專利名稱：一株產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素制藥領(lǐng)域，涉及一種工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一株產(chǎn)慶大霉素Cla工程菌，應(yīng)用于抗生素制造。
背景技術(shù)：
小單孢菌可產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，特別是氨基糖苷類抗生素，如慶大霉素、西索米星和福提米星等。這些小單孢菌分布奇特，生長(zhǎng)緩慢且細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)特殊，故研究進(jìn)展緩慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系統(tǒng)，小單孢菌遺傳操作困難，使得對(duì)其分子生物學(xué)的研究也大大落后于鏈霉菌。小單孢菌是慶大霉素產(chǎn)生菌，慶大霉素是氨基糖苷類抗生素，已在臨床上應(yīng)用了近半個(gè)世紀(jì)，是我國(guó)、乃至全世界抗感染必備的基本藥物。慶大霉素屬多組分代謝產(chǎn)物，起抗菌作用的主要組分為C族復(fù)合物C1、C2和Cla。慶大霉素產(chǎn)生菌代謝產(chǎn)物可開發(fā)的組分十分豐富，如慶大霉素Cla是合成抗耐藥菌藥物依替米星(Etimicin)的前體；慶大霉素 B是進(jìn)一步合成抗耐藥菌藥物異帕米星的母體；慶大霉素A、B、X是進(jìn)一步開發(fā)抗原蟲的良好藥物；最新研究發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類抗生素還具有抗HIV等功效。因此對(duì)該類稀有藥用微生物進(jìn)行深入研究，特別是分子遺傳學(xué)方面的研究，具有極大意義。盡管人們對(duì)小單孢菌和慶大霉素的研究已近五十年，也取得了一些可喜的成果， 但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究開發(fā)過(guò)程中，效價(jià)提高了近萬(wàn)倍，而慶大霉素僅提高了幾十倍，差別非常懸殊。二十世紀(jì)八十年代興起的鏈霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、產(chǎn)量提高、組分改善及雜合抗生素生產(chǎn)等方面取得了一定的進(jìn)展， 但在小單孢菌中的應(yīng)用進(jìn)展緩慢。依替米星是新型半合成慶大霉素，是中國(guó)獨(dú)創(chuàng)的抗生素一類新藥，已在多國(guó)申請(qǐng)專利，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)得到了有效保護(hù)，需求量大，是本類抗生素臨床首選藥物。但由于合成依替米星的母體是慶大霉素Cla (圖1)。而慶大霉素Cla需要從慶大霉素產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物中分離才能得到。不幸的是，到目前為止，所有慶大霉素產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物是復(fù)合物，主要包括慶大霉素Cl、C2和Cla等。這些復(fù)合物化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，理化性質(zhì)相似，從中分離單組份慶大霉素Cla非常困難，導(dǎo)致慶大霉素Cla供不應(yīng)求，且生產(chǎn)成本居高不下，層析分離周期長(zhǎng)，收率低，料耗大，污染嚴(yán)重，提取精制工藝復(fù)雜，而且產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，與慶大霉素Cla結(jié)構(gòu)相似的副產(chǎn)物隨時(shí)出現(xiàn)干擾，給依替米星產(chǎn)品質(zhì)量控制造成了極大的不確定性，嚴(yán)重影響了藥品的穩(wěn)定性、安全性和有效性，是迫切需要解決的科學(xué)難題。若能獲得專一性慶大霉素Cla產(chǎn)生菌，則以上所有問(wèn)題將迎刃而解，其所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益，社會(huì)效益和環(huán)境效益等是極其巨大的，更重要的是給清潔生產(chǎn)，安全用藥，提供了可靠保障
