專利名稱：敲低小鼠內源性CYP3A酶的shRNA分子、重組表達載體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及敲低小鼠內源性CYP3A酶的shRNA分子，還涉及含有該shRNA分子的重組表達載體和該重組表達載體的構建方法，也涉及shRNA分子在敲低哺乳動物細胞 CYP3A酶中的應用。
背景技術：
小鼠是在藥代動力學和藥效學研究中廣泛應用的重要模式動物，是藥物研發(fā)的重要工具。細胞色素P450酶(Cytochromosome P450，CYP)活性的種間差異是導致藥物代謝與藥物效應指標不能完全從小鼠等模式動物直接類推到人體的重要原因。通過轉基因技術在動物體內表達人CYP酶是克服CYP酶種間差異最直接的手段，但是由于動物內源性CYP酶在組織分布、底物譜、酶活性等方面往往與人體同源酶具備廣泛的重疊，導致轉入的人CYP 酶的活性與功能無法得到充分的體現。因此，在內源性CYP酶表達缺失的動物中轉入人CYP 酶是克服CYP酶種間差異、研究人CYP酶對特定藥物代謝與效應影響的最適途徑。常規(guī)的基于ES細胞DNA同源重組的基因敲出技術可封閉小鼠內源性CYP酶的表達，但該技術周期長、效率低、成本高，且由于小鼠CYP酶超家族由多個亞家族、數十個成員組成，因此通過常規(guī)的基因敲出技術同時封閉多個CYP酶亞家族或多個成員基因表達難道極大?；趕hRNA 分子的RNA干擾技術為封閉小鼠內源性CYP酶表達提供更簡便、低成本的新途徑。該技術通過在動物體內表達針對靶基因的shRNA分子即可有效封閉靶基因的表達，無需依賴于基于 ES細胞的DNA同源重組。由于同一CYP亞家族成員基因的編碼序列之間具備較高的同源性， 為通過RNA干擾技術同時封閉多個CYP基因表達提供了方便。3A亞家族P450酶(CYP3A) 是人類藥物代謝關鍵酶，參與了 50%以上臨床用藥的I相代謝，因此特異性封閉或消除小鼠內源性CYP3A表達是構建CYP酶人源化轉基因動物模型的首要任務。CYP3A11、CYP3A41和 CYP3A44是CYP3A亞家族的多肽成員，在小鼠肝內微粒體中優(yōu)勢表達的基因，是參與藥物代謝的主要成員。本發(fā)明通過分子設計，設計了可同時封閉小鼠CYP3A11、CYP3A41和CYP3A44 等三個小鼠CYP3A亞家族重要成員基因表達的shNA分子，以封閉小鼠內源性CYP3A基因表達，為建立CYP3A酶人源化轉基因小鼠模型、研究人CYP3A酶功能提供工具。

發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明目的之一在于提供小鼠內源性CYP3A酶的shRNA分子，所述 shRNA分子核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。本發(fā)明目的之二在于提供敲低小鼠內源性CYP3A酶shRNA分子的重組表達載體， 所述重組表達載體含有所述shRNA分子的編碼序列，所述shRNA分子的編碼序列如SEQ ID No. 5所示，表達載體為慢病毒表達載體pPRIME-CMV-GFP-FF3。本發(fā)明目的之三在于提供重組表達載體制備的方法，制備所述shRNA分子的編碼序列，然后插入慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3，得重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。進一步，所述制備shRNA分子的編碼序列，具體步驟為以人工合成如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列分別為上、下游引物，進行PCR擴增，PCR擴增條件為95°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，66°C退火30秒， 72°C延長40秒，30個循環(huán)；最后72°C延長8分鐘，得shRNA分子的編碼序列。進一步，所述重組表達載體的制備方法，具體步驟為
