專利名稱：建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)建鯉促性腺激素(&1RH) 的原核表達(dá)載體及其在&iRH蛋白的原核表達(dá)和制備抗&iRH多克隆抗體中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)前體蛋白由信號肽、GnRH十肽(decap印tide)、促性腺激素釋放激素相關(guān)肽(GnRHassociated peptide, GAP)構(gòu)成，經(jīng)酶切加工后釋放出有活性的&iRH十肽。&iRH在調(diào)節(jié)脊椎動物的生殖發(fā)育中起著非常重要的作用，是下丘腦-垂體性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal，HPG)軸的關(guān)鍵信息分子，通過刺激垂體前葉釋放促性腺激素(Gonadotropin，GtH)，在脊椎動物的性腺發(fā)育、繁殖功能的維持中起著重要的作用。關(guān)于&iRH的免疫原理，目前還沒有確切說法。Meloen和Ook等文章中有所論述，認(rèn)為是血液中的&iRH抗體特異性地中和了動物體內(nèi)的&iRH，導(dǎo)致體內(nèi)&iRH生物活性部分或完全喪失，引起內(nèi)分泌系統(tǒng)平衡的改變，從而改變了 HPG軸系，減少或杜絕精子(或卵子)的生成與成熟及激素的合成與釋放。臨床上用免疫接種技術(shù)控制&iRH的釋放量來控制哺乳動物的性腺發(fā)育已經(jīng)取得了成功，并表現(xiàn)出誘人的前景。Andersen與Riley等研究了抗虹鱒GnRH的免疫接種，提出了一種有望控制魚類性成熟的方法，認(rèn)為免疫抑制技術(shù)在控制虹鱒生殖方面有一定的應(yīng)用潛力。建鯉、Cyprinus carpiovar Jian)是鯉亞科鯉屬的一種。為長體型，比野鯉背高、 體寬，但比常見的雜交鯉體長，具有生長速度快、適合多種養(yǎng)殖方式飼養(yǎng)、抗病力強等優(yōu)點。建鯉是以特定的荷包紅鯉和沅江鯉為親本，經(jīng)6代定向自繁自育而形成的良種，因此對性腺發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用的&iRH研究具有一定的生產(chǎn)意義。人源&iRH已經(jīng)通過基因工程手段獲得了體外表達(dá)并在動物實驗中獲得了較好的免疫原性。高效表達(dá)&iRH基因的重組載體的制備可以高效獲取重組蛋白可以滿足其在魚類人工繁殖中的運用，同時制備的抗體在現(xiàn)有研究中還未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種&iRH六聚體的原核表達(dá)載體pMAL-GnRH，該載體含有T7啟動子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點RBS和六聚體&iRH基因、GAP基因及一個麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽，利用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，可實現(xiàn)&iRH蛋白的高水平表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)以可溶性形式存在于上清中(占大腸桿菌可溶性總蛋白45. 2%%)，通過親和層析純化很容易獲得高純度的重組蛋白質(zhì)，用于蛋白質(zhì)的制備。純化&iRH蛋白的操作相當(dāng)簡單，成本也不高，極易重復(fù)使用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體，其特征在于所述的原核表達(dá)載體由表達(dá)載體pMAL-c^^Q建而得，該載體含有T7啟動子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點PBS、 6個串聯(lián)多聚體&iRH基因序列與一個GAP基因序列、及一個麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽序列。進(jìn)一步說明所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體，其特征在于所述6個串聯(lián)多聚體&1RH基因的上游依次連接有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽序列、起始密碼子、T7啟動子ATG、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點RBS、T7啟動子；6個串聯(lián)多聚體&iRH基因的下游依次連接有GAP基因序列、可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列、終止子。所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于由下述方法構(gòu)建而得
(1)從GeneBank中查找建鯉GnRH的全長基因序列，并采用I^rimerS.0設(shè)計了一對特異性引物
上游引物 1 5' -ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3 ‘ 下游引物 2 5，-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘ 反轉(zhuǎn)錄隨機引物AP;
以提取自建鯉的丘腦總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板及上述的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C預(yù)變性30s， 55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30 個循環(huán)，72°C延伸 7min ；