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)慶大霉素Cla的工程菌。該工程菌為滅活卵猶功能的絳紅色小單孢菌(Micromonospora purpurea) GKllOl菌株，已于2011年9月13日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 52450所述的工程菌的發(fā)酵方法，具體如下菌株GKllOl發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落后，再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基，37°C 搖床培養(yǎng)觀h，轉(zhuǎn)速為^Orpm，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)124 h， 轉(zhuǎn)速為280rpm ；所述種子培養(yǎng)基葡萄糖0. 1-1. 0%，玉米淀粉1. 0-2. 0%，玉米粉0. 5-2. 5%， 蛋白胨 0. 1-0. 8%,黃豆餅粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%, ρΗ6· 5-7. 5，發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉3. 0-6. 0%，玉米粉1. 0-2. 0%，蛋白胨0. 1-0. 8%，黃豆餅粉1. 0-4. O %，ΚΝ03 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%, ρΗ6· 5-7. 5。 所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。菌株GKllOl的篩選，主要包括以下幾個(gè)步驟 Α.卵猶基因置換質(zhì)粒的構(gòu)建；
B.置換質(zhì)粒轉(zhuǎn)化絳紅色小單孢菌；
C.轉(zhuǎn)化子的篩選；
D.工程菌組分的鑒定?；蛑脫Q的方法為PCR擴(kuò)增卵猶上下游各2000 bp左右的片段作為同源交換臂， 并將紅霉素抗性基因作為篩選標(biāo)記插入兩交換臂之間，將此三個(gè)片段同時(shí)連接到穿梭載體如pKC1139上，另外載體pKC1139上的安普霉素抗性基因也可用于之后的篩選環(huán)節(jié)。其中轉(zhuǎn)化是以五coli ET12657(pUZ8002)介導(dǎo)的結(jié)合轉(zhuǎn)移方法。過(guò)程為先篩選同時(shí)含安普霉素抗性(AmK)和紅霉素抗性(ermER)的菌株，松弛培養(yǎng)后再?gòu)闹泻Y選含紅霉素抗性(ermEK)但對(duì)安普霉素敏感(Ams)的菌株。發(fā)酵液組分檢測(cè)采用薄層層析(TLC)，組分精確測(cè)定采用HPLC-MS法。本發(fā)明獲得了一株產(chǎn)生慶大霉素Cla的工程菌，該工程菌為絳紅色小單孢菌 (Micromonospora purpurea) GKllOl菌株，已于2011年9月13日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5245.本發(fā)明的工程菌用于產(chǎn)慶大霉素Cla，大大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，并降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染，同時(shí)提高了產(chǎn)品質(zhì)量。達(dá)到了可大規(guī)模生產(chǎn)慶大霉素Cla的目標(biāo)。


圖1為慶大霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式。圖2為重組質(zhì)粒pFD306圖譜。圖3為卵猶基因功能同源交換滅活(敲除)示意圖。I:親株染色體基因位置；II 與染色體KBl側(cè)單交換；III:與染色體KB2側(cè)單交換；IV染色體回復(fù)突變；V 與染色體雙交換。圖4為親株絳紅色小單孢菌S-1212與工程菌絳紅色小單孢菌GKllOl代謝產(chǎn)物的 TLC比較分析結(jié)果；其中A為工程菌絳紅色小單孢菌GKllOl代謝產(chǎn)物；B為親株絳紅色小單孢菌S-1212代謝產(chǎn)物。
圖5為親株絳紅色小單孢菌S-1212代謝產(chǎn)物的HPLC-MS圖譜。其中總離子流圖譜的峰1對(duì)應(yīng)的是慶大霉素Cla，分子量450. 2 ；峰2，對(duì)應(yīng)的是慶大霉素C2，分子量464. 3 ； 峰3，對(duì)應(yīng)的是慶大霉素C2b，分子量464. 3 ；峰4，對(duì)應(yīng)的是慶大霉素C2a，分子量464. 3 ；峰 5，對(duì)應(yīng)的是慶大霉素Cl，分子量478. 3。圖6為工程菌絳紅色小單孢菌GKllOl代謝產(chǎn)物的HPLC-MS圖譜。其中總離子流圖譜的峰15對(duì)應(yīng)的是慶大霉素Cla，分子量450. 2 ；峰20，對(duì)應(yīng)的是慶大霉素C2b，分子量 464. 3 ；未檢測(cè)到慶大霉素Cl、C2和CM組分的痕跡。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
本發(fā)明包括以下主要步驟 1.構(gòu)建卵猶基因置換質(zhì)粒