將所述制備shRNA分子編碼序列用BioI和EcoRI酶切，同時用BioI和EcoRI酶切所述慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收酶切的shRNA分子的編碼序列和慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3骨架，然后將回收的shRNA分子的編碼序列與慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3骨架在"Γ4 DNA酶作用下16°C連接，得重組表達載體 pRIME-CMV-eGFP-mi R-shRNA。本發(fā)明目的之四在于提供所述重組表達載體制備慢病毒顆粒，其特征在于所述慢病毒顆粒含有重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。本發(fā)明目的之五在于提供所述shRNA分子在敲低哺乳動物細胞CYP3A酶中的應用。進一步，所述CYP3A 酶為 CYP3A11 酶、CYP3A41 酶或 CYP3A44 酶。進一步，所述哺乳動物細胞為小鼠肝細胞。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明成功的獲得了敲低小鼠內源性CYP3A酶的shRNA 分子的核苷酸序列，為后期制備表達該shRNA分子的重組表達載體提供了必要的基礎；利用該shRNA分子的核苷酸序列成功構建了重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA，并將該重組表達載體包裝為慢病毒顆粒；通過慢病毒顆粒轉染小鼠受精卵，成功獲得了在體內表達shRNA分子的轉基因小鼠，在轉基因小鼠體內，有效地降低了 CYP3A基因mRNA 的表達量80%，小鼠內源性總CYP3A蛋白含量減低70%左右，同時小鼠CYP3A酶總體活性降低了 80%左右；因此，本發(fā)明公開的小鼠內源性CYP3A酶shRNA分子、重組表達載體 pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA和轉基因小鼠能夠用于建立人CYP酶轉基因小鼠模型，應用于藥物研發(fā)中，使模式動物小鼠中的藥物效應指標更接近人類，具有該技術周期短、效率高、 成本低的優(yōu)點。


圖 1 為 RT-PCR 檢測結果(1 :DNA markerCffide Range DNA Maker, 500-12000bp)； 2 未處理原代肝細胞；3 無shRNA分子表達原代肝細胞；4 表達的shRNA分子的原代肝細胞)；
圖2為本發(fā)明shRNA分子表達于小鼠原代肝細胞后靶基因表達RT-PCR檢測； 圖3為體內表達shRNA分子轉基因首建小鼠中CYP3A蛋白表達的flfestern blot檢測 (WT-F 雌性正常小鼠；WT-M 雄性正常小鼠；1-4 體內表達shRNA分子的轉基因首建小鼠個體)；
圖4為本發(fā)明shRNA分子表達于小鼠體內后肝臟CYP3A總蛋白含量； 圖5為本發(fā)明不同世代的體內表達shRNA分子轉基因小鼠CYP3A蛋白^festern blot 檢測(WT-1 雌性正常小鼠；WT-2雄性正常小鼠；Fl-I =Fl代雌性轉基因小鼠；Fl-2 =Fl代雄性轉基因小鼠；F2-1 :F2代雌性轉基因小鼠；F2-2 :F2代雄性轉基因小鼠；F3_l :F3代雌性轉基因小鼠；F3-2 :F3代雄性轉基因小鼠)；
圖6為本發(fā)明shRNA分子表達于小鼠體內后肝臟CYP3A酶活性檢測。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1
制備shRNA分子的編碼序列