(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與 PMD18-T載體，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機挑取細(xì)菌，提取質(zhì)粒后用I、Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果用生物軟件 DNAstar、CLUSTAL X 等進(jìn)行分析；
(3)合成六聚體&iRH基因并與GAP基因相連接，并在其兩端加上I,Hindlll酶切位點，將其和原核表達(dá)質(zhì)粒PMAL-C2X分別用I ,Hindlll 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收&1RH/GAP片段和線性化pMAL質(zhì)粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設(shè)計連接反應(yīng)體系，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMAL-GnRH/GAP，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取1_2 個克隆進(jìn)行酶切鑒定，獲得建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體PMAL-GnRH/ GAP。建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體在制備重組&1RH蛋白中的應(yīng)用。建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體在制備&1RH抗體的抗原中的應(yīng)用。建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體制備&1RH重組蛋白的方法， 將pMAL-GnRH/GAP轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)菌液以1/10的比例接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中，分別以0. 5、lmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)，37°C搖振培養(yǎng)4h后， 收集菌體，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min ；最后加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5μ g/mL，4°C孵育10 min,9000g離心30 min,將上清轉(zhuǎn)移備用，上清即為表達(dá)的融合蛋白；將上清蛋白質(zhì)上樣于平衡緩沖液平衡好的Amylose-sepharose親和柱中其中所述平衡緩沖液為 20mmol/L Tris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, pH7 · 4，用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液，所述的洗脫緩沖液為平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE電泳檢測。在純化好的蛋白中加入 Factor Xa至終濃度為200 μ g/mL，室溫作用4h，同上過Amylose- sepharose親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為&iRH重組蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、構(gòu)建的建鯉六聚體&1RH基因的原核表達(dá)載體能高效的表達(dá)目的蛋白，并滿足相關(guān)實驗的需要。2、用重組蛋白免疫小鼠制備的多克隆抗血清具有較高的效價，該抗體能特異性的與建鯉&iRH蛋白反應(yīng)，具有較高的效價，特異性也較好。3、本發(fā)明中&iRH蛋白高效價抗體的成功制備表明6聚體&iRH具有較強的免疫原性，能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，為&iRH調(diào)控魚類性生殖的研究提供了一個新的方法。


圖IGnRH基因的TA克隆策略； 圖2&iRH原核表達(dá)載體的構(gòu)建策略；
圖 3 建鯉 GnRH 基因的檢測，M: DNAmarker ； 1: Product of RT-PCR ； 圖4重組質(zhì)粒pMD18-T-GnRH的限制性酶切分析M:DNA分子量標(biāo)記1 :pMD18-T_GnRH 經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切；
圖5鑒定大腸桿菌中&1RH/GAP融合蛋白的SDS-PAGE分析M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；1 TBl/pMAL-GnRH/GAP 分別經(jīng) 0. 3M IPTG 誘導(dǎo) 4h 后表達(dá)的 MBP-GnRH/GAP 蛋白；2 TBl/pMAL 分別經(jīng)0. 3M IPTG誘導(dǎo)4h后產(chǎn)生的MBP蛋白；3: E. coli TBI。
具體實施例方式
儀器與設(shè)備
試劑主要為分子生物學(xué)試劑，TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠回收試劑盒、I ,Hind III,大腸桿菌JM109，pMD18_T載體，反轉(zhuǎn)錄隨機引物AP ；
