專利名稱：一種柯薩奇病毒a16型病毒株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒學、分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand foot mouth disease,HFMD)是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報道，常見于嬰幼兒，由腸道病毒引起。臨床上以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹、潰瘍等表現(xiàn)為主，與心肌炎、心包炎、難治性休克等綜合性疾病相關(guān)?？滤_奇病毒(Coxasckievirus) A16型(Cox A16, CA 16)是手足口病主要病原體之
一，是小RNA病毒科的單股正鏈RNA病毒，呈20面立體對稱球形，直徑約23_30nm。主要經(jīng)
糞-口、呼吸道和密切接觸傳播，可通過胎盤傳給胎兒引起宮內(nèi)感染。早期發(fā)現(xiàn)的手足口
病的病原體主要為Cox A16型，20世紀70年代后，與EV71感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的
主要病原體。我國北京、福建、天津、吉林、山東、廣東、深圳、浙江、四川、安徽等多個省份均
有報道。手足口病的爆發(fā)和流行嚴重影響了人們的日常生活，造成巨大的經(jīng)濟損失和社會
負擔，利用病毒疫苗從根本上切斷病毒的傳播是目前較為有效的預(yù)防途徑之一，目前尚無
CA16病毒疫苗的報道，因此分離出適于疫苗生產(chǎn)的CA16病毒株具有巨大的經(jīng)濟和社會效.、
Mo

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的柯薩奇病毒A16型病毒株及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCCN0.5371，現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期2011年10月17日。在電鏡下觀察該毒株，病毒顆粒呈20面立體對稱球形,直徑約30nm。本發(fā)明還提供上述病毒株產(chǎn)生的多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白。本發(fā)明還提供編碼上述多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因。本發(fā)明還提供含有上述基因的載體以及含有該載體的宿主細胞。本發(fā)明還提供所述病毒株，所述多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白，編碼所述多聚酶、殼蛋白、糖蛋白、核蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，含有所述基因的載體或含有所述載體的宿主細胞在制備預(yù)防或治療由柯薩奇病毒所致傳染病的藥物或疫苗及診斷試劑中的應(yīng)用。前述的應(yīng)用，其是將所述柯薩奇病毒A16型病毒株經(jīng)過感染細胞(如vero細胞、人二倍體細胞或其它敏感細胞)、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用于進一步制備CA16疫苗。本發(fā)明還提供以柯薩奇病毒A16型病毒株，保藏號CGMCCN0.5371為免疫原制得的抗體或雜交瘤細胞或抗血清。
本發(fā)明還提供用于檢測所述柯薩奇病毒A16型病毒株的引物，包括CA16上游引物:5’ -TTGCAGACATGATTGACCAG-3’ 和 CA 16 下游引物:5’ -GAGTGATGGTTCAACACACA-3 ’。本發(fā)明還提供含有上述引物的用于檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒。本發(fā)明進一步提供所述柯薩奇病毒A16型病毒株產(chǎn)生的VPl蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼該VPl蛋白的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。對VPl全長序列分析和質(zhì)譜分析結(jié)果表明該毒株為CA16病毒，且無外源物污染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。本發(fā)明還提供一種制備抗體或雜交瘤細胞或抗血清的方法，其是以本發(fā)明的柯薩奇病毒A16型病毒株(CGMCC N0.5371)為免疫原。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果:(一 )通過蝕斑法分離得到的本發(fā)明的單克隆CA16病毒株，其子代病毒表現(xiàn)為遺傳穩(wěn)定，可用于人用CA16疫苗生產(chǎn)。( 二)利用本發(fā)明的CA16病毒株或由其生產(chǎn)的疫苗可用于預(yù)防由CA16病毒引起的疾病(例如手足口病，尤其是兒童的手足口病)，且具有滴度穩(wěn)定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。(三)本發(fā)明的CA16病毒株可在VeiO細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.41gCCID50/ml。


圖1為本發(fā)明CA16病毒株電鏡觀察結(jié)果(放大比例:100，000倍)。圖2為本發(fā)明CA16病毒株蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實施例1CA16病毒株的分離、培養(yǎng)和鑒定(一)病毒分離、培養(yǎng)自2010年浙江省手足口疫區(qū)(手足口累計發(fā)病人數(shù)達111783)收集CA16病毒PCR結(jié)果陽性的病人糞便標本，經(jīng)處理后接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養(yǎng)三代進行病毒分離，得到CA16病毒后，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。( 二)病毒鑒定1、VP1全長序列分析結(jié)果對該毒株產(chǎn)生的VPl蛋白進行VPl全長序列分析，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，編碼該VPl蛋白的基因序列如SEQ ID N0.1所示.