小鼠內源性CYP3A11、CYP3A41和CYP3A44基因的mRNA具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的同源區(qū)，序列為5，-auuaagaaugugcuagugaag-3，，因此SEQ ID No. 1所示序列可以作為shRNA分子抑制CYP3A的靶序列。人工合成抑制小鼠內源性CYP3A表達的shRNA分子的編碼序列，如 SEQ ID No. 2 所示核苷酸序列5，-tgctgttgacagtgagcgaattaagaatgtgc taRtRaaRtaRtRaaRccacaRatRtacttcactaRcacattcttaatctRcctactRcctcRRa-3，，其中 _ 線部分為本發(fā)明設計的shRNA分子的編碼序列，非劃線部分分別為上下游引物結合位點。并根據此序列設計擴增該序列的引物，上游引物為5’ -gatggctgctcgagaaggtatattgctgttgac aRtRaRCR-3' (SEQ ID No. 3)，其中劃線部分分別為上游引物結合位點，上游引物引入)(h0I 酶切位點下游引物為 5’-gtctagaggaattccgaggcagtaggca_3’ (SEQ ID No. 4)，其中劃線部分分別為下游引物結合位點，下游引物引入EcoRI酶切位點。以人工合成如SEQ ID No. 2 所示序列為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列為引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為95°C預變性5分鐘；94°C變性30秒，66 °C退火30秒，72°C延長40秒，30個循環(huán)； 最后72°C延長8分鐘，得shRNA分子的編碼序列。構建表達shRNA分子的重組表達載體
將所得shRNA分子的編碼序列用限制性內切酶BioI和EcoRI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收shRNA分子的編碼片段。同時用限制性內切酶BioI和EcoRI雙酶切慢病毒表達載體pPRIME-CMV-GFP-FF3(Addgen Inc, Cat No. 11663)，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3骨架片段。將回收的shRNA分子的編碼序列與慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3，連接反應在T4 DNA連接酶作用下16 °C過夜連接，獲得重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA，該重組載體能夠在宿主內能表達shRNA分子， ^lJ % 3' -aauuaagaaugugcuagugaaguagugaagccacagauguacuucacuagcacauucuuaauc-5' (SEQ ID No. 5)。該shRNA分子的兩端具有23bp的反向重復序列，因此能夠形成帶頸環(huán)的發(fā)夾結構，同時干擾小鼠內源性CYP3A11、CYP3A41和CYP3A44基因的表達。重組表達載體的包裝
在IOcm培養(yǎng)皿中鋪2 3 X IO6的細胞，培養(yǎng)一天后細胞生長達60%_70%匯合；將 6 μ g pMD2. G 質粒、15 μ g psPAX2 質粒和 20 μ g pRIME-CMV-eGFP-mi R-shRNA 重組表達載體混勻于無菌去離子水中至終體積1095 μ L ；然后加入155 μ L 2Μ的CaCl2,并滴加1250 μ L 2XHBS，邊滴加邊混勻，滴加完畢后靜置1-2分鐘，待磷酸鈣沉淀形成；將處理后的混合液輕輕滴加到培養(yǎng)的細胞的IOcm培養(yǎng)皿，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)疒11小時后，吸去上清，加入IOmL新鮮的含10%胎牛牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；然后收集上清，IOOOrpm離心10 分鐘，濾膜孔徑為0. 