專利名稱：一種新型糖化酶vga及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新型糖化酶VGA及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖化酶是世界上產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的一種酶類，其應(yīng)用歷史悠久，我國早在 1500年前即開始采用糖化曲釀酒。糖化酶全稱為葡萄糖淀粉酶(GAcoamylase，EC3. 2. 1. 3)，又稱Y -淀粉酶，簡稱糖化酶。糖化酶是可以淀粉、糊精等為底物，在一定條件下從淀粉的非還原性未端開始依次水解α _1，4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生葡萄糖的淀粉葡萄糖甘酶。糖化酶可應(yīng)用于酒精、釀酒、葡萄糖、果葡糖漿、抗菌素、乳酸、有機(jī)酸、味精、棉紡廠等各個行業(yè)，其應(yīng)用范圍極廣，對國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展具有重大影響。糖化酶的主要生產(chǎn)菌種為霉菌，我國多用紅曲霉、黑曲霉以及根霉，其中根霉以固體發(fā)酵為主，紅曲霉和黑曲霉多以深層液體發(fā)酵生產(chǎn)。目前，對糖化酶特性方面的研究主要集中在熱穩(wěn)定性、ρΗ作用范圍等方面?，F(xiàn)在工業(yè)應(yīng)用的糖化酶其耐受溫度一般在85°C以下，超過該溫度則酶活損失巨大，甚至完全失活； 另外，目前所生產(chǎn)及應(yīng)用糖化酶普遍PH作用范圍較窄，一般為4. 5 6. 5，這些均從一定程度上限制了糖化酶的應(yīng)用。因此，有必要開發(fā)出一種新的糖化酶，在提高其產(chǎn)酶性能的同時，在一定程度上提高其耐熱性能及PH作用范圍。本發(fā)明即是采用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建出了一個高效糖化酶基因工程菌株，并利用該菌株進(jìn)行糖化酶生產(chǎn)。本發(fā)明所提供的糖化酶基因，經(jīng)序列比對，為一種新型的糖化酶基因，該基因所表達(dá)的糖化酶，具有比活高、耐高溫、PH作用范圍廣等優(yōu)點，可以廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型糖化酶VGA。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述新型糖化酶的基因VGA。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述新型糖化酶基因VGA的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述新型糖化酶基因VGA的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述新型糖化酶的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述新型糖化酶的應(yīng)用。本發(fā)明的一種生產(chǎn)上述新型糖化酶VGA的黑曲霉AN070902 (Aspergi 1 Ius niger)，于2010年10月20日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 4235，其相關(guān)信息記載于申請?zhí)枮镃N201010566249. 0的專利申請中，已于2011年4月6日公開O
從上述菌株中分離得到--種糖化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示
MFSRLSLLRPSLNEATVARTISKRATLDSW GLVCTGLANV NAILNIGADG
AffVSGADSGI60
VVASSPTDNPDYFYTWTRDSFRNGSRPQDP RRSRDTSLLS IVQGISNPSG
TIENYISAQA120
DLSSGAGLGEPKFNVDETAYSTGWRGPRQD AGPLARTAMI GGFQLWLGDN
STYTTADffIV180
LVPNDRSYVLYAQWQNTDGYTFIAQVHLRA WELEGVNSSF RVDSAAFVTA
SSGSffCCDSQ240
TGFffFSINLAPEAIYLCLQSSFDSGRSDKA TNLGSLIHTF PFQSCPRAAL
EDPADACDST300
LFILNDTLGSHNKVVEDRSSFWLCATLAAE EPDTYYNGNP EDSVAAVGRY
YQLDLAYffQD360
GKQSELVVTDDSLFKFALYSSSTYISSAVD VIEHATASNG KVTADFGSFV
ADAGTTYSSS420
MSSYQEDSDKQSEGLARDLTYTRSNVVASP GTCAASTGAI WYSALALNTA
SPIVTAGTGT480
YSTVTSVTSffGWETASSVSPTTATTPGSSG TVSTKSTTTA STCTPTTAVA
GDIASLAKDY540