2、電鏡檢查結(jié)果在電鏡下觀察該株CA16病毒，病毒顆粒呈20面立體對稱球形，直徑約30nm。(圖1)3、質(zhì)譜分析結(jié)果對該株CA16病毒蛋白進行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明此毒株蛋白確為CA16病毒蛋白(圖 2)。4、無菌、支原體檢查結(jié)果對該株CA16病毒進行無菌、支原體檢查，結(jié)果表明無支原體和其它微生物污染。(按照《中國藥典》方法進行檢測)5、病毒滴度檢測結(jié)果采用微量滴定法測定該株病毒收獲液的病毒滴度，病毒滴度可達7.41g CCID50/ml ο方法如下:采用Vero細胞進行病毒滴度的測定。用96孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Vero細胞，細胞成片后將病毒用細胞維持液從KT1倍比稀釋至10_8，棄去VeiO細胞上清，分別加入每個稀釋度的病毒液，接種50 μ I/孔，每個稀釋度接種8孔，同時設(shè)細胞對照。置37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d觀察細胞感染病毒情況，計算病毒滴度。6、抗原含量檢測米用酶聯(lián)免疫法對該株CA16病毒抗原含量進行檢測，抗原含量不低于200U/ml。采用雙抗體夾心法定量測定樣品中CA16抗原含量。首先將特異性CA16多克隆抗體包被于酶標板形成固相抗體；然后加入CA16樣品，與固相抗體形成固相抗原抗體復(fù)合物；最后加入酶標記抗體，樣品中的CA16抗原可與酶標抗體發(fā)生特異性結(jié)合，當加入底物時出現(xiàn)成色反應(yīng)，用酶標儀在適當波長測定OD值，通過EXCEL統(tǒng)計分析結(jié)果。實施例2檢測CA16病毒株的引物及試劑盒1、用于檢測CA16病毒株的引物，包括:CA16 上游引物:5’ -TTGCAGACATGATTGACCAG-3’ 和CA 16 下游引物:5 ’ -GAGTGATGGTTCAACACACA-3，。2、含有上述引物的用于檢測CA16病毒株的檢測試劑盒。實施例3CA16疫苗的制備CA16病毒株經(jīng)過感染vero細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用于進一步制備CA16疫苗。(I)建立細胞主種子和工作種子庫(Vero細胞)將源自美國ATCC120代非洲綠猴腎細胞(Veix)細胞)種子復(fù)蘇，具體操作是:自液氮中取出細胞凍存管，置于39-40 V無菌水中，一分鐘之內(nèi)解凍細胞，無菌吸出懸液，IOOOrpm離心3min，棄上清，加入含10 %小牛血清的MEM細胞生長液，輕輕吹打使其混勻，將混勻的細胞懸液接種于25cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待其貼壁后進行換液，再置37°C，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5-7天細胞匯合度達到100%時按1: 4進行傳代，每傳代一次細胞代次增加一代。按上述方法制備129代Veix)細胞工作種子庫。依據(jù)上述方法，本領(lǐng)域的研究人員能同樣制備出滿足本發(fā)明要求的工作種子庫。細胞主種子庫和工作種子庫均保存在液氮(_196°C )中。(2)建立主代病毒種子庫和工作種子庫CA16病毒PCR結(jié)果陽性的手足口病患者 的臨床標本，經(jīng)處理后接種至非洲綠猴腎傳代細胞(Vero)上，培養(yǎng)三代進行病毒分離，得到CA16病毒后，通過蝕斑法獲得CA16病毒株。按照《中國藥典》關(guān)于種子庫建立方法的要求建立病毒主種子庫和工作種子庫，種子庫均冷凍保存(_60°C以下)。建庫方法如下:將CA16病毒株按1: 1000(體積比)接種至匯合度在100%的VeiO細胞(來自細胞工作種子庫)瓶中(培養(yǎng)基是含2%小牛血清的MEM細胞生長液)，置37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(CPE)。當CPE達+++至++++時收獲病毒，置-20°C冷凍，室溫融化后，將凍融物按上述方法繼續(xù)傳代建立病毒主代種子庫和工作種子庫。并送中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏。其保藏號為CGMCCN0.5371。每一批收獲液記為一代。(3)病毒收獲液制備復(fù)蘇VeiO工作種子庫細胞，經(jīng)擴增后，將本發(fā)明的CA16病毒株按比例接種于長至薄單層的細胞瓶內(nèi)，37°C培養(yǎng)，每天觀察細胞病變，當細胞病變達50%以上時，收獲病毒液，混勻后置-20°C保存,備用。(4)病毒滅活和純化將上述制備的CA16病毒收獲液用1: 100-1: 10000 (v/v)的β -丙內(nèi)酯或I: 1000-1: 10000 (ν/ν)的甲醒溶液滅活。