45 μ m的濾器過濾；將濾液(含重組慢病毒)以20000g離心6小時，棄去上清，用HBSS重懸沉淀；將重懸液置于含有20%蔗糖的HBSS溶液上，50000g離心2小時， 棄去上清；用適量HBSS重懸沉淀(使滴度> IXlO9 TU/mL)，得包裝的慢病毒顆粒。將制備的慢病毒顆粒按每管15 μ L分裝，-80°C保存?zhèn)溆?。?2孔板中每孔接種5 X IO4的細胞，在接種有細胞的6孔板中每孔分別加入稀釋1000倍的病毒液2μ L、5y L、10y L、100y L、200y L、500y L，感染48小時后， 用流式細胞計分析綠色熒光細胞的百分比，取綠色熒光細胞百分比在20%以下的計算滴度 (單位為TU/mL)。實施例2
敲低體外培養(yǎng)原代小鼠肝細胞中CYP3A基因的表達 (1)原代肝細胞的培養(yǎng)
將4周齡的FVB/N小鼠引頸處死后于含有75%酒精的大燒杯中浸洗10秒；然后用眼科剪剪開小鼠腹部，迅速取出肝臟并將其放入裝有4°C的含雙抗的D-Hanks液中進行漂洗 2次，之后在培養(yǎng)皿中用眼科剪子將鼠肝組織剪成Imm3左右的小塊，放入試管中，用吸管吹打，待組織沉淀后吸出上清，如此反復3次，最后一次清洗后，將試管放入離心機SOOrpm 離心4分鐘；將離心后的試管取出后棄上清，加入10倍肝組織體積的胰蛋白酶濃1. Og/L、 37°C消化液消化10-20分鐘左右，每隔5分鐘振蕩一次，使細胞分離；消化后用顯微鏡觀察肝組織是否完全消化，消化完全者立即用3-5mL RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)終止消化，用吸管反復吹打使肝組織細胞散開；將消化完全的懸液經200目不銹鋼網過濾到培養(yǎng)皿中，之后將過濾后的懸液裝到一個5mL離心管中，并向過濾后的懸液中加入RPMI1640 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)至5mL，于4°C冰箱中靜置20min，然后用吸管棄除懸液；再加入 RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)至5mL，以IOOOrpm分離心4分鐘，棄上清，重復3次操作；最后離心完后再加入2mL含10%新生牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，收集肝細胞于培養(yǎng)瓶中，進行臺盼藍活細胞計數；最后加入相同的完全培養(yǎng)基，調整細胞密度至5 X IOVmL,于 37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)10小時后首次換液，以后每48小時換液一次并依次降低胎牛血清含量，每次降低1%直至胎牛血清含量1% ；單層培養(yǎng)細胞相互匯合，培養(yǎng)瓶底被細胞覆蓋，因此用0. 25%胰酶和0. 02% EDTA的混合液消化細胞，并進行傳代。(2)慢病毒感染
將包裝成功的慢病毒懸液加入肝細胞細胞培養(yǎng)瓶，混合均勻，感染復數(Μ0Ι)> 10。感染后，通過流式細胞分選，獲得由綠色熒光蛋白突變系(eGFP)表達、感染成功的陽性細胞。(3)通過RT-PCR檢測基因表達
取200個左右生長狀態(tài)良好的FVB/N小鼠肝細胞，使用RNA提取反轉試劑盒 (CellAmp Whole Transcriptome Amplification Kit)，從細胞直接提取反轉錄的 FVB/ N 小鼠肝細胞 cDNA。根據報道的 CYP3A11 (GenBank :NM_007818)、CYP3A41 (GenBank AB033414. 1)和CYP3A44 (GenBank :NM_177380)基因同源序列設計CYP3A檢測引物，上游引物為CYP3A-F 5，-ctcaatggtgtgtatatcccc-3’ (SEQ ID No. 6)，下游引物為CYP3A-R 5，-gatgttcttagacactgcc-3，(SEQ ID No. 7)，以 RpslS 基因(GenBank :NC_000083)為內參基因，設計內參引物，上游引物為Rps_F 5，-aaatagccttcgccatcac-3’ (SEQ ID No. 8)，下游引物為Rps-R 5，-tcactcgctccacctcatc-3，(SEQ ID No. 9)。