專利名稱：一種埃博霉素b的發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于埃博霉素B的生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
埃博霉素B (Epothilone B)是粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)產(chǎn)生的一種聚酮次級代謝產(chǎn)物，它與臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物紫杉醇具有相同的穩(wěn)定微管活性，且對紫杉醇耐藥的腫瘤細(xì)胞具有活性。另外埃博霉素來源于微生物代謝產(chǎn)物的特征使其被人們認(rèn)為是一種比紫杉醇類藥物更具市場前途的抗癌藥物。埃博霉素的發(fā)現(xiàn)可以追溯到上世紀(jì)八十年代德國國家生物技術(shù)研究中心(GBF) 的微生物學(xué)家對土壤中粘細(xì)菌的大量研究工作。1987年他們在尋找抗真菌藥物時發(fā)現(xiàn)了一株粘細(xì)菌(Sorangium cellulosum So ce90)能產(chǎn)生一類具有微弱抗真菌活性的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，命名為Epothilone (埃博霉素)。當(dāng)時這個化合物并沒有引起研究人員的重視。 1995年默克實驗室的研究人員發(fā)現(xiàn)了埃博霉素具有和紫杉醇類似的促微管聚合活性。從此，埃博霉素以其比紫杉醇更好的水溶性，更簡單的結(jié)構(gòu)，對紫杉醇抗性腫瘤細(xì)胞的高活性以及可以通過微生物發(fā)酵制備而迅速成為繼紫杉醇之后發(fā)現(xiàn)的促微管聚合化合物中最令人興奮的研究熱點。目前諾華、施貴寶、默克、羅氏等大型跨國制藥公司都在埃博霉素藥物的臨床研究上投入了大量的人力物力，美國FDA于2007年10月16日批準(zhǔn)施貴寶公司的埃博霉素產(chǎn)品(Ixab印ilone，BMS-247550, IxempraTM，“伊沙匹隆”)單用或與卡培他濱合用治療對其他化療藥物無效的轉(zhuǎn)移性或局部晚期乳腺癌。預(yù)期未來將有多種埃博霉素藥物上市。與臨床研究相比，埃博霉素的生產(chǎn)技術(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。其主要的瓶頸在于發(fā)酵產(chǎn)量低， 粘細(xì)菌發(fā)酵制備埃博霉素的產(chǎn)量僅在mg/L發(fā)酵液水平。其中有兩個重要原因，第一是埃博霉素對生產(chǎn)菌株的毒性和反饋抑制作用較大程度導(dǎo)致埃博霉素發(fā)酵產(chǎn)量很難提高；第二個導(dǎo)致埃博霉素生產(chǎn)成本高的原因是發(fā)酵結(jié)束后產(chǎn)物中存在大量埃博霉素同系物，導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物分離純化成本非常高。如何提高埃博霉素的發(fā)酵產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本成為目前埃博霉素藥物研發(fā)的一個重要方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，提高埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)能力，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，包括以下步驟1)按IOOml接種1 IOmg菌種的比例，將纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum) 接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質(zhì)量100 800倍的特異性吸附埃博霉素B的分子印跡聚合物，在25 :35°C下?lián)u床發(fā)酵96 192h ；2)發(fā)酵完成后，分離并收集發(fā)酵液中的吸附了埃博霉素B的分子印跡聚合物，然后用甲醇多次萃取，將埃博霉素B從分子印跡聚合物中分離出來，分別收集含有埃博霉素B 的甲醇和分子印跡聚合物。所述的發(fā)酵液中含有黃豆粉20 50g/L、玉米淀粉5 10g/L、磷酸二氫鈉1 2g/L、磷酸氫二鈉 1 2g/L、MgS04 ·7Η20 2 5g/L、FeSO4 · 7Η20 0· 1 0. 5g/L、CaCl2 2 5g/L、MnCl2 0. 1 0. 5g/L 和葡萄糖 10 15g/L, pH 為 7. 2 7. 5。在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每 IOOml發(fā)酵液加入0. 05 0. 2g葡萄糖的比例補加，在第48h至發(fā)酵結(jié)束每隔10 15min 按每IOOml發(fā)酵液加入0. 1 0. 4g葡萄糖的比例補加。所述的發(fā)酵液中還含有土豆淀粉、葡聚糖、甘露糖中的一種，其含量為5 10g/L ；所述的發(fā)酵液中還含有蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、黃豆粉、KN03、NH4SO4中的一種作為氮源，氮源的含量為2 8g/L。