棒束梗霉屬) 的同源性達97. 1%。結(jié)合以上分類學(xué)形態(tài)特征和18S rDNA序列的比對結(jié)果，該菌株命名為棒束梗霉(Isaria sp. )F3。將棒束梗霉(Isariasp.)F3 用于降解酞酸酯(phthalic acid esters，PAEs) 棒束梗霉(Isaria sp.) F3在純培養(yǎng)條件下7天內(nèi)對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52. 7 66. 2%，其中 DMP 降解率 61. 5 78. 4%、DEP 53. 7 68. 1 %、D0P 29. 5 53. 7%。30d 內(nèi)將滅菌土壤中300mg/kgPAEs降解69. 0%，可顯著提高DMP、DEP、DOP復(fù)合污染土壤植物修復(fù)的效率。與其它菌株相比，該菌株具有高效的酞酸酯降解能力。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果棒束梗霉(Isaria sp. ) F3對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、 鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52. 7 66. 2%，其中DMP 降解率 61. 5 78. 4%、DEP 53. 7 68. 1 %、DOP 29. 5 53.7%。30d 內(nèi)將滅菌土壤中 300mg/kgPAEs降解69. 0%，可顯著提高DMP、DEP、D0P復(fù)合污染土壤植物修復(fù)的效率。與其它菌株相比，該菌株具有高效的酞酸酯降解能力。


圖1是棒束梗霉(Isariasp.)F3對混合體系中酞酸酯的降解效果。圖2是棒束梗霉(Isariasp.)F3對土壤介質(zhì)中酞酸酯的降解效果。圖3是棒束梗霉(Isaria sp.)F3與植物聯(lián)合作用對土壤介質(zhì)中酞酸酯的降解效^ ο
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1棒束梗霉(Isaria sp.)F3的篩選分離和鑒定及其對酞酸酯降解性能稱取受PAEs污染的新鮮水稻土 10g，裝入有90mL去離子水、3g玻璃珠的250mL三角瓶，300C、180r/min振蕩30min,靜置30min。然后取IOmL上清液，加入含有140mL PAEs 的真菌培養(yǎng)基(MYEA)(其配方為麥芽膏提取物0. 2%;酵母膏提取物0. 2%，余量為0. 02% 氯霉素溶液，調(diào)節(jié)PH值為7. 0即可；若配成固體培養(yǎng)基則加入2%瓊脂；所述百分比為質(zhì)量體積比)中進行3次梯度馴化。每個梯度3種PAEs (DMP、DEP和D0P)濃度依次為200、400、 600mg/L(PAEs總濃度600、1200、1800mg/L)，每次取IOmL菌液轉(zhuǎn)入140mL新鮮培養(yǎng)基中， 30°C、120r/min培養(yǎng)7d，加入0.02%氯霉素抑制細(xì)菌生長。最后取ImL菌液平板涂布(真菌培養(yǎng)基)，30°C培養(yǎng)7d，將不同形態(tài)的菌落分別平板劃線得到單菌落，斜面保存。該菌株具有以下分類學(xué)特征在察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)7d菌落直徑2. 5cm,絲絨狀至毛狀，米黃色，反面桔黃色；在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7d菌落直徑km，絲絨狀至毛狀，米白色，反面桔黃色；在查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)7d直徑2. 5-3. Ocm,絨毛狀，白色，反面桔黃色。電子顯微鏡下觀察，該菌株菌體的形態(tài)為氣生菌絲透明，分生孢子單細(xì)胞，長橢圓形至棱形、 細(xì)柱形。此外，該菌株的18S rDNA序列與Isaria (棒束梗霉屬)的同源性達97. 1%。該菌株18S rDNA的測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)，其序列見序列表。結(jié)合以上分類學(xué)形態(tài)特征和18S rDNA序列的比對結(jié)果，證實該菌株為棒束梗霉 (Isaria sp.)F3。實施例2棒束梗霉(Isaria sp. )F3對酞酸酯的降解接種環(huán)挑取篩選出的真菌，分別接入5g/L葡萄糖溶液，搖床30°C、120r/min培養(yǎng) 36h誘導(dǎo)孢子萌發(fā)和菌絲生長。分光光度計測定菌液660nm處的OD值，適當(dāng)稀釋使其濃度一致(OD660 0. 8)。