專利名稱：一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物含量測(cè)定的方法，具體涉及一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法。
背景技術(shù)：
芽孢桿菌制劑是一種無(wú)毒副作用、無(wú)藥物殘留的綠色產(chǎn)品，其產(chǎn)品中含有的活菌是以內(nèi)生孢子的形式存在，是畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的飼料添加劑和水質(zhì)改良劑。然而，缺少質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是芽孢桿菌制劑在開(kāi)發(fā)研制中存在的主要問(wèn)題之一，而導(dǎo)致質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏的最大的問(wèn)題之一就是活菌數(shù)與標(biāo)簽不符，有些甚至難以檢測(cè)到活菌。因此，穩(wěn)定可靠的芽孢桿菌制劑的計(jì)數(shù)方法無(wú)疑對(duì)芽孢桿菌制劑正常生產(chǎn)及其質(zhì)量控制具有重要的意義。目前，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法等芽孢桿菌制劑的傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法由于存在一些缺陷，使計(jì)數(shù)結(jié)果不穩(wěn)定。例如，顯微鏡直接計(jì)數(shù)法無(wú)法區(qū)分死菌體和活菌體，計(jì)數(shù)結(jié)果是死菌體和活菌體的總和；平板菌落計(jì)數(shù)法操作繁雜，而且計(jì)數(shù)結(jié)果易受多種因素的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法。本發(fā)明提供的一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法，包括如下步驟1)樣品的制備無(wú)菌操作隨機(jī)稱取復(fù)合芽孢桿菌粉lg，加入盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液，設(shè)3個(gè)平行樣；2)樣品的稀釋取3個(gè)平行樣，分別進(jìn)行如下處理無(wú)菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10的稀釋母液，加入盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成 1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13稀釋度的稀釋液，每次稀釋時(shí)必須更換ImL玻璃移液管；3)培養(yǎng)將 1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀釋液置于轉(zhuǎn)速為 200r/ min、溫度為35 37°C的溫控?fù)u床中，培養(yǎng)18_24h ；以盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對(duì)照；4)測(cè)定以盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對(duì)照，無(wú)菌操作用ImL 玻璃移液管吸取0. ImL培養(yǎng)18-24h變渾濁的各稀釋液采用khaeffer-Fulton氏染色法進(jìn)行芽孢染色，顯微鏡觀察有無(wú)綠色的芽孢；顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對(duì)應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)即為復(fù)合芽孢桿菌粉的活菌含量(cfu/g)。本發(fā)明可快速、準(zhǔn)確，直接觀察測(cè)定出復(fù)合芽孢桿菌粉的活菌含量。其原理是將待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋之后，其中的芽孢桿菌充分分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中通過(guò)孵育培養(yǎng)而生長(zhǎng)繁殖，從而形成肉眼可見(jiàn)的渾濁液，再進(jìn)一步通過(guò)芽孢染色確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的芽孢，最后確定待測(cè)樣品的活菌總數(shù)。它與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相比因能夠區(qū)分死菌體和活菌體而使活菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確，與平板菌落計(jì)數(shù)法相比，操作更簡(jiǎn)單，更簡(jiǎn)易快速，更適合無(wú)很強(qiáng)專業(yè)技能的廣大芽孢桿菌制劑生產(chǎn)從業(yè)者采用。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料復(fù)合芽孢桿菌粉BCM，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的活菌含量為SXlO^cfu/g，購(gòu)于山西省衛(wèi)氏魚(yú)康實(shí)業(yè)有限公司；ImL玻璃移液管、無(wú)菌玻璃涂布棒、營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、營(yíng)養(yǎng)肉湯、 50mL具塞離心管、載玻片、5%孔雀石綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ImL玻璃移液管、盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管，于121°C條件下滅菌20min;生化培養(yǎng)箱，購(gòu)于日本三洋公司；漩渦振蕩儀，購(gòu)于上海淇特分析儀器有限公司； 溫控?fù)u床，購(gòu)于美國(guó)i^orma kientific公司。