專利名稱：產(chǎn)原花色素微生物的快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及檢測產(chǎn)原花色素微生物的方法。
背景技術(shù)：
原花色素(Proathocyanidins)，也叫原花青素，是類黃酮的一種。原花色素是清除自由基最強的抗氧化劑之一，能保護大腦與神經(jīng)組織，改善血液循環(huán)，靈活關(guān)節(jié)和年輕皮膚的作用。長期食用高含原花色素的食品，可以緩解心血管等疾病，原花色素還可以作為天然的食品添加劑。隨著人類對健康的日益關(guān)注，含原花色素的產(chǎn)品消費需求越來越大，因此原花色素具有廣泛的應(yīng)用前景。
目前原花色素的來源主要是從植物中提取的，如松樹皮，葡萄籽、桑葚、草莓、茶葉和油菜種皮等是原花色素提取的來源，但這些來源植物生產(chǎn)周期長，大量種植和收集這些植物材料需要大面積的耕地和較高的成本，同時植物來源的原花色素的提取工藝也比較復(fù)雜，不利于原花色素的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。微生物生長快，繁殖周期短，可以很方便的應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)，因此開發(fā)能產(chǎn)原花色素的微生物資源是原花色素大規(guī)模生產(chǎn)的一個重要方向，但目前未見有簡便快速檢測產(chǎn)原花色素微生物的報道。
原花色素合成的前體物質(zhì)和原花色素都是無色的，因此靠肉眼很難發(fā)現(xiàn)哪些微生物能產(chǎn)原花色素。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下原花色素可與香草醛發(fā)生縮合反應(yīng)，產(chǎn)生紅色物質(zhì)，可以利用這種現(xiàn)象很方便地發(fā)現(xiàn)產(chǎn)原花色素的微生物，同時香草醛染色法還可以測定原花色素的含量。本發(fā)明為產(chǎn)原花色素微生物的尋找和檢測提供了一種新的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種直觀、經(jīng)濟、簡便的尋找產(chǎn)原花色素微生物的方法，同時也可應(yīng)用于檢測微生物中原花色素的含量。本發(fā)明方法使用試劑價格低廉，操作簡單，效果明顯，見效快。
本發(fā)明的技術(shù)方案在常溫下，把待檢測的微生物菌體放置在載玻片上，用酸性香草醛(Vanillin)醇類溶液浸泡微生物菌體15-60分鐘，若菌體中含有原花色素，則菌會被染上紅色，且原花色素含量越高，顏色越紅，從而達到快速檢測微生物中是否產(chǎn)原花色素的目的。
所述香草醛酸性醇類溶液為香草醛鹽酸-乙醇溶液或香草醛鹽酸-甲醇溶液。
所述的香草醛鹽酸-乙醇溶液中，香草醛的濃度為0. 5-1%，鹽酸濃度為5-10%，乙醇濃度為45-50%。
所述的香草醛鹽酸-甲醇溶液中，香草醛的濃度0. 5-1%，鹽酸濃度為5-10%，甲醇濃度為55-60%。
發(fā)明申請人根據(jù)微生物的特點和原花色素的化學(xué)性質(zhì)，在本發(fā)明中采用酸破壞微生物菌體并提供酸性環(huán)境，有利于染色劑進入細胞與原花色素反應(yīng)，微生物中原花色素含量越高，顏色越紅，從而能簡便、直觀地檢測微生物中原花色素的有無和含量的高低。
具體實施方式
實施例1(1)取原花色素標(biāo)準(zhǔn)品(購自南京替斯艾么中藥研究所)，分別配制成以下濃度的原花色素溶液0. 5mg/ml、l. Omg/mlU. 5mg/ml、2. Omg/ml，分別取0. 5毫升原花色素溶液置于透明容器中；(2)把0.5克香草醛加入100毫升鹽酸-乙醇溶液中，其中鹽酸濃度為5%，乙醇濃度為 50%，充分溶解，得香草醛鹽酸-乙醇溶液。
(3)分別在裝有原花色素溶液的透明容器中加入0. 5毫升上述香草醛鹽酸-乙醇溶液，在常溫下染色15分鐘后觀察顏色，所有溶液中都產(chǎn)生紅色，且紅色的程度隨著原花色素濃度的增加依次增加。
實施例2(1)取兩種不同類型的大腸桿菌，其中一個為正常的大腸桿菌，文獻報道該菌不能合成原花色素，另一個是含有質(zhì)粒(該質(zhì)粒上含有花色素合成酶基因和類黃酮3-0-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因)的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，文獻報道該菌能夠產(chǎn)原花色素。