將IOmL菌液加入90mL PAEs無機鹽培養(yǎng)基(3種PAEs濃度分別為0、 25、50、75、100mg/L，總濃度 0、75、150、225、300mg/L)，25°C、120r/min 培養(yǎng) 7d,以不接種的 PAEs無機鹽培養(yǎng)基為非生物降解對照。每個處理進行3個平行樣，均在無菌條件下操作。 7d后取樣分析培養(yǎng)液中的PAHs含量及生物量。實驗結(jié)果見圖1。在不同濃度條件下，F(xiàn)3對3種PAEs降解率的大小順序均是DMP > DEP > DOP ；在純培養(yǎng)條件下7d內(nèi)對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52. 7 66. 2%，其中DMP降解率61. 5 78. 4%, DEP 53. 7 68. 1%、DOP 29. 5 53.7%。本實施例說明分離所得到的棒束梗霉(Isaria sp. )F3對三種酞酸酯混合物具有較好的降解能力。實施例3生長因子對棒束梗霉(Isaria sp.)F3降解效果的影響1、選取PAh濃度、C N和pH作為影響因子((NH4)2SO4為N源)，設(shè)計成L27 (33) 正交實驗，表頭如表1所示。2、向一系列裝有50mL不同碳氮比的PAEs無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中接入數(shù)量相同的優(yōu)勢真菌孢子(OD66tl 0. 8)，設(shè)3個重復(fù)；用未接種的PAEs無機鹽培養(yǎng)基為對照。振蕩培養(yǎng)(120rpm，25°C )7d，測定Σ PAEs的降解率和菌液pH值，結(jié)果如表2所示。上述無機鹽培養(yǎng)基的配制方法為(g· L—1) =KH2PO4 1.0g/L, (NH4)2SO4 1. Og/L, MgSO4 · 7H20 0. 2g/L, CaCl2 0. lg/L, FeCl3 0. Olg/L, pH 7. 0 ；蒸餾水定容至 1. 0L, pH 7. 0， 121°C蒸汽滅菌30min。表2的結(jié)果表明棒束梗霉(Isaria sp. ) F3在條件為pH值7. 0、C N為20 1 時對PAEs的降解效果較好。試驗結(jié)束時，菌液pH在5. 0-7. 0的范圍。本實施例說明，本發(fā)明的棒束梗霉(Isaria sp. )F3對PAh具有較強的耐受能力和較寬的PH適用范圍(5. 0-9. 0)。表1生長因子對棒束梗霉(Isaria sp.)F3降解效果影響正交試驗的表頭設(shè)計
權(quán)利要求
1.一株降解酞酸酯的真菌，是棒束梗霉(Isaria sp.) F3CCTCC No. M201U99，已于2011 年8月四日在位于中國武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。
2.權(quán)利要求1所述的真菌在降解酞酸酯中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的真菌在降解酞酸酯中的應(yīng)用，其特征在于所述的酞酸酯為鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯或鄰苯二甲酸二正辛酯中的一種以上。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境有機污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，公開了一株降解酞酸酯的真菌及其在受污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。一株降解酞酸酯的真菌是棒束梗霉(Isaria sp.)F3CCTCC No.M 2011299。棒束梗霉(Isaria sp.)F3在純培養(yǎng)條件下7天內(nèi)對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)三種酞酸酯的混合體系的總降解率為52.7～66.2％，其中DMP降解率61.5～78.4％、DEP 53.7～68.1％、DOP 29.5～53.7％。30d內(nèi)將滅菌土壤中300mg/kgPAEs降解69.0％，可顯著提高DMP、DEP、DOP復(fù)合污染土壤植物修復(fù)的效率。與其它菌株相比，該菌株具有高效的酞酸酯降解能力。
文檔編號C12R1/645GK102409000SQ20111033100
公開日2012年4月11日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者李詩殷, 杜文婷, 楊子江, 蔡信德, 郭楊, 韓蕊 申請人:環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所