所述的分子印跡聚合物的制備為按照埃博霉素B:功能單體交聯(lián)劑引發(fā)劑溶劑=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩爾比，將上述反應(yīng)原料加入到反應(yīng)容器中，在保護氣氛下超聲振蕩20 30min，在攪拌下通入氮氣20 30min ；然后在45 55°C下聚合反應(yīng)12 24h,再在55 65°C下聚合反應(yīng)8 12h ；聚合反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩后得到粒徑為40 60 μ m的聚合反應(yīng)物；所述的功能單體為甲基丙烯酸；所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；將收集的聚合反應(yīng)物用水充分洗滌后，然后用乙酸甲醇體積比=1 9 3 7 的混合溶液連續(xù)洗滌，脫去埃博霉素B，冷凍干燥后得到埃博霉素B的分子印跡聚合物。所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或過氧化二苯甲酰；所述的溶劑為去離子水、甲醇或乙腈。所述的搖床的轉(zhuǎn)速為100 160r/min。所述的纖維堆囊菌(Sorangiumeellulosum)為 ATCC15384、ATCC25569 或 ATCC25531。所述的纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)為經(jīng)過理化誘變、原生質(zhì)體融合或 Genome shuffling改造而篩選到的高產(chǎn)菌株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，通過以下改進1)添加特異性吸附埃博霉素B的分子印跡聚合物；幻對培養(yǎng)基的改進，包括對碳源、氮源的組合；幻葡萄糖的脈沖式的補加以消除葡萄糖抑制效應(yīng)；更進一步還可以對纖維堆囊菌進行理化誘變、雜交或原生質(zhì)體融合而篩選到的高產(chǎn)菌株，從而提高埃博霉素B的產(chǎn)量。在埃博霉素B發(fā)酵生產(chǎn)時添加特異性吸附埃博霉素B的分子印跡聚合物，這樣在發(fā)酵時分子印跡聚合物在達到吸附平衡之前將持續(xù)的吸附發(fā)酵時產(chǎn)生的埃博霉素B，解決了埃博霉素B發(fā)酵時的反饋抑制作用，實現(xiàn)連續(xù)液體發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B ；另一方面，埃博霉素B被分子印跡聚合物吸附，也有利于其在發(fā)酵產(chǎn)物中的分離，只要離心分離收集作為沉淀的分子印跡聚合物，就可以將其從發(fā)酵液中分離，然后再從分子印跡聚合物將埃博霉素B萃取出來就可以了，而分子印跡聚合物經(jīng)過干燥處理還可以重復(fù)使用。在添加分子印跡聚合物和葡萄糖的脈沖式的補加以后，埃博霉素B的產(chǎn)量達到了48mg/L，與目前的發(fā)酵生產(chǎn)水平O^ig/L)相比提高了 1倍。而培養(yǎng)基的進一步優(yōu)化可分別取一種碳源，一種氮源和共有成分組成液體培養(yǎng)基，分析各個培養(yǎng)基的發(fā)酵產(chǎn)量，優(yōu)選出最優(yōu)碳源和氮源。


圖1為改進工藝后的埃博霉素B產(chǎn)量分析的HPLC譜圖。
具體實施例方式本發(fā)明通過在進行發(fā)酵時將添加作為吸附劑的分子印跡聚合物，以便于埃博霉素 B的連續(xù)生產(chǎn)和分離，以及培養(yǎng)基和葡萄糖補充兩個方面的改進，以提高埃博霉素B產(chǎn)量。 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。實施例1分子印跡聚合物的制備及埃博霉素B的發(fā)酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的制備按以下比例將埃博霉素B lmmol、甲基丙烯酸4mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 20mmol，偶氮二異丁氰10mg，乙腈3ml混合裝入反應(yīng)管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應(yīng)管封口，置于50°C水浴中聚合M小時，再于60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應(yīng)產(chǎn)物；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒于用水洗滌后，再用乙酸甲醇(體積比1 9)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規(guī)定的萃取時間后再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍干燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博霉素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博霉素B的發(fā)酵將制備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發(fā)酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25531細(xì)胞干重/分子印跡聚合物的質(zhì)量=100ml/10mg/3g的用量投入到埃博霉素B 的發(fā)酵液中；發(fā)酵液的組成為黃豆粉20g/L，玉米淀粉5g/L，磷酸二氫鈉2g/L，磷酸氫二鈉2g/ L, MgSO4 · 7H20 5g/L, FeSO4 · 7H20 0. lg/L, CaCl2 5g/L, MnCl2O. lg/L,葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵時間為96小時；在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每 IOOml發(fā)酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加，在第4 至發(fā)酵結(jié)束每隔IOmin按每IOOml發(fā)酵液加入0. 2g葡萄糖的比例補加；將上述發(fā)酵結(jié)束的含有分子印跡聚合物的發(fā)酵液置于2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉淀物即為分離到的含有埃博霉素B 的分子印跡聚合物。3)埃博霉素B的分離埃博霉素B的洗脫采用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博霉素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重復(fù)萃取3次后，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數(shù)次；
