專利名稱：一株對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株構(gòu)巢裸胞殼。
技術(shù)背景
化石能源將逐步枯竭，新能源和可再生能源為能源供給提供了重要選擇，燃料乙醇作為一種C、H比例小、燃燒熱值大、CO2排放量低的燃料，正日益受到廣泛關(guān)注。以玉米、 小麥等糧食為原料生產(chǎn)乙醇威脅著糧食安全，因此以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，即纖維乙醇得到各國(guó)政府的支持。
預(yù)處理方法是制約纖維乙醇發(fā)展的瓶頸之一，對(duì)于糖得率和發(fā)酵性能有重要影響。蒸汽爆破法處理過程中無需加入化學(xué)品，且處理后纖維素的酶水解率較高，具有處理時(shí)間短、環(huán)境污染小、低能耗的優(yōu)勢(shì)，是目前比較推崇的預(yù)處理技術(shù)。但由于蒸爆過程的處理?xiàng)l件比較激烈，這一過程中會(huì)產(chǎn)生甲酸、乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等發(fā)酵抑制物，會(huì)對(duì)后續(xù)的發(fā)酵過程產(chǎn)生影響，因此需要對(duì)汽爆物料進(jìn)行脫毒處理。解毒方法主要包括生物解毒、物理解毒、化學(xué)解毒。其中生物解毒是指用一些特定的酶或微生物作用于發(fā)酵抑制物，通過改變抑制物的結(jié)構(gòu)而降低其毒性，包括酶處理法和微生物處理法。微生物處理方法與酶處理方法的原理是相同的，但微生物能夠持續(xù)地產(chǎn)生多種酶，能同時(shí)去除多種抑制物質(zhì)，與酶處理法相比具有成本低，解毒效率高的優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株構(gòu)巢裸胞殼(Emericella nidulans)，能夠去除乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等蒸汽爆破預(yù)處理所產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物，提高燃料乙醇的得率。
本發(fā)明對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼為構(gòu)巢裸胞殼 110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2010年12月M日， 保藏編號(hào)為CGMCC No. 4514。
本發(fā)明的構(gòu)巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)屬于子囊菌門(Ascomycota)，散囊菌目(Eurotiales)，發(fā)菌禾斗(Trichocomaceae)，曲菌屬 (Aspergillus)。
本發(fā)明構(gòu)巢裸胞殼110在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，結(jié)構(gòu)致密，邊緣呈鋸齒狀，菌落隆起，干燥，不透明(如圖1所示)，培養(yǎng)2天菌落直徑為8mm ；在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲體為白色，菌絲有隔，產(chǎn)灰綠色孢子，分生孢子頭(如圖2和圖3 所示)。
本發(fā)明構(gòu)巢裸胞殼110可在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度28 0C，最適pH值為6。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用，可以清除抑制纖維素降解和發(fā)酵的有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)包括Ca2+、Mg2+、Al3+、狗2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羥甲基2-呋喃甲醛。
本發(fā)明構(gòu)巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2010年12月M日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4514。


圖1為本發(fā)明構(gòu)巢裸胞殼110的菌落形態(tài)圖；圖2為本發(fā)明構(gòu)巢裸胞殼110的透視電鏡照片；圖3為本發(fā)明構(gòu)巢裸胞殼110的掃描電鏡照片；圖4為構(gòu)巢裸胞殼110和相近菌株的18S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖；圖5構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Ca2+的去除效果；圖6為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Mg2+的去除效果；圖7為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Al3+的去除效果；圖8為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)!