專利名稱：一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)親和沉淀劑的制備領域，特別涉及一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法。
背景技術：
生物物質(zhì)，特別是酶和抗體等蛋白質(zhì)，具有識別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結合的能力，這種識別并結合特定分子的能力具有排他性，即生物分子能夠區(qū)分結構和性質(zhì)非常相近的其他分子，選擇性地與其中某一種分子相結合。這種生物物質(zhì)間的特異性相互作用即為親和作用(affinity)。利用生物分子間的親和作用的原理進行生物物質(zhì)分離純化的技術稱為親和分離(affinity separation)或親和純化(affinity purification)金屬螯合親和純化是一種利用過渡金屬離子(Cu2+、Ni2+、Zn2+或Co2+)和蛋白質(zhì)上的電子供體基團之間的親和作用分離純化蛋白質(zhì)的方法。早在1948年，就有研究發(fā)現(xiàn)水溶液中的His和Cys可以與Cu2+、Ni2+形成穩(wěn)定的復合物。后續(xù)研究表明，蛋白質(zhì)中的His殘基的咪唑基、Cys殘基的巰基、Try殘基的吲哚基和Arg殘基的胍基都是很強的電子供體，當?shù)鞍踪|(zhì)上的這些氨基酸殘基暴露在水溶液中時，蛋白質(zhì)可以結合在固定在凝膠上的金屬離子Cu2+或Ni2+上。N-乙烯基己內(nèi)酰胺(NVCL)的高聚物聚(N-乙烯基己內(nèi)酰胺)簡稱PNVCL，一種具有最低臨界溶液溫度(LCST)特性的熱敏性智能聚合物材料，由于其大分子側鏈上同時具有親水和疏水基團，使PNVCL的水溶液隨著外界溫度的變化可在其LCST附件發(fā)生可逆相變。其相變溫度在人體生理溫度(30 40°C)附近，具有良好的離子型水溶性、熱敏性以及生物相容性，因而在藥物控釋、酶固定化、免疫分析、生化分離等領域有潛在的應用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法， 該方法操作簡單，所使用的聚合物可回收利用，有效降低蛋白質(zhì)分離純化成本，適合規(guī)?；a(chǎn)；所制備的溫敏型親屬螯合親和沉淀劑，操作簡單，反應時間短，蛋白吸附效果好。本發(fā)明的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，包括(1)將0. 25 2. Og N-乙烯基己內(nèi)酰胺與25 300 μ 1甲基丙烯酸溶解在去離子水中，得混合液，然后將所述的混合液置于反應容器中，真空脫氣，再加入0. 1 0. 60ml含有0. 01 0. 06g過硫酸銨的過硫酸銨水溶液，并調(diào)節(jié)體系pH值至7. 0，通氮氣鼓泡后密封后，在50 70°C反應1 池；反應結束后加入氯化鈉溶液沉淀，收集反應生成的沉淀，得到溫敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；(2)用Tris-HCl緩沖液將上述溫敏聚合物PNVCL-co-MAA配制成濃度為0. 05 0. 10g/ml的PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩沖液溶液，然后加入濃度為0. 1 0. 6mol/ L硫酸銅溶液，在室溫下振蕩反應0. 5 2h，收集反應生成的沉淀，得到親和溫敏聚合物 PNVCL-co-MAA-Cu，即為該溫敏型親屬螯合親和沉淀劑。
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步驟(1)中所述的N-乙烯基己內(nèi)酰胺的質(zhì)量為0. 5 1. 5g，甲基丙烯酸的用量為 50 150 μ 1。步驟(1)中所述的真空脫氣是時間為10 30min，氮氣鼓泡的時間為15 30min。步驟(1)中所加入的過硫酸銨水溶液中過硫酸銨的含量為0. 03 0. 05g。步驟(1)中所述的調(diào)節(jié)體系pH值至7. 0為采用濃度為lmol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)。步驟(1)中所述的氯化鈉溶液的濃度為0. 2mol/L。步驟(2)中所述的Tris-HCl 緩沖液為 0. 05mol/L、pH 值為 4. 0 8. 0 的 Tris-HCl 緩沖液。上述Tris-HCl緩沖液的pH值為5. 0 7. 0。步驟O)中所加入的硫酸銅溶液濃度為0. 2 0. 4mol/L,室溫反應時間為1 1. 5h。步驟⑵中所述的硫酸銅溶液與PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩沖液溶液的體積比為5 10 5 10。步驟( 中所得的溫敏型親屬螯合親和沉淀劑應用于牛血清蛋白BSA的親和沉淀純化。