含有埃博霉素B的甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOrpm，溫度為40°C )回收甲醇， 甲醇重復(fù)利用；蒸干甲醇后獲得剩余固形物即為埃博霉素B粗品。甲醇洗滌過的埃博霉素B的分子印跡聚合物，經(jīng)真空干燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空干燥即可重復(fù)使用，能夠保證高效吸附埃博霉素B的使用次數(shù)為3次。將含埃博霉素B的甲醇0. 22 μ m微孔濾膜過濾后，作為HPLC分析的樣品，定量分析其產(chǎn)品含量。HPLC分析條件為色譜柱為AT LiCHROM C18反相柱；檢測波長為M9nm ；流動相的制備工藝為取350mL超純水與650mL甲醇混勻，然后用乙酸調(diào)pH為4 ；流速為Iml/ min ；進樣量為10 μ L ；埃博霉素B的保留時間為11. 5min。檢測結(jié)果如圖1所示，其中埃博霉素B保留時間處峰面積定量分析其含量，結(jié)果顯示其含量為獲得埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量為48mg/L。實施例2分子印跡聚合物的制備及埃博霉素B的發(fā)酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的制備按以下比例將埃博霉素B lmmol、甲基丙烯酸3mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 25mmol，偶氮二異丁氰10mg，甲醇8ml混合裝入反應(yīng)管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應(yīng)管封口，置于45°C水浴中聚合M小時，再于65°C水浴中聚合12小時得到聚合反應(yīng)產(chǎn)物；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒于用水洗滌后，再用乙酸甲醇(體積比3 7)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規(guī)定的萃取時間后再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍干燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博霉素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博霉素B的發(fā)酵將制備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發(fā)酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC15384細(xì)胞干重/分子印跡聚合物的質(zhì)量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博霉素B的發(fā)酵液中；發(fā)酵液的組成為黃豆粉10g/L，10g/L 土豆淀粉，玉米淀粉5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵時間為96小時；在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每 IOOrnl發(fā)酵液加入0. 05g葡萄糖的比例補加，在第4 至發(fā)酵結(jié)束每隔IOmin按每100ml發(fā)酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加。將上述發(fā)酵結(jié)束的含有分子印跡聚合物的發(fā)酵液置于2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉淀物即為分離到的含有埃博霉素B 的分子印跡聚合物。3)埃博霉素B的分離埃博霉素B的洗脫采用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博霉素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重復(fù)萃取3次后，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數(shù)次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOrpm，溫度為40°C)回收甲醇，甲醇重復(fù)利用；蒸干甲醇后獲得剩余固形物即為埃博霉素B粗品。甲醇洗滌過的埃博霉素B的分子印跡聚合物，經(jīng)真空干燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空干燥即可重復(fù)使用。實施例3分子印跡聚合物的制備及埃博霉素B的發(fā)酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的制備按以下比例將埃博霉素B Immol、甲基丙烯酸3. 