GYENYILGVSTVFDTLATTTSIQL⑶WETS ASKTSTSTSS STSDLPWVYT
TVLPGAEFES600
VSEffSEDPRNTSATTVDWTRYETVQPAGCT KYFIIREDSD 640
該酶蛋白由640個氨基酉蹇組成，理論pI/Mw:4. 35/68617.06。
本發(fā)明還提供了編碼上述糖化酶的基因，該基因的序列如SEQ ID NO. 2所示
atgttctcgcgactatctctcctgaggcccagcttgaacgaagcgaccgtggctcgtact60
atttccaagcgcgcgaccttggattcatggggcctcgtctgcacagggttggcaaatgtg120
aatgccatcctgaacatcggggcggacggtgcttgggtgtcgggcgcggactctggcatt180
gttgtcgctagtagccccacggataacccggactacttctacacctggactcgcgactct240
ttccgaaatgggtctcgtcctcaagaccctcgtcgatctcgagataccagtctcctctcc300
attgtccagggtatcagtaacccctctggtaccattgagaactacatctccgcccaggca360
gatctgtccagcggcgctggtctcggtgaacccaagttcaatgtcgatgagactgcctac420
tctactggttggcggggaccgcgacaggatgctggtccgctggcaagaactgctatgatc480
gggggcttccagctgtggcttggcgacaatagcacctacaccacggcagactggattgtt540
ctcgttcccaacgacaggtcgtatgtgctgtacgctcaatggcagaacacagatggatat600
acgtttattgctcaagtgcaccttcgcgcctgggaactcgaaggcgtcaattcgtctttc660
agggtcgatagcgctgccttcgtgacggcctcctcgggctcctggtgctgtgattctcag720
accggcttctggttcagcattaacctggcccccgaagcaatttacctctgcctgcagtcc780
agcttcgatagcggccgttccgacaaggcaaccaacctcggaagcctgatccacaccttt840
cccttccagtCCtgCCCgCgcgccgcgctcgaggatcctgccgacgcatgcgactccacc900
ctattcattctcaacgacactctcggtagtcacaacaaggttgtagaggaccgctcatct960
ttctggctgtgcgctaccttggccgcagaggagcctgacacgtactacaacggcaacccg1020
gaggacagcgttgcggctgtgggtcggtactaccagttggatctagcttactggcaggac1080
gggaagcagtcggagttggtcgtgacagatgactcgctgttcaagttcgcactgtacagc1140
tcgagtacttatattagtagcgccgtagatgtgattgaacacgccactgcaagcaacggc1200
aaggtgactgccgatttcggctctttcgtcgctgatgctggcaccacttactcttcgtcc1260
atgtcctcctaccaagaggactctgataagcagtccgagggccttgctcgcgacctgacc1320
tacacgcgttccaacgtcgtggcttctcctggcacctgtgcggcctctacaggtgccatt1380
tggtattctgctctggctctgaacaccgccagtccgatcgtgactgctggcaccggcact1440
tacagcaccgtgactagtgtcacctcgtggggctgggagaccgcctctagcgtgagcccc1500
acgacggctaccactcccggaagctccggcaccgtgtcgaccaagagcaccactaccgcg1560
tccacctgtactcccaccacCgCCgtggCtggcgacatagctagtctggctaaggactac1620
ggctacgagaactacatcctgggagtctcgactgtgttcgatacactggctaccaccacc1680
tctatccagctgggtgactgggaaaccagcgctagcaagaccagcaccagtacgtcatca1740
tccactagcgacctcccgtgggtctatactactgtgctgccgggtgctgagtttgagtcg1800
gtgtccgagtggagtgaggatccccgaaacacctcggcgacgactgtggactggacccgg1860
tacgaaaccgttcagcctgcgggatgcacgaagtactttatcattcgcgaggatagcgac1920
tag1923
經(jīng)檢測，該酶在PH 2.0 7. 5的條件下酶活穩(wěn)定，對淀粉的水解效果顯著，另外，
