專利名稱：一種非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法
技術領域：
本發(fā)明涉及細胞、組織工程等領域，是一種非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法。
背景技術：
細胞共培養(yǎng)是通過一些特殊的培養(yǎng)技術所建立的體外培養(yǎng)方法，它可以最大程度地在體外模擬體內組織環(huán)境、維持多種細胞在體內的性狀，觀察細胞之間相互作用，調控細胞的行為。由于它保留了體內組織微環(huán)境的結構和作用基礎，又體現(xiàn)了體外培養(yǎng)條件的可控性，因此是組織工程研究的熱點，在科研以及臨床等領域具有廣闊的研究和應用前景。實現(xiàn)細胞共培養(yǎng)的方法主要有直接接觸共培養(yǎng)和非接觸共培養(yǎng)。直接接觸共培養(yǎng)是將不同類型 的細胞在同一個培養(yǎng)體系中混合在一起進行共同培養(yǎng)，不同類型的細胞發(fā)生直接接觸，不能徹底分開，因此存在著細胞分離純化困難、免疫安全性差、容易引起病毒傳播等問題，不適合臨床應用。非接觸共培養(yǎng)是使用半透膜等起分隔作用的薄膜將兩種細胞分隔開進行共培養(yǎng)，起到隔離作用的分隔薄膜允許細胞分泌的生長因子自由交換，同時將不同類型的細胞進行了免疫隔離，有利于細胞分離，提高了安全性。由于非接觸共培養(yǎng)體系中不同類型細胞間的相互作用是通過可溶性生長因子介導的，因此非接觸共培養(yǎng)體系中分隔薄膜截留分子量影響了不同分子量的可溶性因子通過分隔薄膜的擴散情況，截留分子量較大，較多種類的小分子量可溶性因子可以自由交換；截留分子量較小，較多種類的大分子量的因子則不能透過分隔薄膜。因此，分隔薄膜截留分子量的變化改變了共培養(yǎng)體系中起介導作用的可溶性因子的種類和分布，從而調控了不同類型細胞之間的相互作用。另外，細胞在體內組織中是以三維狀態(tài)生長的，研究表明傳統(tǒng)的體外二維培養(yǎng)條件下的細胞不能真實反映體內細胞的形態(tài)、功能等特點，由此可知，需要發(fā)展可實現(xiàn)多種細胞三維非接觸共培養(yǎng)的有效方法來調控共培養(yǎng)中目的細胞的多種行為。然而，目前非接觸共培養(yǎng)的常用方法是使用transwell小室，這種培養(yǎng)方法存在明顯的缺點:1)價格昂貴，實驗成本增加；2)只能實現(xiàn)細胞在二維條件下的共培養(yǎng)；3)不能控制膜的截留分子量；4) transwell體系基于24孔板或6孔板，不容易擴大規(guī)模。由于現(xiàn)有細胞共培養(yǎng)方法存在缺陷，限制了細胞共培養(yǎng)研究的發(fā)展，因此急需研發(fā)一種便捷實用的非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法，從而實現(xiàn)調控共培養(yǎng)體系中目的細胞的多種行為。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:在培養(yǎng)容器中依次制備 海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層，即形成三明治式復合凝膠；在制備海藻酸鈣凝膠層過程中，將二種不同的細胞分別三維生長在復合凝膠中截留分子量可控的殼聚糖膜兩側的海藻酸鈣凝膠層中，并于培養(yǎng)容器中添加培養(yǎng)液，從而實現(xiàn)在同一個培養(yǎng)體系中，兩種不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)；或，在培養(yǎng)容器中依次制備海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層，即形成五層的三明治式復合凝膠；在制備海藻酸鈣凝膠層過程中，將二種或三種不同的細胞分別三維生長在復合凝膠中截留分子量可控的殼聚糖膜兩側的海藻酸鈣凝膠層中，并于培養(yǎng)容器中添加培養(yǎng)液，從而實現(xiàn)在同一個培養(yǎng)體系中，三種不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)，進而調控共培養(yǎng)體系中目的細胞的增殖、分化等行為。所述三明治式復合凝膠為由海藻酸鈉和殼聚糖所制備，可支持兩種或三種細胞三維共培養(yǎng)；其中，海藻酸鈉分子量范圍為IOO-1OOOkDa,古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范圍為0.2-3 ;殼聚糖分子量范圍為2-200kDa，脫乙酰度范圍為50-100%。所述截留分子量可控的殼聚糖膜為通過改變海藻酸鈉或殼聚糖的分子量、濃度或作用時間來改變殼聚糖膜的截留分子量；所述海藻酸鈉和殼聚糖為經過細胞外基質主要成分(膠原、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、聚糖)來源的多肽化學修飾的改性海藻酸鈉和殼聚糖。