原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-ch為大連寶生物公司產(chǎn)品，聚丙烯酰胺、RNase抑制劑等購自上海生工生物工程公司，F(xiàn)actor Xa、Amylose-s印harose柱、抗麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)單抗均購自紐英倫生物技術(shù)(北京)公司，其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。弗氏完全、不完全佐劑，ELISA反應(yīng)板等均購自上海申能博彩生物有限公司。儀器PCR儀購自BioRad公司，實驗結(jié)果記錄和蛋白分析使用的是柯達(dá)公司的凝膠成像系統(tǒng)，DNA序列分析使用DNAstar軟件，全自動測序工作由上海生工生物工程公司完成。酶標(biāo)測定儀購自TECAN公司。所有引物和DNA序列均在上海生工合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1 :GnRH基因的擴(kuò)增與TA克隆
GnRH基因的擴(kuò)增及TA克隆的策略如圖1所示，首先從GenBanK中查找&iRH的全長基因序列(GenBanK號AY148223)，采用ft~imer5. O設(shè)計了一對特異性引物 引物 1 5，-ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3 ‘，見 kqNO. 2 ； 引物 2 5，-CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘，見 kqNO. 3 ；
采用RNA抽提試劑盒提取建鯉(取自淡水漁業(yè)研究中心實驗魚場)丘腦總RNA進(jìn)行純度鑒定后合成第一鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板及合成的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3 min，94°C預(yù)變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，30個循環(huán)，72°C延伸5 min0 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與PMD18-T載體連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機挑取細(xì)菌，提取質(zhì)粒后用&oR I、歷^i/III雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆送交上海生工進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果用DNAstar、CLUSTAL X等軟件進(jìn)行分析。實驗結(jié)果表明擴(kuò)增到了預(yù)期大小即約400bp的目的cDNA片段見kqNO. 1 (圖3)，將其進(jìn)行BLAST檢索，進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明其同源性為97.6%。實施例2 原核表達(dá)載體PMAL-GnRH的構(gòu)建
在獲得正確的&iRH序列后到生物公司合成串聯(lián)六聚體&iRH與GAP序列，將其和原核表達(dá)質(zhì)粒pMAL-ch分別用I ,Hind III 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收GnRH片段(包含串聯(lián)六聚體&iRH與GAP序列)和線性化pMAL質(zhì)粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設(shè)計連接反應(yīng)體系，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMAL- GnRH (圖2)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取10個克隆提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)I和歷‘/^ III雙酶切鑒定，酶切結(jié)果表明pMAL-GnRH酶切后有一條約400 bp的條帶(圖4)，說明GnRH/GAP成功克隆入T 載體中，將重組質(zhì)粒PMAL-GnRH送測序公司測序，測序結(jié)果表明成功的將&iRH cDNA克隆到表達(dá)載體中。實施例3 重組GnRH蛋白的表達(dá)與鑒定
將pMAL-GnRH轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)菌液以1/10的比例接種于新鮮的含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，分別以0. 5、1 mol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)，37°C搖振培養(yǎng)4h后，收集菌體，重懸于100 μ L SDS-PAGE上樣緩沖液中，離心后加上樣緩沖液煮沸破碎細(xì)胞，參照《分子克隆》及試劑手冊進(jìn)行1 濃度的SDS-PAGE電泳(圖5)鑒定蛋白的表達(dá)量。由圖 5可知，加入IPTG誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)入載體pMAL的細(xì)菌總蛋白提取物中出現(xiàn)了分子量約為42kD 的蛋白條帶(圖5泳道2中)，而轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細(xì)菌總蛋白提取物中出現(xiàn)了新的蛋白質(zhì)， 分子量約為55. 5kD (圖5泳道1中)。由于pMAL表達(dá)質(zhì)粒本身可編碼42. 5kD的麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltosebinding protein, MBP),而GnRH及相關(guān)肽分子量約為13. 5 kD,理論上融合蛋白的分子量約*^.5kD。這與預(yù)期結(jié)果相一致，重組表達(dá)載體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，融合蛋白得到表達(dá)，而大腸桿菌TBl沒有相應(yīng)的蛋白表達(dá)。目的蛋白表達(dá)量經(jīng)軟件分析，約達(dá)到了細(xì)菌表達(dá)蛋白總量的45.2%。以抗MBP蛋白的抗血清進(jìn)行的Western blot試驗表明在大小為55. 5kD和42kD可見兩條清楚的蛋白條帶。實施例4 重組&iRH蛋白的大量表達(dá)與純化