^2+的去除效果；圖9為構(gòu)巢裸胞殼110以葡萄糖為碳源對(duì)有機(jī)酸的代謝效果，其中- -為乙酸，-Δ-為丁酸，為丙酸；圖10為構(gòu)巢裸胞殼110以混合有機(jī)酸為碳源的代謝效果，其中- -為乙酸，-Δ -為丁酸，-□-為丙酸； 圖11為構(gòu)巢裸胞殼110以木糖為碳源對(duì)有機(jī)酸的代謝效果，其中- -為乙酸，-Δ -為丁酸，-■-為丙酸；圖12為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)糠醛在40°C的共代謝效果，其中- -為以糠醛為唯一碳源，-□-為以葡萄糖作主要碳源；圖13為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)糠醛在35°C的共代謝效果，其中- -為以糠醛為唯一碳源，-口 -為以葡萄糖作主要碳源；圖14為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在40°C的共代謝效果，其中- -為以 5-羥甲基2-呋喃甲醛為唯一碳源，-■-為以葡萄糖作碳源；圖15為構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在35°C的共代謝效果其中- -為以5-羥甲基2-呋喃甲醛為唯一碳源，-■-為以葡萄糖作碳源。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼為構(gòu)巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2010年 12月24日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4514。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落呈圓形，結(jié)構(gòu)致密，邊緣呈鋸齒狀，菌落隆起，干燥，不透明，培養(yǎng)2天菌落直徑為8mm ；在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，菌絲體為白色，菌絲有隔，產(chǎn)灰綠色孢子，分生孢子頭。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110可在剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng)， 最適生長(zhǎng)溫度280C，最適pH值為6。
剛果紅纖維素瓊脂培養(yǎng)基(IOOOmL)由0. 50g Κ2ΗΡ04、0· 25g MgS04、1. 88g纖維素粉、0. 20g剛果紅、14g瓊脂、2g明膠和余量的蒸餾水組成，調(diào)節(jié)pH為5，于121°C滅菌30min。 察氏培養(yǎng)基(IOOOmL)由 3g NaNO3>0. 50g Κ2ΗΡ04、0· 5g KC1、0. Olg FeS04、30g 蔗糖、20g 瓊脂和余量的蒸餾水組成，于121°C滅菌30min。
具體實(shí)施方式
二本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)由秸稈堆肥中分離、純化得到，具體步驟為取IOg秸稈堆肥，放入IOOmL裝有玻璃珠的無菌水中，振蕩1小時(shí)后制成混濁液；吸取5mL懸浮液裝入盛有30mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于100r/min、35°C的條件下培養(yǎng)3 5天；之后更換新鮮的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接5 6次后進(jìn)行分離，得富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液。取富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)液，采用倍比稀釋法將樣品稀釋至10、ΙΟ"2, ΙΟ"3, ΙΟ"4,10_5，將稀釋液滴入無菌的剛果紅纖維素瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面，在35°C培養(yǎng) 4天，挑選水解圈較大的單獨(dú)菌落移入斜面，進(jìn)行菌種分離。待斜面菌體生長(zhǎng)飽滿后進(jìn)行平板劃線純化培養(yǎng)，至菌落形態(tài)一致，結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后，再挑選單一菌落移種斜面，即得到構(gòu)巢裸胞殼110。
所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(IOOmL)由200g、20g葡萄糖和余量的蒸餾水組成， 于 121°C 滅菌 30min。
對(duì)分離純化得到的構(gòu)巢裸胞殼110進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，按以下步驟進(jìn)行提取菌株的總DNA，采用真菌通用引物ITS擴(kuò)增構(gòu)巢裸胞殼FLZlO的18s rDNA ITS序列，PCR產(chǎn)物純化后，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的18S rDNA序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后用軟件CLUSTALX 1. 83和MEGA 4. 1以近鄰結(jié)合法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖4所示)，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與四脊裸胞殼(Emericella quadrilineata)的 18S rDNA序列的同源性最高，保守區(qū)相似性為100%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生化鑒定結(jié)果確定構(gòu)巢裸胞殼110屬于曲霉屬，為構(gòu)巢裸胞殼。