5mmol,乙二醇二甲基丙烯酸酯 30mmol，偶氮二異丁氰5mg，乙腈3ml混合裝入反應(yīng)管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應(yīng)管封口，置于50°C水浴中聚合M小時，再于60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應(yīng)產(chǎn)物；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒于用水洗滌后，再用乙酸甲醇(體積比3 7)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規(guī)定的萃取時間后再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍干燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博霉素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博霉素B的發(fā)酵將制備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發(fā)酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25569細(xì)胞干重/分子印跡聚合物的質(zhì)量=100ml/5mg/2g的用量投入到埃博霉素B的發(fā)酵液中；發(fā)酵液的組成為黃豆粉10g/L，10g/L葡聚糖，玉米淀粉5g/L，NH4S045g/L,磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7Η200· 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每 IOOml發(fā)酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加，在第4 至發(fā)酵結(jié)束每隔15min按每IOOml發(fā)酵液加入0. 4g葡萄糖的比例補加。發(fā)酵溫度為30°C，發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵時間為96小時；將上述發(fā)酵結(jié)束的含有分子印跡聚合物的發(fā)酵液置于2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉淀物即為分離到的含有埃博霉素B 的分子印跡聚合物。3)埃博霉素B的分離埃博霉素B的洗脫采用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博霉素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重復(fù)萃取3次后，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數(shù)次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOrpm，溫度為40°C)回收甲醇，甲醇重復(fù)利用；蒸干甲醇后獲得剩余固形物即為埃博霉素B粗品，獲得埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量為52mg/L。甲醇洗滌過的埃博霉素B的分子印跡聚合物，經(jīng)真空干燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空干燥即可重復(fù)使用。實施例4分子印跡聚合物的制備及埃博霉素B的發(fā)酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的制備按以下比例將埃博霉素B Immol、甲基丙烯酸3. 5mmol,乙二醇二甲基丙烯酸酯30mmol，偶氮二異丁氰5mg，甲醇3ml混合裝入反應(yīng)管，通氮排氧30min，在氮氣保護下將反應(yīng)管封口，置于50°C水浴中聚合M小時，再于60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應(yīng)產(chǎn)物；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒于用水洗滌后，再用乙酸甲醇(體積比1 9)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規(guī)定的萃取時間后再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍干燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博霉素B分子印跡聚合物吸附劑。2)埃博霉素B的發(fā)酵將制備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發(fā)酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25531細(xì)胞干重/分子印跡聚合物的質(zhì)量=100ml/lmg/4g的用量投入到埃博霉素B的發(fā)酵液中；發(fā)酵液的組成為黃豆粉10g/L，10g/L甘露糖，玉米淀粉5g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7Η200· 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發(fā)酵溫度為35°C，發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速為IOOrpm，發(fā)酵時間為192小時；在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每 IOOml發(fā)酵液加入0. 