專(zhuān)利名稱(chēng)：一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并rt-pcr檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及漢坦病毒的檢測(cè)技術(shù)，具體涉及涉及一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并RT-PCR 檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
漢坦病毒屬(Hantavirus)僅有一個(gè)病毒群，即漢坦病毒群(簡(jiǎn)稱(chēng)漢坦病毒)，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)。根據(jù)漢坦病毒基因分子結(jié)構(gòu)和抗原性的不同，將漢坦病毒至少分為34個(gè)血清型/基因型，包括漢灘型病毒(Hantaan Virus)，漢城型病毒(Seoul Virus)，普馬拉型病毒(Puumala Virus)，多不拉伐型病毒(Dobrava Virus)，圖拉型病毒 (Tula virus)，索托帕拉雅型病毒(Thottapalayam virus)和安第斯型病毒(Andes virus) 等。漢坦病毒能感染野生嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)，引發(fā)人類(lèi)的腎綜合征出血熱(HFRS)和漢坦病毒性肺綜合癥(HPS)。這些病遍及亞洲、歐洲、非洲、美洲、大洋洲等70多個(gè)國(guó)家，其流行之廣， 危害之重，已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)漢坦病毒的感染情況更為嚴(yán)重，世界漢坦病毒感染每年報(bào)告的病例數(shù)大約在150,000 200，000之間，而我國(guó)發(fā)病人數(shù)則占世界報(bào)道病例數(shù)的90%以上，是受漢坦病毒危害最為嚴(yán)重的國(guó)家。我國(guó)流行的主要是腎綜合征出血熱，近十年來(lái)我國(guó)年報(bào)告發(fā)病人數(shù)一直穩(wěn)定在4 6萬(wàn)人，而且新疫區(qū)不斷出現(xiàn)，并時(shí)有爆發(fā)。漢坦病毒的檢測(cè)方法主要有病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)方法和基因檢測(cè)方法。基因檢測(cè)方法主要是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，與血清學(xué)抗體檢測(cè)相比在靈敏性和特異性上的都大幅度提高。目前漢坦病毒的RT-PCR檢測(cè)方法中均只針對(duì)漢坦病毒中的漢灘病毒型和/或漢城病毒型使用特異性型引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，如授權(quán)公告號(hào)為CN101294226的發(fā)明專(zhuān)利，就公開(kāi)了以漢灘型病毒和漢城型病毒的各基因型為目的片斷設(shè)計(jì)了二對(duì)引物的試劑盒，用于檢測(cè)漢灘型病毒和/或漢城型病毒；該試劑盒無(wú)法檢測(cè)出漢坦病毒屬內(nèi)的其它病毒。雖然目前國(guó)內(nèi)疫區(qū)大多數(shù)為漢灘型病毒和漢城型病毒感染，但隨著進(jìn)出口貿(mào)易量的增大，國(guó)外流行株(普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、圖拉型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒等)傳入不可避免，因些防止國(guó)外流行株傳入以及未知型別病毒的發(fā)生的檢測(cè)顯得尤為重要，目前還未有對(duì)漢坦病毒屬全病毒通用的PCR檢測(cè)方法的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并RT-PCR檢測(cè)方法，該簡(jiǎn)并RT-PCR檢測(cè)方法不僅可以用于檢測(cè)國(guó)內(nèi)流行的漢灘型和漢城型病毒，還可以用于檢測(cè)國(guó)外其它流行株，防止國(guó)外流行株傳入國(guó)內(nèi)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并RT-PCR 檢測(cè)方法，包括下述步驟
a、RNA提取用RNA提取試劑盒(購(gòu)自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
3b、RNA逆轉(zhuǎn)錄用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購(gòu)于Promega公司)對(duì)上述RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄， 得到PCR模板，具體逆轉(zhuǎn)錄方法依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行在0.2mL印pendorf管中加入oligo d(T)15 primers(50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng(約 10 μ L)，72°C 10. min，加入 5XRT buffer4 μ L, dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶液(IOU/ μ L) 1 μ L、RNA 酶抑制劑(20U/ μ L)0. 5 μ L、 無(wú)RNA酶水1.5μ ，42τ lh，72°C IOmin ；反應(yīng)產(chǎn)物即為后續(xù)的PCR模板；
c、PCR反應(yīng)在 0. anL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 緩沖液(PCR buffer) 2. 5 μ L、濃度為25mM/ L的MgCl2溶液1. 5 μ L、濃度為IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、濃度為5U/μ L 的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L，組成PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min，得到PCR產(chǎn)物，4°C保存；所述上游引物溶液含有濃度為25mM/ L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列為GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有濃度為25mM/L的引物G2，所述引物G2的核苷酸序列為 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；其中r為嘌呤，可以是g或a，y為嘧啶，可以是 c或t/u，η是任何堿基，可以是g或a或c或t/u或其它；