PCR引物購買自上海生工生物技術(shù)有限公司。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用，可以清除抑制纖維素降解和發(fā)酵的有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)包括Ca2+、Mg2+、Al3+、狗2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羥甲基2-呋喃甲醛。無機(jī)離子方面，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe2+ 均有明顯的去除效果，培養(yǎng)48h去除率分別為70 %、50 %、90 %、80 %。有機(jī)物方面，35 °C時(shí)以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)乙酸、丙酸、丁酸于96h的去除率可分別達(dá) 24. 20 %、30. 92 %、27. 73 %。35°C時(shí)以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)糠醛和 5-羥甲基2-呋喃甲醛的去除率分別為56. 52%、69. 21%。
對(duì)無機(jī)離子的去除試驗(yàn)將察氏培養(yǎng)基分裝于4個(gè)IOOmL的三角瓶中，每個(gè)三角瓶分裝50mL，培養(yǎng)基中葡萄糖的質(zhì)量百分比濃度為1%。在4個(gè)三角瓶的培養(yǎng)基中分別加入 Ca2+、Mg2+、Al3+和Fe2+，使培養(yǎng)基中的離子濃度分別為|丐離子800mg/L、鎂離子500mg/L、鋁離子80mg/L、鐵離子350mg/L，調(diào)節(jié)pH至5. 0，于115°C滅菌30min。向4個(gè)培養(yǎng)基中分別接種構(gòu)巢裸胞殼110，于40°C、150rpm/min培養(yǎng)48小時(shí)，然后于0h、24h和4 取樣，采用離子發(fā)射光譜(ICP)測(cè)定各離子濃度。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Ca2+的去除效果如圖5所示，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Mg2+ 的去除效果如圖6所示，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Al3+的去除效果如圖7所示，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì) Fe2+的去除效果如圖8所示。從圖中可以看出，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，培養(yǎng)液中的離子濃度下降趨勢(shì)明顯。構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)過量的Ca2+有明顯的去除作用，培養(yǎng)4 去除率可達(dá)70% ； 構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)!^2+的去除作用明顯，培養(yǎng)4 去除率可達(dá)80% ；構(gòu)巢裸胞殼110可以對(duì)Mg2+進(jìn)行去除，培養(yǎng)4 去除率在50%左右；構(gòu)巢裸胞殼110在培養(yǎng)4 對(duì)Al3+的去除率可達(dá)90%。
通過以上分析可見，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)Ca+、Mg2+、Al3+和Fe2+均有明顯的去除效果， 由此可以推測(cè)，由于構(gòu)巢裸胞殼110的存在可以代謝發(fā)酵液中部分過量的離子，使得酵母所需的離子處于適宜的濃度范圍內(nèi)，在一定程度上解除過量離子對(duì)酵母的抑制作用。
對(duì)有機(jī)酸的去除試驗(yàn)將乙酸、丙酸和丁酸混合，使每種酸在察氏培養(yǎng)基中的體積濃度均為2%，得混合酸，將混合酸分別加到察氏培養(yǎng)基中，①葡萄糖作為碳源，混合酸加到察氏培養(yǎng)基中；②混合酸做碳源，混合酸加到不加葡萄糖的察氏培養(yǎng)基中；③木糖作為碳源，混合酸加到以木糖替代葡萄糖的察氏培養(yǎng)基中。以上三組培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)PH為5. 5，分別接種構(gòu)巢裸胞殼110進(jìn)行培養(yǎng)，于0h、24h、4a!、7a!、％h分別取樣，用氣相色譜測(cè)定有機(jī)酸濃度。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110以葡萄糖為碳源對(duì)有機(jī)酸的代謝效果如圖9所示，構(gòu)巢裸胞殼110以混合有機(jī)酸為碳源的代謝效果如圖10所示，構(gòu)巢裸胞殼110以木糖為碳源對(duì)有機(jī)酸的代謝效果如圖11所示。從圖9中可看出，在35°C時(shí)，乙酸、丙酸和丁酸三種酸在培養(yǎng)96h時(shí)濃度均有下降，96h的去除率可分別達(dá)24. 20%、30. 92%、27. 73%。從圖10 中可看出，在35°C時(shí)，雖然從Oh 96h的趨勢(shì)較為起伏，在培養(yǎng)24h濃度均有明顯的降低， 其后又逐漸升高。但總體來說，培養(yǎng)96h乙酸、丙酸和丁酸三種酸濃度有略微的下降，分別降低12.75^^9.76^^10.68 ^木糖是發(fā)酵醪液中一種主要的五碳糖，由半纖維素降解得到。通常情況下，微生物更容易直接利用的碳源是葡萄糖，但當(dāng)木糖作為唯一初級(jí)能源物質(zhì)存在時(shí)，從圖11中可看出，構(gòu)巢裸胞殼110也可以通過木糖作為碳源進(jìn)行共代謝，在35°C 時(shí)，三種酸的濃度均有降低，乙酸、丙酸和丁酸的去除率分別為13. 73%、19. 76%,22. 12%.