將提取得到的 cDNA 稀釋 10倍后，各取2μ L cDNA作為模板，分別以SEQ ID No. 5與SEQ ID No. 6所示序列為CYP3A 檢測引物和以SEQ ID No. 7與SEQ ID No. 8所示序列為Rpsl8基因檢測引物，配成25 μ L 的反應體系進行PCR擴增；PCR反應條件為95°C預變性5分鐘，1個循環(huán)；94°C變性30秒， 54°C退火30秒，72°C延長40秒，30個循環(huán)，最后72°C延長8分鐘，迅速冷卻。反應完成后， 將25uL反應液，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；電泳后瓊脂糖凝膠紫外分析儀下觀察瓊脂糖凝膠后并照相，使用Bio-Rad公司Quantity One軟件分析各樣本CYP3A的灰度值與其對應的 RpslS的灰度值，以未處理原代肝細胞處理和轉染未成功的原代肝細胞為對照，以轉染成功的原代肝細胞為實驗組，結果如附圖1所示，在轉染成功的肝細胞中CYP3A mRNA表達量降低，表明重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA轉染后能夠成功降低小鼠內源性CYP3A 基因的表達。如附圖2所示轉染成功的原代肝細胞CYP3A基因的mRNA表達量降低了 80% 以上。實施例3
小鼠體內敲低CYP3A基因表達
(1)建立交配公鼠群體和結扎公鼠群體
取40只雄性較強的FVB/N公鼠作為種公鼠，單籠飼養(yǎng)至6 8周齡，然后將40只公鼠分別與1只母鼠合籠飼養(yǎng)2周，然后取出母鼠，以增強公鼠的雄性；然后將公鼠用0. 5%戊巴比妥鈉按0. 8mg/10g腹腔注射麻醉，找到左右兩側的輸精管后，用燒紅的鐘表鑷將其灼斷將輸精管進行結扎，然后送回腹腔，在切口內撒入少量青/鏈霉素，分別縫合肌肉層和皮膚腹部橫切口 ；蘇醒后單籠飼養(yǎng)2周，待其恢復活力，然后分別放入1只發(fā)情母鼠，3周后母鼠沒有受孕說明結扎成功。(2)母鼠超數排卵
取4-6周齡的性成熟母鼠為胚胎供體，首日14:00左右腹腔注射孕馬血清促性腺激素 (PMSG)，每只注射量為5-10 IU, 48小時后注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)，每只注射量為 5-10 IU，獲得超排母鼠；將獲得的超排母鼠與雄性較強的正常的FVB/N種公鼠1 :1合籠、交配；次日清晨檢查母鼠是否有陰栓，有陰栓者作為胚胎供體；當日15 :00左右選取發(fā)情雌性 KM鼠與結扎雄鼠合籠1 :1合籠、交配。(3)小鼠胚胎的獲取與培養(yǎng)
胚胎培養(yǎng)液在一次性培養(yǎng)皿內做成液滴，放入于5% CO2、37°C、飽和濕度條件下平衡PH 值；9 30左右選取有陰栓的供體采用頸部脫白法處死供體母鼠，用于取胚；處死的供體母鼠用75%酒精噴濕小鼠背部消毒，在小鼠背脊靠近最后一根肋骨旁側約1 cm處剪開皮膚， 分離肌肉，暴露卵巢及輸卵管；小心剪下輸卵管，立即置于一大滴(約100 yL)M-2培養(yǎng)基里涮洗；涮洗后的輸卵管轉移至另一滴，約100yLM-2培養(yǎng)基里，于解剖顯微鏡下將膨大的輸卵管壺腹部用顯微鑷輕輕撕開，輕壓膨大部位擠出包裹著胚胎的細胞團；然后加入50 μ L 600 μ g/ml透明質酸酶于M-2液滴混勻，用移液槍輕輕吹吸加速細胞團分散；在解剖顯微鏡下將已游離的胚胎細胞撿出，M-2培養(yǎng)液滴中洗5-7遍，以去除透明質酸酶、組織碎片以及卵丘細胞；將洗凈的胚胎細胞置于覆蓋有石蠟油的M-16微滴(約50yL)中暫時培養(yǎng)， 同時進行顯微注射準備工作。(4)顯微注射取胚操作完成后，用10 μ L Μ-2培養(yǎng)液在凹玻片上制備一扁平的液滴，覆上石蠟油，并置于CO2培養(yǎng)箱中平衡PH值；注射前解凍制備的含shRNA分子的慢病毒懸液，并于4°C、 12000rpm離心1分鐘；用微量上樣器從注射針尾端將病毒懸液導入顯微注射；將顯微注射針與顯微注射儀(Narishega，MI-9B)相連，將約80pl病毒懸液導入小鼠1_細胞胚胎卵周隙；注射第二天觀察胚胎發(fā)育情況，選出發(fā)育正常的2-cell胚胎進行移植。(5)胚胎移植