(2)把1克香草醛加入100毫升鹽酸-乙醇溶液中，其中鹽酸濃度為8%，乙醇濃度為45%，充分溶解，得香草醛鹽酸-乙醇溶液。
(3)將上述2種大腸桿菌分別接種到固體LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基的表面，37°C 培養(yǎng)M小時后，取部分菌體于載玻片上，用上述香草醛鹽酸-乙醇溶液完全覆蓋，常溫下染色15分鐘后，含有質(zhì)粒的BL21菌體被染成紅色，而正常BL21菌體沒有被染上紅色。
實施例3(1)取兩種不同類型的放線菌，通過HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，其中一個能產(chǎn)原花色素，另一個不能產(chǎn)原花色素。
(2)把0. 8克香草醛加入100毫升鹽酸-乙醇溶液中，其中鹽酸濃度為10%，乙醇濃度為48%，充分溶解，得香草醛鹽酸-乙醇溶液。
(3)將上述2種菌分別接種到放線菌固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)48小時后，取部分菌體于載玻片上，用上述香草醛鹽酸-乙醇溶液完全覆蓋，常溫下染色60分鐘后，能產(chǎn)原花色素的放線菌被染成紅色，而不產(chǎn)原花色素的放線菌不被染上色。
實施例4把0. 5克香草醛加入100毫升鹽酸-甲醇溶液中，其中鹽酸濃度為5%，甲醇濃度為55%， 充分溶解，得香草醛鹽酸-甲醇溶液；分別在裝有原花色素溶液的透明容器中加入0. 5毫升上述香草醛鹽酸-甲醇溶液，其它同實施例1。
實施例5把1克香草醛加入100毫升鹽酸-甲醇溶液中，其中鹽酸濃度為8%，甲醇濃度為60%， 充分溶解，得香草醛鹽酸-甲醇溶液；將兩種大腸桿菌分別接種到固體LBauria-Bertani) 培養(yǎng)基的表面，37°C培養(yǎng)M小時后，取部分菌體于載玻片上，用上述香草醛鹽酸-甲醇溶液完全覆蓋。其它同實施例2。
實施例64把0. 8克香草醛加入100毫升鹽酸-甲醇溶液中，其中鹽酸濃度為10%，甲醇濃度為 58%，充分溶解，得香草醛鹽酸-甲醇溶液。將兩種菌分別接種到放線菌固體培養(yǎng)基上，28°C 培養(yǎng)48小時后，取部分菌體于載玻片上，用上述香草醛鹽酸-甲醇溶液完全覆蓋。其它同實施例3。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)原花色素(Proanthocyanidins)微生物的快速檢測方法，其特征為在常溫下，用香草醛酸性醇類溶液浸泡待檢測的微生物菌體15-60分鐘，若微生物中含有原花色素則會被染上紅色，且原花色素含量越高，顏色越紅；若微生物樣品中不含原花色素則不被染上紅色，從而達到快速檢測微生物樣品中是否含有原花色素的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物中原花色素的快速檢測方法，其特征為，所述香草醛酸性醇類溶液為香草醛鹽酸-乙醇溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物中原花色素的快速檢測方法，其特征為，所述香草醛酸性醇類溶液為香草醛鹽酸-甲醇溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的微生物中原花色素的快速檢測方法，其特征為，所述的香草醛鹽酸-乙醇溶液中，香草醛的濃度為0. 5-1%，鹽酸濃度為5-10%，乙醇濃度為45-50%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物中原花色素的快速檢測方法，其特征為，所述的香草醛鹽酸-甲醇溶液中，香草醛的濃度0. 5-1%，鹽酸濃度為5-10%，甲醇濃度為55-60%。
全文摘要
一種產(chǎn)原花色素微生物的快速檢測方法，利用化學(xué)染色法，加入能與原花色素反應(yīng)的染料對微生物進行染色來檢測微生物是否產(chǎn)原花色素。香草醛的酸性-醇類溶液可以使含有原花色素的微生物菌體變?yōu)榧t色，原花色素含量越高，顏色越紅，而不含原花色素的微生物則不產(chǎn)生紅色，利用該方法可以簡便快速地篩選和檢測微生物是否產(chǎn)原花色素。
文檔編號C12Q1/04GK102507558SQ20111034173
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者嚴(yán)明理, 劉麗莉, 張明明, 文桂艷, 李林蔚, 王帥斌, 藥圓圓 申請人:湖南科技大學(xué)