d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產(chǎn)物用1-1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析，若結(jié)果出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，則為漢坦病毒群。(以上PCRbuffer、MgCl2, dNTP液、Taq酶液等反應(yīng)試劑均購(gòu)自大連寶生生物，引物由上海生工合成。上述引物Gl、G2是根據(jù)Genbank已公布12個(gè)基因型病毒株L片段全片段基因設(shè)計(jì)弓I物對(duì)，包括 Dobrava-Belarade viru strain D0BV/Ano-Poroia/Af 19/1999, Hantaan virus strain 76-118,Seoul virus 80-39, Hantavirus zlO,Sin Nombre virus(NM H10) ,Tula virus strain Tula/Moravia/5302v,Andes virus strain Chile-9717869,Puumala virus strain Samara-49/CG/2005,Thottapalayam virus virus strain VRC 66412,Amur virus Khekhtsir/AP209/2005 ,Prospect Hill virus PH-l,Rio Mamore virus HTN—007。 將蛋白序列以FASTA格式保存，將下載的FASTA格式的氨基酸序列信息輸入http:// blocks, fhcrc. org/codehop. html進(jìn)行Block比對(duì)，得到高度保守的連續(xù)氨基酸區(qū)域。使用 CodeHop引物搜索，常規(guī)方法篩選合適上下游引物。要求簡(jiǎn)并度低，上下游引物位置間距在 500bp左右。利用primer和oligo軟件進(jìn)行引物分析，得到上述1對(duì)簡(jiǎn)并雜合寡核苷酸引物(引物Gl和引物G2)，通過(guò)Megalian與Genbank中現(xiàn)有L全片段毒株共52株比對(duì)，理論上均可得到478bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)對(duì)于漢坦病毒屬通用引物的研究報(bào)道。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并RT-PCR檢測(cè)方法，通過(guò)RNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應(yīng)中上游引物溶液含有序列為GCAACAGCAA CATGGTTTca rtaytayac的引物Gl，下游引物溶液含有序列為CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc的引物G2，引物Gl和引物G2是由5 ‘端非兼并共有序列夾和根據(jù)保守氨基酸設(shè)計(jì)的很短的3 ‘端的核心簡(jiǎn)并區(qū)(cartaytayac或arnccyttytc)組成， 擴(kuò)增產(chǎn)物序列長(zhǎng)度為478bp ；引物中5丨端非兼并共有序列在不增加引物簡(jiǎn)并度的情況下能穩(wěn)定3 ‘兼并核心區(qū)與模板結(jié)合作用，允許在較高退火溫度下進(jìn)行，提高了兼并PCR反應(yīng)的特異性，可以擴(kuò)增檢測(cè)漢坦病毒屬內(nèi)各類(lèi)病毒，如漢灘型病毒、漢城型病毒、普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止國(guó)外流行株傳入國(guó)內(nèi)，也能對(duì)與擴(kuò)展基因同源的未知病毒進(jìn)行檢測(cè)，并可以對(duì)擴(kuò)增的目標(biāo)片段進(jìn)行測(cè)序，所獲得的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)可以用于漢坦病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1、RT-PCR檢測(cè)漢灘型病毒
1、總RNA提取Vero細(xì)胞用5%滅活小牛血清DMEM37°C培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代培養(yǎng)成單層后，接種漢坦病毒76-118株病毒(漢灘型，浙江省疾病控制預(yù)防中心惠贈(zèng))，吸附2小時(shí)后用0. 5%小牛血清DMEM (購(gòu)自Hyclone)維持液放置于37°C CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。7_10天中 IFA檢測(cè)出現(xiàn)陽(yáng)性后收獲細(xì)胞，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA作為陽(yáng)性RNA (具體提取方法依說(shuō)明書(shū))。用微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度和純度，0D260/280 ^ 1.9，表明RNA純度較高，無(wú)DNA和蛋白質(zhì)污染，取50ng進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；
2、RNA逆轉(zhuǎn)錄用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上述陽(yáng)性RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，具體方法為 在 0.2mL 印 pendorf■管中加入 oligo d (T)15 primers (50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng (約 10μ L),72°C lO.min，加入 5 X RT buffer4 μ L、dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反轉(zhuǎn)錄酶液(10U/yL) IyL, RNA 酶抑制劑(20U/y L) 0.5yL、無(wú) RNA 酶水 1. 5 μ L, 42 °C lh, 72 °C IOmin ；反應(yīng)產(chǎn)物即為后續(xù)的PCR模板；
3、PCR反應(yīng)在 0. anL 印pendorf 管中加入 10XPCR buffer2. 5 μ L、MgCl2 溶液(25mM/ L) 1· 5 μ L、dNTP 液(10mM/L) 0· 5 μ L、Taq 酶液(5U/ μ L) 0· 5 μ L、上游引物溶液(引物 Gl 濃度為25mM/L) 1 μ L、下游引物溶液(引物G2濃度為25mM/L) 1 μ L，PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L，組成PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，;35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min，4°C保存PCR產(chǎn)物；