顯微注射次日清晨挑選發(fā)育良好的2-cell胚胎，按30枚一組分別放入獨立的M-2液滴；同時將有陰栓的假孕KM鼠用腹腔注射麻醉，按體重給受體母鼠注射0.4 0.6 mL 0. 5% 戊巴比妥鈉溶液，用取胚的方法暴露卵巢、輸卵管及部分子宮，盡量避免出血；移植采用輸卵管壺腹部穿刺移植法。找到膨大的輸卵管壺腹部，用顯微膜狀剪于壺腹部靠近卵巢一端的最后一個回折處剪一斜向切口，切口朝子宮方向；將發(fā)育良好的2-cell胚胎吸入移卵針細長端，吸入順序為M-2段一氣泡一含胚胎的M-2段一氣泡一M-2段，盡量將胚胎排列緊密以減少培養(yǎng)液的吸入量；將攜帶有胚胎的移卵針沿切口插入壺腹部，將把含有胚胎的M-2 段吹入壺腹部，見第2個氣泡進入壺腹部則表明胚胎已全部進入正確位置，氣泡可防止胚胎從切口處漏出；移植完畢，分別縫合腹壁和皮膚，縫線用0號絲線減少對受體的影響；移入鼠籠，用40W臺燈照射保溫，標簽注明移植胚胎數量、日期和術者。待其蘇醒后關掉臺燈； 隨時觀察受體受孕情況，作好記錄。(6)轉基因小鼠的篩選
通過活體熒光觀察篩選出體內表達shRNA分子的轉基因小鼠激發(fā)光波長460nm ；濾光片波長515nm。實施例4 (1)通過Western blot檢測小鼠體內CYP3A蛋白表達
采用Total protein Extraction Kit提取蛋白，具體步驟為，先用剪刀剪取約0. 5mg 組織，置于組織勻漿器中，加入ImL總蛋白提取液，勻漿5 20分鐘直到組織充分破碎，然后冰上放置1(Γ20分鐘，再勻漿5 20分鐘，將勻漿液吸出放到1. 5mL離心管中；將勻漿液超聲 3次，每次3s ；然后9000rpm，離心10分鐘，取適量上清置于新的1. 5mL離心管中，即制得轉基因小鼠總蛋白，于-20V凍存。將制備轉基因小鼠總蛋白為抗原與5 X loading buffer體積比為5 :1，混勻，然后100°C中加熱3分鐘以使蛋白質變性；將變性蛋白上樣至配制好的 SDS-PAGE膠中，濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為9%，上樣量為25μ ，電壓200V進行電泳，待溴酚藍遷移到分離膠底部0. 5cm處，結束電泳；最后將凝膠從電泳裝置上剝離，用去離子水沖洗干凈，準備進行免疫印操作。(2)免疫印跡操作_轉膜
將凝膠置于盛有電泳轉移緩沖液的容器中，浸泡20分鐘，然后裁剪濾紙(Whatman，3MM CHR)和電轉膜，濾紙和膜裁剪為83mmX 75mm大小，盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉移緩沖液中，驅除留于膜上的氣泡；打開轉移盒并放置淺盤中，用轉移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的裁剪好的濾紙；小心將凝膠放置于濾紙上，避免氣泡，(裝膜)用去離子水清洗緩沖液槽，在緩沖液槽中放入攪拌子，將另一塊海綿用轉移緩沖液浸透后放在凝膠-膜“三明治”上，關上轉移盒并插入轉移槽；將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4°C預冷的轉移緩沖液；將整個裝置放在磁力攪拌器上并開始攪拌，連接好轉移電極恒流300mA轉移70分鐘；電轉完畢后，將電轉膜置于5% 的脫脂奶粉(PBS配制)中封閉，37°C 2小時。(3)免疫檢測