05g葡萄糖的比例補加，在第4 至發(fā)酵結(jié)束每隔15min按每IOOml發(fā)酵液加入0. 4g葡萄糖的比例補加。將上述發(fā)酵結(jié)束的含有分子印跡聚合物的發(fā)酵液置于2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉淀物即為分離到的含有埃博霉素B 的分子印跡聚合物。3)埃博霉素B的分離埃博霉素B的洗脫采用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博霉素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重復(fù)萃取3次后，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數(shù)次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOrpm，溫度為40°C)回收甲醇，甲醇重復(fù)利用；蒸干甲醇后獲得剩余固形物即為埃博霉素B粗品，獲得埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量為50mg/L。甲醇洗滌過的埃博霉素B的分子印跡聚合物，經(jīng)真空干燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空干燥即可重復(fù)使用。實施例5分子印跡聚合物的制備及埃博霉素B的發(fā)酵，包括以下步驟1)分子印跡聚合物的制備按以下比例將埃博霉素B lmmol、甲基丙烯酸2mmol，乙二醇二甲基丙烯酸酯 20mmol，偶氮二異丁氰5mg，含甲醇20%的去離子水3ml混合裝入反應(yīng)管，通氮排氧30min， 在氮氣保護下將反應(yīng)管封口，置于50°C水浴中聚合M小時，再于60°C水浴中聚合12小時得到聚合反應(yīng)產(chǎn)物；將得到的反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩得到粒徑40-60 μ m的聚合物顆粒；將得到的聚合物顆粒于用水洗滌后，再用乙酸甲醇(體積比2 8)混合溶液中通過索氏萃取器抽提48h，達到規(guī)定的萃取時間后再用甲醇抽提二次，每次12h，印跡聚合物真空冷凍干燥(溫度-20°C、壓力20Pa)得到埃博霉素B分子印跡聚合物吸附劑。
2)埃博霉素B的發(fā)酵發(fā)酵菌株的Genome shuffling改造利用纖維堆囊菌ATCC25569作為起始菌株， 理化工藝誘變篩選高產(chǎn)埃博霉素B菌株3-6株，利用纖維堆囊菌原生質(zhì)體融合體系，獲得誘變高產(chǎn)菌株的融合雜種，并且融合雜種和誘變高產(chǎn)菌株回交4-5次，通過雜交菌株后代選擇、產(chǎn)量分析和基因組鑒定，可獲得高產(chǎn)埃博霉素B shuffling改造菌株；將制備得到的分子印跡聚合物作為吸附劑，按發(fā)酵液的體積/接種纖維堆囊菌 ATCC25569Genome shuffling改造菌株干重/分子印跡聚合物的質(zhì)量=100ml/2mg/8g的用量投入到埃博霉素B的發(fā)酵液中；發(fā)酵液的組成為黃豆粉10g/L，土豆淀粉10g/L，玉米蛋白粉5g/L，KNO3 5g/L，磷酸二氫鈉 lg/L，磷酸氫二鈉 lg/L，MgSO4 · 7H20 3g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2g/L，MnCl2 0. 5g/L，葡萄糖 lOg/L, pH7. 2 ；發(fā)酵溫度為^°C，發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，發(fā)酵時間為120小時；在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每 IOOml發(fā)酵液加入0. Ig葡萄糖的比例補加，在第4 至發(fā)酵結(jié)束每隔15min按每IOOml發(fā)酵液加入0. 2g葡萄糖的比例補加。將上述發(fā)酵結(jié)束的含有分子印跡聚合物的發(fā)酵液置于2500rpm的離心機上分離 30分鐘進行分離分子印跡聚合物，棄去上清液，下層沉淀物即為分離到的含有埃博霉素B 的分子印跡聚合物。3)埃博霉素B的分離埃博霉素B的洗脫采用溶劑萃取法以甲醇作為萃取液，常溫下將含有埃博霉素B的分子印跡聚合物在索氏萃取器中用甲醇重復(fù)萃取3次后，再用大量甲醇充分洗滌分子印跡聚合物數(shù)次；含有埃博霉素B的甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(轉(zhuǎn)速為lOOrpm，溫度為40°C )回收甲醇，甲醇重復(fù)利用；蒸干甲醇后獲得剩余固形物即為埃博霉素B粗品，獲得埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量為58mg/L。甲醇洗滌過的埃博霉素B的分子印跡聚合物，經(jīng)真空干燥、研磨、過40 60 μ m篩或真空干燥即可重復(fù)使用。
權(quán)利要求
1.一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括以下步驟1)按IOOml接種1 IOmg菌種的比例，將纖維堆囊菌(Sorangiumcellulosum)接種于發(fā)酵液中，然后加入菌種質(zhì)量100 800倍的特異性吸附埃博霉素B的分子印跡聚合物， 在25 35°C下?lián)u床發(fā)酵96 19 ；2)發(fā)酵完成后，分離并收集發(fā)酵液中的吸附了埃博霉素B的分子印跡聚合物，然后用甲醇多次浸提，將埃博霉素B從分子印跡聚合物中分離出來，分別收集含有埃博霉素B的甲醇和分子印跡聚合物。