多肽包括精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)、蘇氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-色氨酸-絲氨酸_谷酰胺(TTSWSQ)、纟顏氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸_天冬酰胺_苯丙氨酸_纟顏氨酸_売氨酸-賴氨酸(VFDNFVLK)、蘇氨酸-谷氨酸-天冬酰胺(TEN)；所述三維共培養(yǎng)為靜態(tài)或者動態(tài)條件下的細胞三維共培養(yǎng)。所述不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)為存在可能相互影響的二種或三種不同種類的細胞在復合凝膠中的三維共培養(yǎng)。所述二種或三種不同種類的細胞包括下述組合之一，多來源干細胞和多來源體細胞之間、多來源體細胞自 身之間、以及多來源干細胞或體細胞和轉基因細胞或細胞株之間的共培養(yǎng)。其中，多來源干細胞，包括胚胎干細胞或成體干細胞；多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細胞；轉基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質或標志物的克隆化細胞群。所述兩種或三種不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)，進而調控共培養(yǎng)體系中目的細胞的增殖、分化等行為(圖1)。所述共培養(yǎng)體系中細胞的增殖、定向分化等行為指共培養(yǎng)體系中細胞出現(xiàn)的增殖、分化、遷移、組織化、或凋亡的行為。所述培養(yǎng)容器中為培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:1.操作簡單，成本低，本發(fā)明利用復合凝膠作為細胞三維共培養(yǎng)的載體，容易制備，避免使用昂貴材料和工藝；2.復合凝膠中的海藻酸鈣凝膠層給內部細胞提供了三維生長環(huán)境，且多種細胞三維共培養(yǎng)最大限度模擬了細胞在體內的真實生存狀態(tài)；2.復合凝膠中間的殼聚糖膜的截留分子量可以改變，以調控不同類型細胞分泌的不同分子量可溶性因子的種類和分布，達到控制細胞間相互作用的目的；
3.殼聚糖膜可使營養(yǎng)物質、代謝產物以及細胞分泌的可溶性因子等進行交換，同時又能將不同類型的細胞進行免疫隔離，不直接接觸，有利于不同類型細胞的分離和收獲，更好地保證了生物安全性；4.本發(fā)明不但在常規(guī)靜態(tài)培養(yǎng)下能實現(xiàn)對細胞行為的調控，還可以應用到動態(tài)共培養(yǎng)體系中，利于規(guī)?；糯?；5.應用范圍廣，本發(fā)明方法可適用于多來源細胞(干細胞、體細胞、轉基因細胞以及細胞株等)之間進行共培養(yǎng)，可應用于控制細胞在三維條件下的增殖、分化、遷移、組織化、凋亡等多種行為。


圖1為非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法的示意圖:圖中培養(yǎng)孔1，培養(yǎng)液2，海藻酸鈣凝膠層3，細胞類型一 4，海藻酸鈣凝膠層5，細胞類型二 6，殼聚糖膜層7 ；圖2為三維共培養(yǎng)體系中骨髓間充質干細胞和血管內皮細胞分別在海藻酸鈣凝膠層中的電鏡照片(X 1000，Day 2): (A)骨髓間充質干細胞；(B)血管內皮細胞；圖3為三維共培養(yǎng)體系中被誘導細胞胞內堿性磷酸酶活性和骨鈣素合成(Day7): (A)堿性磷酸酶活性；(B)骨鈣素合成；圖4為初始接種時以及二維和三維共培養(yǎng)條件下腎上皮細胞的活性照片(Xioo):(A)初始接種細胞(Day O) ； (B) 二維共培養(yǎng)(Day 14) ； (C)三維共培養(yǎng)(Day14)；圖5為初始接種時(Day O)以及二維和三維共培養(yǎng)(Day 14)條件下腎上皮細胞凋亡和死亡比例:⑷；細胞凋亡比例⑶；細胞死亡比例。
具體實施例方式實施例1:共培養(yǎng)體系調控骨髓間充質干細胞三維定向分化為成骨細胞首先，制備精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修飾的海藻酸鈉。將海藻酸鈉(分子量430kDa，古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比1.5)溶解于含有0.5M NaCl的0.1M 2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)緩沖液中(pH值6.5)，得至 1% (W/V)海藻酸鈉溶液。再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和RGD多肽，室溫攪拌反應24小時。EDC和海藻酸鈉摩爾比為1: 20，EDC和sulfo-NHS摩爾比為2: 1，RGD和海藻酸鈉質量比為1: 1000。然后進行透析并冷凍干燥，從而得到RGD修飾的海藻酸鈉。之后，將SD大鼠來源的第五代血管內皮細胞與1.5% (W/V) R⑶修飾海藻酸鈉的生理鹽水溶液混合，調整細胞密度為5X IO6ceIls 將該細胞懸液200 μ L緩慢加入24孔板培養(yǎng)孔中，形成液體薄膜。之后，緩慢加入IOOmmol ^r1CaCl2溶液500 μ L，鈣化20min，得到海藻酸鈣凝膠層。然后，加入0.5% (W/V)的殼聚糖(分子量150kDa，脫乙酰度90% )溶液500 μ L，反應成膜15min。之后，用生理鹽水洗滌3次，加入含有第5代SD大鼠骨髓間充質干細胞的1.5% (ff/V)RGD修飾的海藻酸鈉溶液200 μ L(細胞密度為3X IO6ceIls -πιΓ1)，反應15分鐘。之后，加入IOOmmol.T1CaCl2溶液500 μ L，鈣化20min，便得到含有兩種細胞的海藻酸鈣-殼聚糖-海藻酸鈣三明治式復合凝膠(截留分子量150kDa)。