1.2樣品的制備無(wú)菌操作隨機(jī)稱取復(fù)合芽孢桿菌粉BCM 1 g，加入盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成樣品，即1 10的稀釋母液。實(shí)驗(yàn)共有3個(gè)平行樣。1.3樣品的稀釋取3個(gè)平行樣，分別進(jìn)行如下處理無(wú)菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10 的稀釋母液，加入盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U 109、 1 IO10U IO11U IO12U IO13等稀釋度的稀釋液，每次稀釋時(shí)必須更換ImL玻璃移液管。1.4 培養(yǎng)將1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 等的稀釋液置于轉(zhuǎn)速為 200r/min、 溫度為35 37°C的溫控?fù)u床中，培養(yǎng)18 Mh。以盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對(duì)照。1. 5 測(cè)定以盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對(duì)照，無(wú)菌操作用ImL玻璃移液管吸取0. ImL培養(yǎng)18 24h變渾濁的各稀釋液采用Schaeffer-Fulton氏染色法進(jìn)行芽孢染色，顯微鏡觀察有無(wú)綠色的芽孢。顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對(duì)應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)即為復(fù)合芽孢桿菌粉BCM的活菌含量(cfu/g)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，稀釋度為1 IO11的復(fù)合芽孢桿菌粉BCM在培養(yǎng) 18 24h后渾濁，而且芽孢染色后顯微鏡下可觀察到綠色的芽孢；而稀釋度分別為1 IO12 和1 IO13的復(fù)合芽孢桿菌粉BCM在培養(yǎng)18 24h后均未渾濁，而且芽孢染色后顯微鏡下也未觀察到綠色的芽孢。因此，復(fù)合芽孢桿菌粉BCM的活菌含量為IO11 1012cfu/g，與通過(guò)平板計(jì)數(shù)法測(cè)定的活菌含量相比，數(shù)量級(jí)相同，可作為復(fù)合芽孢桿菌粉BCM活菌總數(shù)快速定量的方法。表1復(fù)合芽孢桿菌粉BCM有效活菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法，其特征在于，包括如下步驟1)樣品的制備無(wú)菌操作隨機(jī)稱取復(fù)合芽孢桿菌粉lg，加入盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的 50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液；2)樣品的稀釋無(wú)菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL1 10的稀釋母液，加入盛有 9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U 1012、 1 IO13稀釋度的稀釋液；3)培養(yǎng)將1 10 的稀釋母液以及 1 IO2U IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀釋液置于轉(zhuǎn)速為 200r/min、溫度為35 37°C的溫控?fù)u床中，培養(yǎng)18-24h ；以盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對(duì)照；4)測(cè)定以盛有9mL無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的50mL具塞離心管作為對(duì)照，用ImL玻璃移液管無(wú)菌操作吸取0. ImL培養(yǎng)18-24h變渾濁的各稀釋液采用khaeffer-Fulton氏染色法進(jìn)行芽孢染色，顯微鏡觀察有無(wú)綠色的芽孢；顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對(duì)應(yīng)的稀釋度的倒數(shù)即為復(fù)合芽孢桿菌粉的活菌含量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種復(fù)合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計(jì)數(shù)方法，是將待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋之后，其中的芽孢桿菌充分分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中通過(guò)孵育培養(yǎng)而生長(zhǎng)繁殖，從而形成肉眼可見(jiàn)的渾濁液，再進(jìn)一步通過(guò)芽孢染色確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的芽孢，最后確定待測(cè)樣品的活菌總數(shù)。本發(fā)明與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法相比因能夠區(qū)分死菌體和活菌體而使活菌總數(shù)的測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確，與平板菌落計(jì)數(shù)法相比，操作更簡(jiǎn)單，更簡(jiǎn)易快速，很適合廣大芽孢桿菌制劑生產(chǎn)從業(yè)者采用。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102392070SQ201110347608
公開(kāi)日2012年3月28日 申請(qǐng)日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者何珊, 衛(wèi)若鵬, 曹海鵬 申請(qǐng)人:山西衛(wèi)氏魚(yú)康實(shí)業(yè)有限公司, 山西省生物獸藥飼料工程技術(shù)研究中心(有限公司)