對(duì)醛的去除試驗(yàn)分為以下四組進(jìn)行，(1)葡萄糖作為碳源，的糠醛加到察氏培養(yǎng)基中；的糠醛加到無葡萄糖的察氏培養(yǎng)基中；C3)葡萄糖作為碳源，的5-羥甲基2-呋喃甲醛加到察氏培養(yǎng)基中；1 %的5-羥甲基2-呋喃甲醛加到無葡萄糖的察氏培養(yǎng)基中；四組培養(yǎng)基中分別接種構(gòu)巢裸胞殼110進(jìn)行培養(yǎng)，以上四組實(shí)驗(yàn)條件均為 pH5. 5，分別在40°C (SSF工藝溫度)和35°C (SHF工藝發(fā)酵溫度)進(jìn)行。分別于0h、24h、 48h.72h.96h取樣，用液相色譜測(cè)定5-羥甲基2-呋喃甲醛濃度，紫外分光光度發(fā)測(cè)定糠醛濃度。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)糠醛在40°C的共代謝效果如圖12所示，構(gòu)巢裸胞殼 110對(duì)糠醛在35°C的共代謝效果如圖13所示。由圖可見，在以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)基中， 兩種溫度下，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)于糠醛均有去除作用，在24h會(huì)有濃度略微的升高，然后培養(yǎng)基中的糠醛濃度幾乎呈直線下降，培養(yǎng)96h，35°C和40°C條件下的去除率分別為56. 52% 和觀.10%。這說明構(gòu)巢裸胞殼110可以在葡萄糖存在條件下代謝糠醛，且在35°C條件下， 更適合構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)糠醛的去除。在無葡萄糖的培養(yǎng)體系中，24h糠醛濃度有較大的升高，而后培養(yǎng)中糠醛濃度基本維持恒定，無明顯的去除效果，說明在沒有可利用的初級(jí)能源物質(zhì)存在的條件下，構(gòu)巢裸胞殼110不能代謝糠醛。
本實(shí)施方式構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在40°C的共代謝效果如圖14所示，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)羥甲基糠醛(5-羥甲基2-呋喃甲醛)在35°C的共代謝效果如圖15所示。由圖可見，構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)于5-羥甲基2-呋喃甲醛的去除效果與對(duì)糠醛的去除類似，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中，35°C和40°C條件下的去除率分別為 69. 21%,50. 25%。在無葡萄糖的培養(yǎng)基中無明顯的去除效果。
權(quán)利要求
1. 一株對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼，其特征在于對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼為構(gòu)巢裸胞殼110 (Emericella nidulans 110)，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期為2010年12月M 日，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4514。
全文摘要
一株對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼，涉及一株構(gòu)巢裸胞殼。本發(fā)明提供了一株構(gòu)巢裸胞殼，能夠去除乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等蒸汽爆破預(yù)處理所產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物，提高燃料乙醇的得率。本發(fā)明對(duì)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用的構(gòu)巢裸胞殼為構(gòu)巢裸胞殼110，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2010年12月24日，保藏編號(hào)為CGMCC No.4514。構(gòu)巢裸胞殼110對(duì)經(jīng)蒸汽爆破預(yù)處理產(chǎn)物具有解毒作用，可以清除抑制纖維素降解和發(fā)酵的有毒物質(zhì)，這些有毒物質(zhì)包括Ca2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、乙酸、丙酸、丁酸、糠醛和5-羥甲基2-呋喃甲醛。
文檔編號(hào)C12P7/10GK102505000SQ20111033752
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者于艷玲, 馮玉杰, 徐琛, 李冬梅, 李梓木 申請(qǐng)人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)