本發(fā)明的PNVCL-co-MAA-Cu的合成路線，如下
權利要求
1.一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，包括(1)將0.25 2. Og N-乙烯基己內(nèi)酰胺與25 300 μ 1甲基丙烯酸溶解在去離子水中，得混合液，然后將所述的混合液置于反應容器中，真空脫氣，再加入0. 1 0. 60ml含有 0. 01 0. 06g過硫酸銨的過硫酸銨水溶液，并調(diào)節(jié)體系pH值至7. 0，通氮氣鼓泡后密封后， 在50 70。C反應1 池；反應結束后加入氯化鈉溶液沉淀，收集反應生成的沉淀，得到溫敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；(2)用1Tris-HCl緩沖液將上述溫敏聚合物PNVCL-co-MAA配制成濃度為0. 05 0. 10g/ml的PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩沖液溶液，然后加入濃度為0. 1 0. 6mol/ L硫酸銅溶液，在室溫下振蕩反應0. 5 2h，收集反應生成的沉淀，得到親和溫敏聚合物 PNVCL-co-MAA-Cu，即為該溫敏型親屬螯合親和沉淀劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟(1)中所述的N-乙烯基己內(nèi)酰胺的質(zhì)量為0. 5 1. 5g，甲基丙烯酸的用量為50 150 μ 1。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟(1)中所述的真空脫氣是時間為10 30min，氮氣鼓泡的時間為15 30min。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟(1)中所加入的過硫酸銨水溶液中過硫酸銨的含量為0. 03 0. 05g。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟(1)中所述的調(diào)節(jié)體系PH值至7. 0為采用濃度為lmol/L的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)；所述的氯化鈉溶液的濃度為0. 2mol/L。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟(2)中所述的Tris-HCl緩沖液為0. 05mol/L、pH值為4. 0 8. 0的Tris-HCl緩沖液。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 所述的Tris-HCl緩沖液的pH值為5. 0 7. 0。
8.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟⑵中所加入的硫酸銅溶液濃度為0. 2 0. 4mol/L，室溫反應時間為1 1.證。
9.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟O)中所述的硫酸銅溶液與PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩沖液溶液的體積比為5 10 5 10。
10.根據(jù)權利要求1所述的一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，其特征在于 步驟O)中所得的溫敏型親屬螯合親和沉淀劑應用于牛血清蛋白BSA的親和沉淀純化。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溫敏型親屬螯合親和沉淀劑的制備方法，包括(1)將N-乙烯基己內(nèi)酰胺與甲基丙烯酸溶解在去離子水中，得混合液，然后將所述的混合液置于反應容器中，真空脫氣，再加入過硫酸銨水溶液，調(diào)節(jié)體系pH值至7.0，通氮氣鼓泡后密封后，反應結束后，收集反應生成的沉淀，得到溫敏聚合物PNVCL-co-MAA聚合物；(2)配制PNVCL-co-MAA的Tris-HCl緩沖液溶液，然后加入硫酸銅溶液，振蕩反應，收集反應生成的沉淀，即得。本發(fā)明的制備方法簡單，所使用的聚合物可回收利用，有效降低蛋白質(zhì)分離純化成本，適合規(guī)?；a(chǎn)；本發(fā)明所制備的溫敏型親屬螯合親和沉淀劑，操作簡單，反應時間短，蛋白吸附效果好。
文檔編號C12N9/00GK102391422SQ20111034404
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權日2011年11月3日
發(fā)明者凌元清, 朱利民, 聶華麗 申請人:東華大學