該糖化酶的耐高溫性能較好，在85°C水溶液中處理lOmin，其酶活損失低于15%，完全符合各種工業(yè)需求，適合作為一種新型耐高溫糖化酶進(jìn)行應(yīng)用。本發(fā)明還提供了包含上述新型糖化酶基因VGA的重組載體，優(yōu)選為 pPICz α A-VGA。將本發(fā)明的新型糖化酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的糖化酶基因插入到質(zhì)粒PPICzaA上的EcoR I和)(ba I限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPICz αA-VGA。本發(fā)明還提供了包含上述新型糖化酶基因VGA的重組菌株，優(yōu)選重組菌株是畢赤酵母菌株X33。本發(fā)明還提供了一種制備酶VGA。上述新型糖化酶VGA的方法，包括以下步驟1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組糖化酶VGA的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的糖化其中，步驟2、中，重組菌株在發(fā)酵罐中的發(fā)酵過程可分為3個階段第一階段為菌體培養(yǎng)階段，按10%比例接入種子，培養(yǎng)18 M小時，以補(bǔ)完葡萄糖、PH及DO上升為標(biāo)志；第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上即表明該階段結(jié)束，為期約30 60min ；
第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并且保持溶氧在20 %以上，整個培養(yǎng)時間為180 200小時之間。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理后獲得粗酶液。本發(fā)明還提供了上述新型糖化酶VGA的應(yīng)用，優(yōu)選該酶在水解淀粉及在食品、制藥工業(yè)中的應(yīng)用。利用本發(fā)明的方法高效表達(dá)上述的新型重組糖化酶，可達(dá)到125000U/mL左右的發(fā)酵水平，同目前已有的現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的新型糖化酶通過高效表達(dá)后能夠達(dá)到較高的發(fā)酵水平，在工業(yè)生產(chǎn)中可大大降低生產(chǎn)成本，使其在食品、制藥等工業(yè)中顯示出更大的應(yīng)用潛力。該酶在PH 2.0 7. 5的條件下酶活穩(wěn)定，對淀粉的水解效果顯著，另外，該糖化酶的耐高溫性能較好，在85°C水溶液中處理lOmin，其酶活損失低于15%，完全符合各種工業(yè)需求，適合作為一種新型耐高溫糖化酶進(jìn)行應(yīng)用。


圖1新型重t&糖化酶在50L罐中的發(fā)酵過程曲線。
圖2新型重t&糖化酶的最適反應(yīng)溫度。
圖3新型重t&糖化酶的最適反應(yīng)PH值。
圖4新型重t&糖化酶的耐熱性能曲線。
圖5新型重t&糖化酶的PH耐受性能。
具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行； 所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實驗材料和試劑1、菌株與載體大腸桿菌菌株!"opIO、畢赤酵母X33、載體pPICzalphaA購自hvitrogen公司。黑曲霉AN070902 (Aspergi Ilus niger)，于 2010 年 10 月 20 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 4235，其相關(guān)信息記載于申請?zhí)枮?CN201010566249. 0的專利申請中，已于2011年4月6日公開。2、酶與試劑盒逆轉(zhuǎn)錄酶superscript III、RNA提取試劑盒購自hvitrogen公司。質(zhì)粒DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，PCR純化試劑盒購自上海生工公司。限制性內(nèi)切酶購自！^rmentas 公司。3、培養(yǎng)基基本鹽培養(yǎng)基磷酸二氫銨5%、磷酸二氫鉀0. 5%、七水硫酸鎂1. 5%、硫酸鉀 1.95%、硫酸鈣0. 1%、氫氧化鉀0. 1%、消泡劑0.03%。高壓后每升加4. 35毫升PTMl
PTMl (微量鹽溶液)硫酸銅0. 6 %、碘化鉀0. 018 %、一水硫酸錳0. 3 %、二水鉬酸鈉0. 02 %、硼酸0. 002 %、六水氯化鈷0. 05 %、氯化鋅2 %、七水硫酸鐵6. 5 %、濃硫酸0. 5%、生物素 0. 02%。實施例1、黑曲霉(Aspergillus niger)的產(chǎn)酶特性試驗采用篩選出的產(chǎn)糖化酶黑曲霉(保藏編號=CGMCC No. 4235)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實驗， 其發(fā)酵培養(yǎng)基如下玉米淀粉10%、豆餅粉 2%、玉米漿 1.5%、MgSO4 0.1%, K2HPO4 0. 1%發(fā)酵培養(yǎng)基在121°C、0. IMI^a下滅菌20min，冷卻后接種，于32°C、200rpm條件下培
