專利名稱：一種針對序列未知基因進行pcr引物設計的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物PCR檢測技術領域，是一種利用生物信息學和PCR技術，從已知序列基因的保守序列設計引物來對序列未知基因進行PCR檢測的方法。
背景技術：
PCR (Polymerase Chain Reaction)技術是一種特異性擴增DNA的體外酶促反應， 可以短時間擴增出已知序列的DNA，用于檢測表達、診斷、簽定、制備探針等，是一項極其有效和實用的技術。PCR的特點表明，如果不知道某個基因的DNA或mRNA序列，就無法對該基因進行結構和功能的深入研究，目前人和小鼠等常見物種的大部分基因序列已經(jīng)很清楚， 但一些實驗室常用物種的基因還有很大部分在genebank中找不到其準確的序列。研究工作中經(jīng)常碰到的問題是，需要診斷某一未知病原微生物的感染，或需要檢測一個序列未知基因的表達情況等。對于診斷某一未知病原微生物的感染，由于一般微生物的基因組序列簡單，現(xiàn)行常用的辦法就是直接對該未知病原生物進行測序，知道其序列后，再設計特異性引物用于大規(guī)模臨床上的診斷。對于檢測一個序列未知基因的表達情況，現(xiàn)行常用的辦法是 cDNA 末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends, RACE), RACE 技術可以在有部分mRNA序列已知的條件下，幫助獲得目標基因的完整長度的mRNA序列。RACE成功的前提是mRNA反轉錄成cDNA序列的反應要控制的很好，但由于mRNA易于降解，反轉錄反應特別容易受到豐度低和高級結構的影響。而利用同位素或生物素進行標記的探針對cDNA 文庫進行雜交篩選的方法，則更是費時費力，為研究者在不得已的情況下的最后選擇。以上傳統(tǒng)的方法對操作技術和設備要求極高，費用昂貴，一般實驗室不具備這種條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作快速簡單，成本低廉，高效準確，從已知序列基因的保守序列設計引物來對序列未知基因進行PCR檢測的方法。本發(fā)明依據(jù)相同基因在不同物種之間具有保守序列的原理，通過BLAST軟件進行核苷酸序列比對，找到序列未知基因的保守序列，并據(jù)此設計引物對序列未知基因進行PCR 檢測。本跨物種PCR引物設計方法，具體步驟如下
(1)通過BLAST核苷酸序列比對，找到不同物種之間需要檢測的目的基因的保守序列；
(2)根據(jù)該保守序列，用引物設計軟件primerf.0設計引物；
(3)把引物再通過BLAST核苷酸序列比對，確保引物3’端的高度保守性。本發(fā)明的優(yōu)點
本發(fā)明使用特異性引物擴增未知序列與RACE等方法一樣。但和以前的方法相比，更具有如下優(yōu)點
1、技術簡單可行。本發(fā)明充分利用生物信息學提供的已有信息，通過BLAST核苷酸序列比對找到序列未知基因的保守序列，根據(jù)找到的保守序列來設計引物來對序列未知基因進行PCR檢測。2、簡化勞動。與傳統(tǒng)的方法相比，避免了對基因組進行大規(guī)模測序，節(jié)省了大量的時間和財力。3、應用范圍廣。只要能找到基因的保守序列，就可以對任何物種的該基因進行跨物種PCR檢測。4、引物特異性強。本發(fā)明設計引物所結合區(qū)域都是該基因的保守序列，使得擴增特異性和效率大大增強。5、實驗操作對人員與環(huán)境無害。不需要探針和構建CDNA文庫，所以避免了使用同位素。6、成本低。只相當于普通的PCR，無需昂貴的試劑和儀器。本發(fā)明為針對序列未知基因進行PCR檢測提供了一種操作快速簡單，成本低廉， 高效準確的方法，在檢測一個序列未知基因的表達情況時必定具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式我們在科研過程中需要檢測中國倉鼠一個參與DNA修復基因DNA-PKcs mRNA的表達情況，但由于中國倉鼠DNA-PKcs mRNA在Genebank上找不到相應的序列，我們通過此發(fā)明來設計引物，對序列未知的中國倉鼠DNA-PKcs基因進行PCR檢測。(一)跨物種同源比對法來設計PCR的引物
1、通過BLAST核苷酸序列比對，找到小白鼠和人的DNA-PKcs mRNA的保守序列，下表中顯示的序列為小白鼠和人的DNA-PKcs mRNA的最保守序列，其保守性達84%，Query行為小白鼠的DNA-PKcs mRNA序列，Sujct行為人的DNA-PKcs mRNA序列；
權利要求
1. 一種針對序列未知基因進行PCR引物設計的方法，其特征在于具體步驟為(1)通過BLAST核苷酸序列比對，找到不同物種之間需要檢測的目的基因的保守序列；(2)根據(jù)該保守序列，用引物設計軟件primerf.0設計引物；(3)把引物再通過BLAST核苷酸序列比對，確保引物3’端的高度保守性。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物PCR檢測技術領域，具體為一種針對序列未知基因進行PCR引物設計的方法。本發(fā)明依據(jù)相同基因在不同物種之間具有保守序列的原理，通過BLAST軟件進行核苷酸序列比對，找到序列未知基因的保守序列，并據(jù)此設計引物對序列未知基因進行PCR檢測。本發(fā)明解決了傳統(tǒng)方法對序列未知基因進行PCR檢測時操作復雜、費用過高的問題。根據(jù)本發(fā)明的跨物種PCR引物設計方法，成功擴增出了一個序列未知的中國倉鼠基因。該發(fā)明技術設計簡單可行，操作限制少，應用范圍廣，結果可靠，而且成本低廉。
文檔編號C12Q1/68GK102392015SQ201110333709
公開日2012年3月28日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權日2011年10月28日
發(fā)明者張江虹, 沈波, 潘燕, 袁德曉, 邵春林 申請人:復旦大學