同時，與上述過程不同之處在于，使用1% (W/V)的殼聚糖溶液(分子量50kDa，脫乙酰度90 % ) 500 μ L，反應成膜30min，替代原來的殼聚糖膜制備條件，得到具有截留分子量70kDa殼聚糖膜的復合凝膠。之后，使用含有10% (V/V)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次，然后于培養(yǎng)孔中添加同樣的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液一次。在培養(yǎng)的第2天，利用電鏡觀察兩種細胞在海藻酸鈣凝膠層中的生長狀況。培養(yǎng)第7天，利用55mmol -Γ1檸檬酸鈉溶解海藻酸鈣凝膠層，收獲內部分化的干細胞，分析胞內堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達。實驗結果見圖2和3，結果顯示，血管內皮細胞和骨髓間充質干細胞在海藻酸鈣凝膠層中呈三維生長；三維共培養(yǎng)體系中胞內堿性磷酸酶活性和骨鈣素表達均高于正常的血管內皮細胞和骨髓間充質干細胞，并且活性和表達量隨著殼聚糖膜截留分子量的增加而提高，這說明此三維共培養(yǎng)體系促進了干細胞向成骨細胞三維分化，并且殼聚糖膜的截留分子量顯著影響了分化的程度。實施例2:共培養(yǎng)體系提高化療藥物處理后腎上皮細胞的活性RGD修飾海藻酸鈉的制備同實施例1。將SD大鼠第5代骨髓間充質干細胞與1.5% (ff/V)RGD修飾海藻酸鈉的生理鹽水溶液200 μ L混合，調整細胞密度為5 X IO6Cells.mL-1,將該細胞懸液200 μ L緩慢加入24孔板培養(yǎng)孔中，形成液體薄膜。之后，緩慢加入IOOmmol ^r1CaCl2溶液500 μ L，鈣化20min，得到海藻酸鈣凝膠層。然后，加入0.5% (W/V)的殼聚糖(分子量1501^&，脫乙酰度90%)溶液500 μ L，反應成膜15min。之后，用生理鹽水洗滌3次，加入含有用化療藥物0.5 μ mo 1-Γ1順鉬處理的24小時的SD大鼠來源的腎小管上皮細胞的1.5% (ff/V) RGD修飾的海藻酸鈉溶液200 μ L(細胞密度為3X IO6Cells.mL-1)，反應成膜15分鐘。之后，加入IOOmmol.[1CaCl2溶液500 μ L，鈣化20min，便得到含有兩種細胞的海藻酸鈣-殼聚糖-海藻酸鈣三明治式復合凝膠(截留分子量150kDa)。之后，含有10% (V/V)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次，然后于培養(yǎng)孔中添加同樣的培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液一次。同時使用transwell進行二維條件下腎小管上皮細胞和骨髓間充質干細胞的共培養(yǎng)，作為對照組，其中腎小管上皮細胞接種在transwell下層RGD修飾的海藻酸鈉包被的培養(yǎng)孔中，骨髓間充質干細胞接種在分離膜上。在共培養(yǎng)的第14天，利用共聚焦顯微鏡檢測二維和三維共培養(yǎng)體系中藥物處理的腎上皮細胞的活性，并與初始接種時細胞活性進行比較；并用55mmol.Γ1檸檬酸鈉溶解海藻酸鈣凝膠層，收獲內部腎小管上皮細胞，用流式細胞儀來分析凋亡和死亡細胞的百分t匕，并與初始接種時和二維共培養(yǎng)體系中的細胞進行比較。實驗結果見圖4和5，結果顯示，三維共培養(yǎng)體系中化療藥物處理后腎上皮細胞的活性最好，并且細胞凋亡和死亡比例明顯低于二維共培養(yǎng)。本發(fā)明操作簡單，成本低，通過將可能相互影響的不同細胞進行三維共培養(yǎng)，最大限度地模擬體內復雜的細胞生存環(huán)境；殼聚糖膜可將不同的細胞進行免疫隔離，有利于細胞的分離和收獲，并且膜截留分子量可控， 可以調整細胞分泌的不同分子量可溶性生長因子在體系中的傳遞。
權利要求