4、瓊脂糖凝膠電泳將PCR產(chǎn)物用1-1.5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析。結(jié)果漢坦病毒76_118株Vero細(xì)胞培養(yǎng)物出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，測(cè)序結(jié)果序列如SEQ ID NO :3所示。RT-PCR方法靈敏性試驗(yàn)用分光光度計(jì)檢測(cè)提取漢坦病毒76-118株感染的Vero 細(xì)胞RNA濃度為85. 6ng，將RNA用foiase-free Water 10倍梯度稀釋?zhuān)凑諏?shí)施例1的步驟 1-4的方法用G1/G2引物對(duì)擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示本檢測(cè)方法可以檢測(cè)出的最高稀釋度為10_3，相當(dāng)于85. 6pg核酸的病毒RNA。RT-PCR方法特異性試驗(yàn)用漢坦病毒76-118株RNA、甲型Hmi流感病毒RNA、，柯薩奇病毒RNA、流行性乙型腦炎R(shí)NA，正常Vero細(xì)胞RNA，作為檢測(cè)對(duì)象，按照實(shí)施例1的步驟1-4的方法用G1/G2引物對(duì)擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果只有漢坦病毒76-118株核酸擴(kuò)增產(chǎn)物在 478bp出現(xiàn)一條特異性條帶外，甲型Hmi流感病毒、柯薩奇病毒、流行性乙型腦炎病毒及正常Vero細(xì)胞RNA擴(kuò)增產(chǎn)物均未見(jiàn)特異性核酸條帶。實(shí)施例2、RT-PCR檢測(cè)小鼠的漢坦病毒
對(duì)2008年-2009年大榭港區(qū)收集253只小鼠，用乙醚麻醉后頸椎脫白處死，取肺組織 10-25mg，勻漿后用RNA提取試劑盒進(jìn)行肺組織總RNA提取(具體提取方法依說(shuō)明書(shū))，用微量分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度和純度，0D260/280彡1.9，表明RNA純度較高，無(wú)DNA和蛋白質(zhì)污染，取50ng進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；然后按實(shí)施例1的步驟2進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，步驟3進(jìn)行 PCR反應(yīng)，步驟4進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明在檢測(cè)253份鼠肺樣本，其中2份擴(kuò)增得到478bp大小片段的條帶。檢測(cè)結(jié)果與使用衛(wèi)生部公布的《全國(guó)腎綜合征出血熱檢測(cè)方案 (試行)》結(jié)果一致。一份條帶送上海英俊測(cè)序，測(cè)序結(jié)果序列如SEQ ID NO :4所示，序列比對(duì)后鑒定為漢灘型病毒。實(shí)施例3、RT-PCR檢測(cè)漢城型病毒
與實(shí)施例1步驟1-4基本相同，所不同的只是接種的是漢坦病毒80-39株病毒(漢城型，浙江省疾病控制預(yù)防中心惠贈(zèng))，檢測(cè)后漢坦病毒80-39株Vero細(xì)胞培養(yǎng)物出現(xiàn)478bp 大小片段的條帶，測(cè)序結(jié)果的序列如SEQ ID N0:5所示。實(shí)施例4、RT-PCR檢測(cè)普馬拉型病毒陽(yáng)性質(zhì)粒
人工合成Puumala virus strain Sotkamo核酸(如SEQ ID NO:6所示序列)片段(大連寶生生物合成)，連接至PMD18-T載體(購(gòu)自上海生工)，轉(zhuǎn)化至DH5ci大腸桿菌(購(gòu)自上海生工)，挑取克隆酶切鑒定，選取陽(yáng)性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自上海生工)提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性RNA和陰性RNA(若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實(shí)施例1的步驟2進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，步驟3進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟4進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果陽(yáng)性RNA出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，陰性RNA無(wú)條帶出現(xiàn)。實(shí)施例5、RT-PCR檢測(cè)多不拉伐型病毒陽(yáng)性質(zhì)粒
人工合成 Dobrava-Belgrade virus strain Ano-Poroia/Af 19/1999 核酸(如 SEQ ID N0:7所示序列)片段(大連寶生生物合成)，連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5a大腸桿菌， 挑取克隆酶切鑒定，選取陽(yáng)性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自上海生工)提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性RNA和陰性RNA(若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實(shí)施例 1的步驟2進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，步驟3進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟4進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果陽(yáng)性 RNA出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，陰性RNA無(wú)條帶出現(xiàn)。實(shí)施例6、RT-PCR檢測(cè)安第斯型病毒陽(yáng)性質(zhì)粒