根據(jù)慶大霉素生物合成基因簇(可參考GenBank Accession Number AY524043)，分別在卵猶基因(SEQ. NO. 1)上下游設(shè)計(jì)兩對(duì)引物L(fēng)Bl和LB2以及LB3和LB4，以出發(fā)菌株 S-1212 (周曉蘭，黃建忠，，施碧紅，施巧琴.影響絳紅色小單孢菌 purpurea)^-\2\2孢子萌發(fā)的幾個(gè)主要因子的研究.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， Vol. 18 No. 1，ρ72-75)的染色體DNA (CTAB法)為模板，分別進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到gntK兩端的DNA序列，作為同源交換臂；上游交換臂稱為KB1(LB1/LB2)，長(zhǎng)度為2076 bp ；下游交換臂稱為KB2(LB3/LB4)，長(zhǎng)度為2044bp。以質(zhì)粒pAGe為模板(朱碧銀，洪文榮，嚴(yán)紹德，朱寶泉， 林玉雙，封成軍.黑暗鏈霉菌DNA同源重組系統(tǒng)的構(gòu)建.生物技術(shù)通報(bào)2011 (4)，162 一 166·)，El和E2為引物，擴(kuò)增抗性篩選標(biāo)記基因ermE，長(zhǎng)度為1711bp (Fig. 2)。KB1、KB2 和ermE分別經(jīng)pMD19_T (TA)克隆，得到陽(yáng)性質(zhì)粒，依次命名為pFD301、pFD302和pFD303。 pFD303經(jīng)Spe I/Xba I酶切，回收1711 bp片段，與經(jīng)Xba I酶切過(guò)的pFD301(4758 bp)進(jìn)行酶連，轉(zhuǎn)化和篩選，得到陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為PFD304 ；用)(ba I酶切pFD302，回收2048bp片段，與經(jīng))(ba I酶切過(guò)的pFD304 (6463 bp)進(jìn)行酶連，篩選得到陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為pFD305 ； 用Bgl II酶切pFD305,回收5801 bp片段，與經(jīng)BamH I酶切過(guò)的pKC1139 (6500 bp)進(jìn)行酶連，經(jīng)篩選，最終得到陽(yáng)性質(zhì)粒，命名為PFD306 (圖2)。表1實(shí)施例所涉及的引物
權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)慶大霉素Cla工程菌，其特征在于，所述工程菌為滅活卵猶功能的絳紅色小單孢菌(Micromonospora purpurea) GKl 101，已于2011年9月13日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5245.
2.一種如權(quán)利要求1所述的工程菌的發(fā)酵方法，其特征在于，菌株GKllOl發(fā)酵前先用稀釋平板法分離出產(chǎn)孢豐富的單菌落后，再轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)10天，挖塊接種于種子培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)觀h，轉(zhuǎn)速為280rpm，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 °C搖床培養(yǎng)124 h，轉(zhuǎn)速為280rpm;所述種子培養(yǎng)基葡萄糖0. 1-1. 0%，玉米淀粉 1. 0-2. 0%,玉米粉 0. 5-2. 5%，蛋白胨 0. 1-0. 8%,黃豆餅粉 0. 5-1. 5%, KNO3 0. 05-0. 10%, CaCO3 0. 1-0. 5%, ρΗ6· 5-7. 5，發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉3. 0-6. 0%,玉米粉1. 0-2. 0%,蛋白胨 0. 1-0. 8%，黃豆餅粉 1. 0-4. 0 %，KNO3 0. 01-0. 10%, (NH4)2SO4 0. 1-0. 5%, CaCO3 0. 1-0. 5%，淀粉酶 0. 001-0. 025%, ρΗ6. 5-7. 5。
3.如權(quán)利要求1所述的工程菌在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種滅活gntK功能的產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌及其應(yīng)用，所述工程菌為絳紅色小單孢菌GK1101，已于2011年9月13日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.5245，所述的工程菌用于制備抗菌藥物。本發(fā)明獲得了產(chǎn)慶大霉素C1a的工程菌，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝、降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)還方便了產(chǎn)品的質(zhì)量控制。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102363759SQ20111033153
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者嚴(yán)凌斌, 封成軍, 林玉雙, 洪文榮 申請(qǐng)人:常州方圓制藥有限公司, 福州大學(xué)