病毒滅活也可在病毒純化以后進行。病毒滅活后將上述滅活液進行離心澄清后，進行超濾透析，體積濃縮至原體積的1/10-50。得到的病毒超濾液加入磁力攪拌子，置于磁力攪拌器上攪拌，同時緩慢加入PEG，使PEG終濃度為5-15%，調(diào)PH值至5.0-7.0之間，繼續(xù)攪拌10_60min。于2_8°C沉淀8_24h后離心20-60min，沉淀用PBS緩沖液重溶，離心后獲得病毒沉淀液。病毒沉淀液再經(jīng)蔗糖密度梯度離心，收集病毒所在區(qū)帶后，經(jīng)超濾脫糖得到病毒脫糖液。病毒脫糖液經(jīng)分子篩層析后得到病毒層析液，層析液經(jīng)除菌后得到疫苗原液。(5)疫苗制備將上述疫苗原液與氫氧化鋁佐劑按適宜比例吸附后即獲得CA16疫苗半成品。CA16半成品經(jīng)分裝，檢定 后即為成品疫苗。實施例4CA16病毒株免疫原性試驗將實施例3中制備的疫苗原液CA16毒株在Vero細胞上進行擴大培養(yǎng)，純化，滅活后免疫小鼠、新西蘭兔、羊均獲得較好的保護效果。原液制備方法同實施例3所述。其中，對羊進行的免疫原性試驗如下:將疫苗原液與氫氧化鋁佐劑等比例吸附后，于第O天、7天、14天、21天對羊進行免疫，2ml/只/次，在整個試驗期內(nèi)，對動物的健康情況、行為變化等做詳細記錄。在免疫當天動物應(yīng)當觀察半小時。每天兩次觀察動物有無死亡情況。分別于第O天、7天、14天、21天、28天進行采血。靜脈采少量血，3000rpm離心lOmin，分離血清。進行抗CA16中和抗體滴度測定，方法如下:在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入分離獲得的羊血清，用維持液進行倍比稀釋至一定濃度后，加入事先稀釋至100CCID50的CA16檢定毒株溶液，中和1.5h_2h后加入檢用細胞懸液，細胞濃度為1.5-2.0X IO5個/ml，置于37°C，CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。5_7天后觀察細胞病變情況，其中以出現(xiàn)細胞病變的血清最高稀釋度為血清中和效價，陽性判定指標:中和效價大于1: 8，陰性對照血清效價小于1: 8。結(jié)果見表I。表I對羊進行免疫原性試驗的中和抗體檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種柯薩奇病毒A16型病毒株,其保藏號為CGMCC N0.5371。
2.權(quán)利要求1所述病毒株產(chǎn)生的VPl蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.碼權(quán)利要求2所述VPl蛋白的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
5.有權(quán)利要求3或4所述基因的載體及含有該載體的宿主細胞。
6.權(quán)利要求1所述病毒株，權(quán)利要求2所述VPl蛋白，權(quán)利要求3或4所述的基因，權(quán)利要求5所述的載體及含有該載體的宿主細胞在制備預(yù)防或治療由柯薩奇病毒所致傳染病的藥物或疫苗及診斷試劑中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，權(quán)利要求1所述病毒株經(jīng)過感染細胞、培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活和純化后，得到疫苗原液，用于進一步制備柯薩奇病毒A16型疫苗。
8.按權(quán)利要求1所述的病毒株為免疫原制得的抗體或雜交瘤細胞或抗血清。
9.測權(quán)利要求1所述病毒株的特異性引物，包括: CA 16 上游引物:5’ -TTGCAGACATGATTGACCAG-3’ 和 CA 16 下游引物:5’ -GAGTGATGGTTCAACACACA-3’。
10.有權(quán)利要求9所述引物的用于檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種柯薩奇病毒A16型病毒株，其保藏號為CGMCC No.5371。對該毒株產(chǎn)生的VP1蛋白進行全長序列分析和質(zhì)譜分析結(jié)果表明是CA16病毒，且無外源物污染，有較好的免疫原性，是一株效果良好的病毒株。該株CA16病毒可在Vero細胞中高效增殖，病毒滴度可達7.41g CCID50/ml。利用本發(fā)明的CA16病毒株或由其生產(chǎn)的疫苗可用于預(yù)防由CA16病毒引起的疾病，且具有滴度穩(wěn)定、免疫原性較好、免疫劑量小的特點。
文檔編號C12N5/10GK103087994SQ20111034437
公開日2013年5月8日 申請日期2011年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月3日
發(fā)明者高強, 李雅靜, 王巍巍, 尹衛(wèi)東 申請人:北京科興生物制品有限公司