人工合成 Andes virus strain Chile-9717869 核酸(如 SEQ ID N0:8 所示序列)片段 (大連寶生生物合成)，連接至PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5ci大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽(yáng)性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自上海生工)提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性 RNA和陰性RNA (若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實(shí)施例1的步驟2進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，步驟3進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟4進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果陽(yáng)性RNA出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，陰性RNA無(wú)條帶出現(xiàn)。實(shí)施例7、RT-PCR檢測(cè)索托帕拉雅型病毒陽(yáng)性質(zhì)粒
人工合成 Thottapalayam virus strain VRC-66412 核酸(如 SEQ ID N0:9 所示序列) 片段(大連寶生生物合成)，連接至PMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5ci大腸桿菌，挑取克隆酶切鑒定，選取陽(yáng)性克隆和陰性克隆增菌培養(yǎng)，使用質(zhì)粒提取試劑盒(購(gòu)自上海生工)提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性RNA和陰性RNA (若病毒用RNA提取試劑盒提取RNA)，然后按實(shí)施例1的步驟2進(jìn)行 RNA逆轉(zhuǎn)錄，步驟3進(jìn)行PCR反應(yīng)，步驟4進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果陽(yáng)性RNA出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，陰性RNA無(wú)條帶出現(xiàn)。從上述實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)漢坦病毒群的漢灘型病毒、漢城型病毒、普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒有效，同理也對(duì)該漢坦病毒群的圖拉型病毒等有效，是一種通用的漢坦病毒屬種類(lèi)的檢測(cè)方法。在此不一一列舉其它病毒型的檢測(cè)結(jié)果。
權(quán)利要求
1. 一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并RT-PCR檢測(cè)方法，其特征在于包括下述步驟a、RNA提取用RNA提取試劑盒提取病毒的RNA，得到RNA，具體提取方法依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；b、RNA逆轉(zhuǎn)錄用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)上述RNA進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄，得到PCR模板，具體逆轉(zhuǎn)錄方法依說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；c,PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系為10XPCR緩沖液2. 5 μ L、濃度為25mM/ L的MgCl2溶液 1. 5 μ L、濃度為IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、濃度為5U/ μ L的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，滅菌去離子水16 μ L ；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 52°C退火30s, 72°C延伸lmin, 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸7min,得到的 PCR產(chǎn)物4°C保存，所述上游引物溶液含有濃度為25mM/L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列為GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有濃度為25mM/L的引物 G2，所述引物 G2 的核苷酸序列為 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；d、瓊脂糖凝膠電泳將上述PCR產(chǎn)物用1-1. 5%濃度瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目標(biāo)條帶，電泳條件電壓100v，30min，將電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)分析，若結(jié)果出現(xiàn)478bp大小片段的條帶，則為漢坦病毒群。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種漢坦病毒群的簡(jiǎn)并RT-PCR檢測(cè)方法，通過(guò)RNA提取、RNA逆轉(zhuǎn)錄、PCR反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，PCR反應(yīng)中上游引物溶液含有序列為GCAACAGCAACATGGTTTcartaytayac的引物G1，下游引物溶液含有序列為CTTCTTCATTCATATTTCCATGCarnccyttytc的引物G2，引物中5＇端非兼并共有序列在不增加引物簡(jiǎn)并度的情況下能穩(wěn)定3＇兼并核心區(qū)與模板結(jié)合作用，提高了兼并PCR反應(yīng)的特異性，可以擴(kuò)增檢測(cè)漢坦病毒屬內(nèi)各類(lèi)病毒，如漢灘型病毒、漢城型病毒、普馬拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止國(guó)外流行株傳入國(guó)內(nèi)，也能對(duì)與擴(kuò)展基因同源的未知病毒進(jìn)行檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102382906SQ20111035416
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者胡群, 謝東華, 郭利平, 韓輝, 馬思杰 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)大榭出入境檢驗(yàn)檢疫局