養(yǎng)2-3天。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行糖化酶的反應(yīng)溫度、耐熱性能、pH作用范圍等酶學(xué)性質(zhì)測試。測試結(jié)果表明，該霉菌所產(chǎn)的糖化酶最適反應(yīng)溫度為40°C左右，并具有良好的耐熱性能，經(jīng)85°C水溶液狀態(tài)下處理lOmin，酶活保存率仍可達(dá)到80%左右，另外該糖化酶還具有PH作用范圍廣等特點，這些方面的特性均較大程度上優(yōu)于現(xiàn)有的糖化酶產(chǎn)品，更適于各行業(yè)生產(chǎn)的需求。由于該黑曲霉的糖化酶生產(chǎn)性能不高，因此，需要對該菌種進(jìn)行相應(yīng)的改造，以提高其生產(chǎn)性能。實施例2、黑曲霉(Aspergillus niger)糖化酶VGA基因的克隆運用RNA提取試劑盒，提取黑曲霉(Aspergillus niger)總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄酶 superscript III Reverse Transcriptase 操作說明合成第一鏈 cDNA。以 cDNA 為模板， 設(shè)計糖化酶引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物由EcoRI和)(baI進(jìn)行雙酶切，然后與經(jīng)過同樣酶切的畢赤酵母表達(dá)載體pPICzalphaA相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplO感受態(tài)細(xì)胞， 經(jīng)抗生素&0(^11篩選后，獲得陽性克隆。提取陽性克隆的質(zhì)粒。送樣到上海英駿生物公司測序，測序結(jié)果表明，所獲得克隆DNA插入片段含有糖化酶基因完整的開放閱讀框。該糖化酶基因VGA，全長1923bp(SEQ ID NO. 2)，編碼640個氨基酸(SEQ ID NO. 1)。得到的重組表達(dá)載體命名為pPICz α A-VGA。擴(kuò)增所用引物如下VGA 5EcoRI 5，AATGAATTCTCACCGCCAGGTGTCAG3，VGA 3XbaI 5，CAACTCTAGAATGTCCGAGCAATACG3，實施例3、包含新型糖化酶基因VGA的畢赤酵母工程菌的構(gòu)建優(yōu)化后的新型糖化酶基因VGA，采用EcoRI和)(baI進(jìn)行雙酶切，重新連接到經(jīng)相同雙酶切的載體PPICz α A上，獲得重組表達(dá)載體pPICz α A-VGA。然后采用McI進(jìn)行線性化，線性化后的重組載體電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，電轉(zhuǎn)化后涂布于YPDGe0+)平板上進(jìn)行篩選，得到畢赤酵母重組菌株。實施例4、新型糖化酶重組菌株的高效表達(dá)將篩選獲得的新型糖化酶重組菌株X33-9/pPICZ α A-VGA進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)。配制20L基本鹽培養(yǎng)基，在50L自動控制發(fā)酵罐中滅菌后，冷卻至常溫備用。用氨水和磷酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的PH值至4. 6，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和空氣流量控制溶氧大于20%以上，發(fā)酵溫度為30°C。整個發(fā)酵過程分3個階段
7
第一階段為菌體培養(yǎng)階段，將重組菌株X33-9/pPICZ α A-VGA按照10%的接種量接種至發(fā)酵罐中，流加已滅菌的4L 50%的葡萄糖，培養(yǎng)M 30小時，以補(bǔ)完葡萄糖為標(biāo)志；第二階段為饑餓階段，當(dāng)葡萄糖補(bǔ)完之后，不流加任何碳源，當(dāng)溶氧上升至80%以上，ρΗ上升即表明該階段結(jié)束，為期約30 60min ；第三階段為誘導(dǎo)表達(dá)階段，流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并且保持溶氧在20%以上，培養(yǎng)時間在180 200小時之間。發(fā)酵液可通過陶瓷膜或超濾膜處理后獲得酶液。在發(fā)酵過程中的不同時間點取樣測定酶活，發(fā)酵過程中新型糖化酶的表達(dá)情況如圖1所示，發(fā)酵19 的發(fā)酵液酶活為125000U/mL。實施例5、新型重組糖化酶的活性分析按中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 8276-2006)進(jìn)行檢測。1個酶活單位(U)定義為lmL酶液或Ig酶粉在40°C、pH 4. 6的條件下，1小時水解可溶性淀粉產(chǎn)生Img葡萄糖，即為一個酶活力單位。