取過夜培養(yǎng)的10 mL細(xì)菌于IL LB (含葡萄糖)中，37°C搖振培養(yǎng)3h，加入IPTG至終濃度為0. 5mmol/L再繼續(xù)培養(yǎng)濁，4000g離心20min收集菌體，重懸于50mL柱緩沖液中。 加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min。最后加入DNA酶和RNA酶至終濃度為5 μ g/ mL, 4°C孵育10 min。9000g離心30min，將上清轉(zhuǎn)移備用，上清即為表達(dá)的融合蛋白。將上清蛋白質(zhì)上樣于平衡緩沖液 OOmmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, ρΗ7 ·4) 平衡好的Amylose-sepharose親和柱中，用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液(平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中)洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE 電泳檢測。在純化好的蛋白中加入factor )(a至終濃度為200 μ g/mL，室溫作用4h，同上過Amylose-s印harose親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為GnRH蛋白。同樣作SDS-PAGE電泳檢測。檢測結(jié)果表明純化蛋白為單一條帶，分子量為55. 5kD左右，相對于未融合蛋白MBP的分子量明顯偏大。取純化好的蛋白經(jīng)lector X酶切4h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，目的蛋白為兩個條帶即分子量為42kD的為MBP，分子量為13.5kD的&iRH蛋白。再經(jīng) Amylose sepharose過柱后，得到純化的GnRH蛋白。實施例5:對ICR小鼠免疫原性試驗結(jié)果
(1)疫苗準(zhǔn)備與免疫程序取重組菌37°C培養(yǎng)、純化后，與完全弗氏佐劑以1: 1的比例混合均勻，免疫15只小鼠，每只小鼠腹腔注射SOyg純化蛋白進(jìn)行免疫，初免后小鼠每間隔2周以與初免相同的劑量加強免疫4次。每次免疫后1周尾靜脈采血，制備血清。 同時以生理鹽水腹腔注射10只小鼠為空白對照。最后大量取血制備抗血清。(2)間接ELISA檢測GnRH血清抗體通過間接ELISA方法測定GnRH特異的血清抗體效價=ELISA按常規(guī)方法進(jìn)行。將純化的重組蛋白4°C過夜包被，PBST (含0. 02% Tween-20的PBS)洗滌3次后，用含10%FCS的PBS加滿各孔4°C封閉Mh，PBST洗滌3次。 樣品血清作倍比稀釋(IOOyL/孔)，同時設(shè)立陰性對照(1 :100稀釋的免疫前小鼠血清) 和空白對照(PBS)，37°C水浴孵育2h，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ L 1 25000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗，37°C水浴孵育2h，PBST洗滌3次，每孔加入100 μ L OPD 底物進(jìn)行，測定0D490值，以Ρ/Ν (待檢樣品0D490/陰性樣品0D490)彡2. 1判為陽性。(3)初免1周后，免疫組小鼠的血清中就能檢測到重組蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異抗體，在加強免疫后第6周抗體滴度為1.763士0.015，達(dá)到峰值，而空白對照組不能產(chǎn)生特異抗體，且免疫組與空白組抗體效價值差異顯著(Ρ<0.05)。通過上述的實驗，本發(fā)明達(dá)到了如下的結(jié)果利用本發(fā)明的原核表達(dá)栽體 pMAL-GnRH。該載體是含有建鯉促性腺激素釋放激素的原核表達(dá)載體。本發(fā)明采用RT-PCR 方法從丘腦中擴(kuò)增出長約400bp的目的序列&iRH基因，克隆至T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測定分析確認(rèn)序列的正確性后以此片段為模板人工合成六聚體&iRH及GAP，并克隆到表達(dá)載體pMAL-c2x中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-GnRH，并在大腸桿菌TBI中獲得了高表達(dá)，目的蛋白約占菌體總蛋白的45.2%。菌體經(jīng)溶菌酶裂解，制備無細(xì)胞抽提液，Amylose-s印harose柱層析后得到分子量為55.5kD單一條帶的目的蛋白。目的蛋白經(jīng)!^actoriCa酶切裂解，Amylose-s印harose過柱純化后得到純化的GnRH前體蛋白。以 80 μ g/只的劑量4次免疫ICR小鼠，免疫小鼠可以檢測到特異性針對&iRH前體蛋白的血清抗體應(yīng)答，免疫組抗體水平顯著高于空白組(p<0.(^)，且加強免疫第6周后抗體效價為 1.763士0.015，達(dá)到高峰值，說明表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性，可以刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體，其特征在于所述的原核表達(dá)載體由表達(dá)載體PMAL-Wx構(gòu)建而得，該載體含有T7啟動子和終止子、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點 PBS、6個串聯(lián)多聚體&iRH基因序列與一個GAP基因序列、及一個麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽序列。