2.如權(quán)利要求1所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵液中含有黃豆粉20 50g/L、玉米淀粉5 10g/L、磷酸二氫鈉1 2g/L、磷酸氫二鈉1 2g/L、 MgSO4 ·7Η202 5g/L、FeS04 ·7Η20 0· 1 0. 5g/L、CaCl2 2 5g/L、MnCl2 0· 1 0. 5g/L 禾口葡萄糖10 15g/L，pH為7. 2 7. 5。
3.如權(quán)利要求1或2所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，在發(fā)酵培養(yǎng)時還進行葡萄糖的補加在發(fā)酵培養(yǎng)的第1 4 每隔30min按每IOOml發(fā)酵液加入0. 05 0. 2g葡萄糖的比例補加，在第48h至發(fā)酵結(jié)束每隔10 15min按每IOOml發(fā)酵液加入 0. 1 0. 4g葡萄糖的比例補加。
4.如權(quán)利要求2所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵液中還含有土豆淀粉、葡聚糖、甘露糖中的一種，其含量為5 10g/L ；所述的發(fā)酵液中還含有蛋白胨、水解乳蛋白、玉米蛋白粉、ΚΝ03、ΝΗ4504ψ的一種作為氮源，氮源的含量為2 8g/L。
5.如權(quán)利要求1所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的分子印跡聚合物的制備為按照埃博霉素B:功能單體交聯(lián)劑引發(fā)劑溶劑=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩爾比，將上述反應(yīng)原料加入到反應(yīng)容器中，在攪拌下通入氮氣20 30min ；然后在45 55°C下聚合反應(yīng)12 Mh，再在55 65°C下聚合反應(yīng) 8 12h ；聚合反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩后得到粒徑為40 60 μ m的聚合反應(yīng)物；所述的功能單體為甲基丙烯酸；所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；收集的聚合反應(yīng)物并用水充分洗滌后，然后用乙酸甲醇體積比=1 9 3 7的混合溶液浸提多次，脫去埃博霉素B，冷凍干燥后得到埃博霉素B的分子印跡聚合物。
6.如權(quán)利要求5所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或過氧化二苯甲酰；所述的溶劑為去離子水、甲醇或乙腈。
7.如權(quán)利要求5所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的搖床的轉(zhuǎn)速為 100 160r/min。
8.如權(quán)利要求1所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的纖維堆囊菌 (Sorangium cellulosum)為 ATCC15384、ATCC25569 或ATCC25531。
9.如權(quán)利要求1所述的埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的纖維堆囊菌 (Sorangium cellulosum)為經(jīng)過理化誘變、雜交、原生質(zhì)體融合或Genome shuffling改造而篩選到的高產(chǎn)菌株。
10.一種埃博霉素B的分子印跡聚合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟按照埃博霉素B:功能單體交聯(lián)劑引發(fā)劑溶劑=1 0 6) (20 30) (0.6 1) (3 20)的摩爾比，將上述反應(yīng)原料加入到反應(yīng)容器中，在保護氣氛下超聲振蕩20 30min，在攪拌下通入氮氣20 30min ；然后在45 55°C下聚合反應(yīng)12 24h,再在55 65°C下聚合反應(yīng)8 12h ；聚合反應(yīng)完成后將反應(yīng)產(chǎn)物破碎、研磨、過篩后得到粒徑為40 60 μ m的聚合反應(yīng)物；所述的功能單體為甲基丙烯酸；所述的交聯(lián)劑為乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或過氧化二苯甲酰；所述的溶劑為去離子水、甲醇或乙腈；將收集的聚合反應(yīng)物用水充分洗滌后，然后用乙酸甲醇體積比=1 9 3 7的混合溶液連續(xù)洗滌，脫去埃博霉素B，冷凍干燥后得到埃博霉素B的分子印跡聚合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種埃博霉素B的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，即提高埃博霉素B生產(chǎn)菌株纖維堆囊菌的埃博霉素B發(fā)酵產(chǎn)量的工藝。該工藝包括1)發(fā)酵過程中埃博霉素B分子印跡聚合物吸附劑的添加；2)適合纖維堆囊菌產(chǎn)生的黃豆粉、玉米淀粉等的選定；3)發(fā)酵過程中葡萄糖脈沖添加等步驟，從而使得埃博霉素B的纖維堆囊菌發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)量達到50mg/L的水平。
文檔編號C12P17/18GK102373252SQ20111034609
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者李慧, 陳松, 龔國利 申請人:陜西科技大學(xué)