封閉的膜用PBST漂洗3次；將加樣槽洗滌干凈，用蒸餾水潤洗，晾干，并置于加樣槽中， 作好標記，加入一抗羊抗小鼠CYP3A蛋白抗體(Santa，sc-30621)約ImL ；室溫下于搖床孵育2小時；棄去一抗 ，膜條仍置于加樣槽，每個槽加3mL PBST,上搖床洗滌10分鐘，換液，重復4次洗滌換液操作。根據實驗需要和設計兔抗羊IgG辣根過氧化物酶標記(IgG/HRP)為二抗，每個加樣槽中加入二抗ImL在室溫25°C下于搖床孵育1小時，注意保證膜的所有部分同溶液接觸； 棄去二抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽加3 mL PBST，上搖床洗滌10分鐘，換液，重復洗滌換液4次。將膜風干，貼在玻璃紙上，加底物鄰苯二胺(OPD)，實現化學發(fā)光，之后在暗室條件下，將膜緊貼于感光底片(Kordak)，置于暗盒中，得到感光后膠片。將背景較高的底片片放入PIERCE公司X光片背景去除液中，觀察到理想的結果時，終止反應，用水清洗以去除不需要的背景；在完成化學發(fā)光檢測后，將蛋白轉印膜置IXPBS中漂洗5分鐘；然后棄去 IXPBS,加入適量的WB膜再生液Renewable Buffer,至少需把膜完全覆蓋，在搖床上漂洗 45分鐘；棄WB膜再生液，加入IXPBS在搖床上漂洗5分鐘后，棄去1XPBS，重復3次洗滌步驟；最后進行封閉。CYP3A蛋白表達的Western blot檢測結果如附圖3所示，顯示在shRNA分子的轉基因首建小鼠個體中CYP3A蛋白表達量低于雌性正常小鼠和雄性正常小鼠，而shRNA分子的轉基因首建小鼠個體中內參蛋白GAPDH與雌性正常小鼠和雄性正常小鼠表達量一致。如附圖4所示，表明shRNA分子的轉基因首建小鼠個體中CYP3A蛋白表達量降低了 70%左右。 并對不同世代的體內表達shRNA分子轉基因小鼠CYP3A蛋白Western blot檢測，結果如附圖5所示，在Fl代雌性轉基因小鼠、Fl代雄性轉基因小鼠、F2代雌性轉基因小鼠、F2代雄性轉基因小鼠、F3代雌性轉基因小鼠和F3代雄性轉基因小鼠中CYP3A蛋白表達量均比雌性正常小鼠和雄性正常小鼠的CYP3A蛋白表達量低。實施例5
小鼠體內CYP3A活性檢測
通過在小鼠肝微粒體懸液中加入CYP3A酶的典型代謝底物6-β-羥基睪酮作為探針底物，通過高效液相色譜(HPLC)檢測睪酮的氧化代謝產物6-β-羥基睪酮 (6-β -hydroxyl-testestorone)的濃度測定CYP3A活性。采用梯度離心法制備小鼠微粒體；取小鼠肝微粒體適量，用新鮮配制的NADPH再生系統，稀釋至lmg/mL的混懸液。取此混懸液0. 2mL,加一定濃度睪酮DMSO溶液，混勻使其終濃度為100. 0 μ mol/L，置于37°C水浴搖床中，預孵5分鐘，然后加入3 μ L β -NADP/ β -NADPH的1% NaHCO3溶液(臨用新配，置冰浴中，終濃度分別為0. 25mmol/L和0. lmmol/L)，啟動反應，37°C下孵育30分鐘后，加0. 2mL 冰冷的乙腈(預先置冰浴)旋渦提取2分鐘，lOOOOrpm/min離心10分鐘，上清液用于高效液相色譜(HPLC)分析。HPLC分析條件為色譜柱Agilent Zorbax SB C18 (250mmX 4. 6mm i. d.，5μπι ;Agilent Technologies Inc. , DE，USA)，C18預柱(10mmX5mm i. d.)；流動相 CH3OH / H2O (68:32, v/v)；進樣量50 μ ；檢測波長245 nm;流速1 mL/分鐘；柱溫為 30°C，在上述色譜條件下測得6-β-羥基睪酮的保留時間約為4. 1分鐘。HPLC分析結果如附圖6 所示，同品系野生型小鼠和表達無關shRNA分子的小鼠為對照，表達本發(fā)明提供的shRNA分子的轉基因小鼠為實驗組，表明在表達本發(fā)明提供的shRNA分子的轉基因小鼠中CYP3A酶活性與野生型小鼠和表達無關shRNA分子的小鼠相比降低了 80%左右。
最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍
權利要求
1.敲低小鼠內源性CYP3A酶ShRNA分子，其特征在于所述shRNA分子的核苷酸序列如 SEQ ID No. 6 所示。