2.如權(quán)利要求1所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體，其特征在于所述6個串聯(lián)多聚體&iRH基因的上游依次連接有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽序列、起始密碼子、T7啟動子ATG、細(xì)菌核糖體結(jié)合位點RBS、T7啟動子；6個串聯(lián)多聚體&iRH基因的下游依次連接有GAP基因序列、可被IPTG誘導(dǎo)的操作子序列、終止子。
3.如權(quán)利要求1所述的建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于由下述方法構(gòu)建而得(1)從GeneBank中查找建鯉GnRH的全長基因序列，并采用ft~imer5.0設(shè)計了一對特異性引物上游引物 1 5' -ACTGAGGGAAACTTGGACTGAT-3‘下游引物引物 2 5' -CAAGGCAGAAATAGAAAGGAAG-3 ‘以提取自建鯉的丘腦總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板及上述的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性:3min，94°C預(yù)變性30s， 55°C退火 45s，72°C延伸 lmin，30 個循環(huán)，72°C延伸 7min ；(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與 PMD18-T載體，16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，隨機挑取細(xì)菌，提取質(zhì)粒后用I、Λ /7 /ΙΙΙ雙酶切初步鑒定后，將陽性克隆進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果用生物軟件 DNAstar、CLUSTAL X 等進(jìn)行分析；(3)合成六聚體&iRH基因并與GAP基因相連接，并在其兩端加上I,Hindlll酶切位點，將其和原核表達(dá)質(zhì)粒PMAL-C2X分別用I ,Hindlll 37°C雙酶切，用凝膠回收試劑盒回收&1RH/GAP片段和線性化pMAL質(zhì)粒，按照T4 DNA連接酶的說明書設(shè)計連接反應(yīng)體系，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMAL-GnRH/GAP，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，篩選陽性克隆，隨機挑取1_2 個克隆進(jìn)行酶切鑒定，獲得建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體PMAL-GnRH/ GAP。
4.建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體在制備重組&iRH蛋白中的應(yīng)用。
5.建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體在制備&iRH抗體的抗原中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4建鯉促性腺激素釋放激素基因六聚體原核表達(dá)載體制備&iRH重組蛋白的方法，將pMAL-GnRH/GAP轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1，挑取陽性克隆接種含50 μ g/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖振培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)菌液以1/10的比例接種于新鮮的 LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)中，分別以0.5、lmol/L濃度的IPTG誘導(dǎo)，37°C搖振培養(yǎng)4h后，收集菌體，加入溶菌酶至終濃度為lmg/mL，冰浴30min ；最后加入DNA酶和RNA 酶至終濃度為5μ g/mL，4°C孵育10 min，9000g離心30 min,將上清轉(zhuǎn)移備用，上清即為表達(dá)的融合蛋白；將上清蛋白質(zhì)上樣于平衡緩沖液平衡好的Amylose-s印harose親和柱中其中所述平衡緩沖液為 20mmol/LTris-HCL, 200mmol/LNaCl, lmmol/LEDTA, ρΗ7 ·4,用緩沖液平衡至基線后，開始用洗脫緩沖液，所述的洗脫緩沖液為平衡緩沖液+lOmmol/L麥芽糖中洗脫，洗脫液中即為純化后的融合蛋白，最后SDS-PAGE電泳檢測；在純化好的蛋白中加入Factor Xa至終濃度為200 μ g/mL,室溫作用4h，同上過Amylose- s印harose親和柱，用平衡緩沖液洗脫下的即為&iRH重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)多聚體促性腺激素釋放激素的原核表達(dá)載體pMAL-GnRH。本發(fā)明采用RT-PCR方法從建鯉丘腦中擴(kuò)增出長約400bp的目的序列GnRH基因，克隆至T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測定分析確認(rèn)序列的正確性后通過人工合成GnRH串聯(lián)六聚體并與GAP蛋白偶聯(lián)后將此片段克隆到表達(dá)載體pMAL-c2x中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-GnRH；表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性，可以刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
文檔編號C12N15/66GK102382854SQ20111035341
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者丁煒東, 曹麗萍, 曹哲明, 邴旭文 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心