1.一種非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法，其特征在于: 在培養(yǎng)容器中依次制備海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層，即形成三明治式復合凝膠；在制備海藻酸鈣凝膠層過程中，將二種不同的細胞分別三維生長在復合凝膠中截留分子量可控的殼聚糖膜兩側的海藻酸鈣凝膠層中，并于培養(yǎng)容器中添加培養(yǎng)液，從而實現(xiàn)在同一個培養(yǎng)體系中，兩種不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)； 或，在培養(yǎng)容器中依次制備海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層，即形成五層的三明治式復合凝膠；在制備海藻酸鈣凝膠層過程中，將二種或三種不同的細胞分別三維生長在復合凝膠中截留分子量可控的殼聚糖膜兩側的海藻酸鈣凝膠層中，并于培養(yǎng)容器中添加培養(yǎng)液，從而實現(xiàn)在同一個培養(yǎng)體系中，三種不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)。
2.按照權利要 求1所述的方法，其特征在于:所述三明治式復合凝膠為由海藻酸鈉和殼聚糖所制備，可支持兩種或三種細胞三維共培養(yǎng)；其中，海藻酸鈉分子量范圍為IOO-1OOOkDa,古羅糖醛酸和甘露糖醛酸比例(GM比)范圍為0.2-3 ;殼聚糖分子量范圍為2-200kDa，脫乙酰度范圍為50-100%。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述截留分子量可控的殼聚糖膜為通過改變海藻酸鈉或殼聚糖的分子量、濃度或作用時間來改變殼聚糖膜的截留分子量； 并且所述海藻酸鈉和殼聚糖為經過細胞外基質主要成分(膠原、纖粘連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、聚糖)來源的多肽化學修飾的改性海藻酸鈉和殼聚糖；多肽包括精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(IKVAV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(YIGSR)、蘇氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-色氨酸-絲氨酸_谷酰胺(TTSWSQ)、纟顏氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸_天冬酰胺_苯丙氨酸_纟顏氨酸_売氨酸-賴氨酸(VFDNFVLK)、蘇氨酸-谷氨酸-天冬酰胺(TEN)。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述三維共培養(yǎng)為靜態(tài)或者動態(tài)條件下的細胞三維共培養(yǎng)。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)為存在可能相互影響的二種或三種不同種類的細胞在復合凝膠中的三維共培養(yǎng)。
6.按照權利要求1或5所述的方法，其特征在于:二種或三種不同種類的細胞包括下述組合之一，多來源干細胞和多來源體細胞之間、多來源體細胞自身之間、以及多來源干細胞或體細胞和轉基因細胞或細胞株之間的共培養(yǎng)。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于:其中，多來源干細胞，包括胚胎干細胞或成體干細胞；多來源體細胞是指從動物或人的各種組織中通過分離、培養(yǎng)而得到的已分化成熟的細胞；轉基因細胞是指導入了人工修飾基因的細胞，該細胞能夠表達所修飾基因的特定功能；細胞株是指通過選擇法或克隆形成法獲得的具有特殊性質或標志物的克隆化細胞群。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于: 兩種或三種不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)，進而調控共培養(yǎng)體系中目的細胞的增殖、分化等行為。
9.按照權利要求8所述的方法，其特征在于:所述共培養(yǎng)體系中細胞的增殖、定向分化等行為指共培養(yǎng)體系中細胞出現(xiàn)的增殖、分化、遷移、組織化、或凋亡的行為。
10.按照權利要求1所述的方法 ，其特征在于:所述培養(yǎng)容器中為培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞、組織工程等領域，是一種非接觸式細胞三維共培養(yǎng)方法，即在培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中依次制備海藻酸鈣凝膠層、殼聚糖膜層、海藻酸鈣凝膠層，即形成三明治式復合凝膠，不同的細胞分別三維生長在復合凝膠中截留分子量可控的殼聚糖膜兩側的海藻酸鈣凝膠層中，并添加培養(yǎng)液，從而實現(xiàn)在同一個培養(yǎng)體系中，不同細胞的非接觸三維共培養(yǎng)，進而調控共培養(yǎng)體系中目的細胞的增殖、分化等行為。本發(fā)明操作簡單，成本低，通過將可能相互影響的不同細胞進行三維共培養(yǎng)，最大限度地模擬體內復雜的細胞生存環(huán)境。
文檔編號C12N5/00GK103103157SQ20111035268
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月9日 優(yōu)先權日2011年11月9日
發(fā)明者馬小軍, 宋益哲, 劉洋, 張英, 孫廣煒, 王為, 于煒婷 申請人:中國科學院大連化學物理研究所