實施例6、新型重組糖化酶的性質(zhì)測定1、新型重組糖化酶比活測定將上述發(fā)酵液中的耐高溫糖化酶通過離子交換柱⑴Sepharose Fast Flow Ion Exchanger)純化，采用改良型Bradford試劑盒(上海Sangon公司)測定蛋白濃度，得出該耐高溫糖化酶比活為10420U/mg。2、新型重組糖化酶的最適反應(yīng)溫度及ρΗ測定最適反應(yīng)溫度將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度(20 100°C )下反應(yīng)，測定該糖化酶的酶活。以最高酶活力為100%，其它溫度下測得的酶活與之相比，即得到該溫度下的相對酶活。最適反應(yīng)溫度曲線見圖2。最適反應(yīng)ρΗ 將稀釋后的酶液，與不同pH(2. 0 9. 0)檢測條件下，檢測該糖化酶的酶活力，并采用最高酶活為100%，其他檢測結(jié)果與之相比，即得到不同PH檢測條件下的相對酶活。最適反應(yīng)PH曲線見圖3。結(jié)果如圖2和圖3所示該新型重組糖化酶的最適反應(yīng)溫度為45°C，最適反應(yīng)ρΗ 為 5. 0。3、新型重組糖化酶的耐熱性能測定將酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，在不同溫度下處理IOmin后，以未處理的酶活力為對照 100%，測定耐高溫糖化酶的相對酶活，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示該新型糖化酶的耐熱性能良好，完全可達(dá)到工業(yè)用糖化酶的要求。4、新型重組糖化酶ρΗ穩(wěn)定性測定將稀釋后的酶液與不同ρΗ的緩沖液混合，室溫放置2h，以未處理的酶液為對照， 測定耐高溫糖化酶的相對酶活，結(jié)果如圖5所示。該糖化酶的最適ρΗ為5. 0，并且在pH 2. 0 7. 5范圍內(nèi)相對酶活均可達(dá)到80% 以上，說明該新型糖化酶的PH作用范圍廣。5、金屬離子和EDTA對新型重組糖化酶活力的影響將含有ImM K+、Mg2+、Ca2+、Zn2\ Fe2\ Fe3\ Mn2+、Co2+、Cu2+ 和 EDTA 的溶液與稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液混合，室溫放置30min，以未處理的酶液為對照，結(jié)果如表1所示。
結(jié)果表明，Mg2+、Fe2\ Ca2+、Mn2+對該糖化酶有一定的激活作用；K+、EDTA、Zn2+對酶活性沒有什么影響；其余金屬離子Cr3+、Cu2+和!^3+對酶活性均有不同程度的抑制作用，SDS 則完全抑制了酶的活性。表1金屬離子和EDTA對重組糖化酶酶活力的影響
權(quán)利要求
1.一種新型糖化酶VGA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種新型糖化酶基因VGA，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的糖化酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述新型糖化酶基因VGA，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 2 所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述新型糖化酶基因VGA的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為pPICzα A-VGA。
6.包含權(quán)利要求2或3所述新型糖化酶基因VGA的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備新型糖化酶VGA的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組糖化酶VGA的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的糖化酶VGA。
9.權(quán)利要求1所述新型糖化酶VGA的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新型糖化酶VGA及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新型糖化酶VGA，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述新型糖化酶VGA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明的新型糖化酶VGA在pH 2.0～7.5的條件下酶活穩(wěn)定，對淀粉的水解效果顯著，另外，該糖化酶的耐高溫性能較好，在85℃水溶液中處理10min，其酶活損失低于15％，完全符合各種工業(yè)需求，適合作為一種新型耐高溫糖化酶進(jìn)行應(yīng)用。
文檔編號C12N1/19GK102382807SQ20111033551
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者李陽源, 羅長財, 鐘開新 申請人:廣東溢多利生物科技股份有限公司