2.權利要求1所述敲低小鼠內源性CYP3A酶shRNA分子的重組表達載體，其特征在于 所述重組表達載體含有所述shRNA分子的編碼序列，所述shRNA分子的編碼序列如SEQ ID No. 5所示，表達載體為慢病毒表達載體pPRIME-CMV-GFP-FF3。
3.權利要求2所述重組表達載體的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟制備所述shRNA分子的編碼序列，然后插入慢病毒表達載體pPRIME-CMV-GFP-FF3，得重組表達載體 pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。
4.根據權利要求3所述重組表達載體的制備方法，其特征在于，制備所述shRNA分子的編碼序列，具體步驟為以人工合成的如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列為模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列分別為上、下游引物，進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C 預變性5分鐘；94°C變性30秒，66°C退火30秒，72°C延長40秒，30個循環(huán)；最后72°C延長 8分鐘，得所述shRNA分子的編碼序列。
5.根據權利要求4所述重組表達載體的制備方法，其特征在于，所述重組表達載體的制備方法，具體步驟為將制備的所述shRNA分子的編碼序列用限制性內切酶BioI和EcoRI雙酶切，同時用限制性內切酶》ιο I和EcoRI雙酶切所述慢病毒表達載體pPRIME-CMV-GFP-FF3， 經瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收酶切編碼所述shRNA分子的核苷酸序列和所述慢病毒表達載體pPRIME-CMV-GFP-FF3骨架，然后將回收所述shRNA分子的編碼序列與所述慢病毒表達載體PPRIME-CMV-GFP-FF3骨架在T4 DNA酶作用下16 °C連接，得重組表達載體 pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA。
6.權利要求2所述重組表達載體制備的慢病毒顆粒，其特征在于所述慢病毒顆粒含有所述重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-mi R-shRNA。
7.權利要求1所述shRNA分子在敲低哺乳動物細胞CYP3A酶中的應用。
8.根據權利要求7所述shRNA分子在敲低哺乳動物細胞CYP3A酶中的應用，其特征在于，所述 CYP3A 酶為 CYP3A11 酶、CYP3A41 酶和 CYP3A44 酶。
9.根據權利要求8所述shRNA分子在敲低哺乳動物細胞CYP3A酶中的應用，其特征在于所述哺乳動物細胞為小鼠肝細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了敲低小鼠內源性CYP3A酶的shRNA分子，其核苷酸序列如SEQIDNo.6所示，還公開了含有該shRNA分子的重組表達載體pRIME-CMV-eGFP-miR-shRNA以及該載體的制備方法，還公開了該shRNA分子在敲低小鼠內源性CYP3A酶中的應用，本發(fā)明制備的轉基因小鼠中有效的封閉小鼠內源性CYP3A基因表達，利用本發(fā)明建立了敲低小鼠內源性CYP3A酶的轉基因小鼠模型，在小鼠模型中表達人CYP酶，可以應用于藥物研發(fā)中，使小鼠中藥物效應指標更接近人類。
文檔編號C12N15/66GK102443584SQ20111035014
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權日2011年11月8日
發(fā)明者劉勤, 劉昌峨, 周曉楊, 龐浩, 王勇, 王露露, 魏泓 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學