專利名稱：一種以1,2-丁二醇為底物生產(chǎn)R-α-羥基丁酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，具體地說，涉及一種利用氧化葡萄糖桿菌DSM 2003的完整細(xì)胞作為生物催化劑催化1，2- 丁二醇生產(chǎn)R- a -羥基丁酸的方法。
背景技術(shù)：
a-羥基丁酸是一種重要的工業(yè)中間體，可以用來合成異亮氨酸和某些藥物。a -羥基丁酸分為R和S兩種構(gòu)型。高純度手性R- a -羥基丁酸可以用來合成可生物降解的高聚物聚Ct-輕基丁酸[P(2HB)]⑴。另外,R-a -輕基丁酸可用來制備azinothricin家
族抗癌抗生素2’3。經(jīng)過文獻(xiàn)檢索，用于高純度R-a -羥基丁酸生產(chǎn)的起始底物通常有兩種。一種是a -酮基丁酸，通過立體選擇性的酶還原生成R-a -羥基丁酸4;另一種是外消旋a -羥基丁酸，通過乙酰化反應(yīng)5或者氧化反應(yīng)6’7立體特異性拆分，得到高純度R-a-羥基丁酸。無論是a-酮基丁酸還是外消旋a-羥基丁酸，其價(jià)格均較為昂貴且難以獲得。鑒于此，R- a -羥基丁酸的大量生產(chǎn)中迫切需要選擇一種合適而廉價(jià)的起始底物。1,2- 丁二醇具有I位和2位羥基，I位羥基氧化為羧基可產(chǎn)生a -羥基丁酸，因而1，2-丁二醇可作為R-a-羥基丁酸生產(chǎn)的潛在底物；氧化葡萄糖桿菌DSM 2003能夠不完全性的立體選擇性氧化糖類、醇類以及酸類8，因而其有可能催化1，2_ 丁二醇生產(chǎn)R-a-羥基丁酸。然而，目前的檢索結(jié)果表明:利用氧化葡萄糖桿菌生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法未見報(bào)道。參考文獻(xiàn):1Tsuji，H.，Okumura, A.，2009.Stereocomplex formation betweenenantiomeric substituted poly (Iactide) s:blends of poly [ (S)-2-hydroxybutyrae]and poly[(R)-2-hydroxybutyrate].Macromolecules 42，7263-7266.
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發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種以1，2_ 丁二醇為底物生產(chǎn)R-a -羥基丁酸的方法，以克服R-a -羥基丁酸制備中底物外消旋a -羥基丁酸和a-酮基丁酸價(jià)格較高的缺陷。本發(fā)明所述以1，2_ 丁二醇為底物生產(chǎn)R-a -羥基丁酸的方法，步驟是:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 72 7.5磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2 4次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；其中，上述氧化葡萄糖桿菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D-山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。⑵轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑 的濃度為5 120克濕細(xì)胞/升、1，2_ 丁二醇的濃度為5 60克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度5 40毫摩爾/升；在20 50°C，pH 4.0 10.0條件下，以50 180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩I 30小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R-a -羥基丁酸溶液將步驟(2)中制得的轉(zhuǎn)化液以5，000 10，000轉(zhuǎn)/分離心5 25分鐘，或者用
200 400目濾布過濾，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-a-羥基丁酸溶液。(4)產(chǎn)物R-a -羥基丁酸的檢測(cè)R-a -羥基丁酸含量檢測(cè)采用AgilentllOO高壓液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為AminexHPX-87H ;分析條件為以10毫摩爾/升硫酸為流動(dòng)相，柱溫55°C，流速為0.4毫升/分鐘，進(jìn)樣量5微升，采用示差折光檢測(cè)器。R-a -羥基丁酸對(duì)映體過量值測(cè)定采用AgilentllOO高壓液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為手性柱(50X4.6毫米，MCIGEL CRS10W,日本三菱化學(xué))，以2毫摩爾/升硫酸銅水溶液作為流動(dòng)相，柱溫25°C，流速為0.5毫升/分鐘，進(jìn)樣量5微升，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為254納米。待測(cè)樣品用兩倍體積的高氯酸(5% )酸化，4°C靜置2小時(shí)后，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，離心上清用0.22微米的水相濾膜過濾，然后色譜分析。對(duì)映體過量值=(R-a-羥基丁酸含量-S- a -羥基丁酸含量)+ (R- a -羥基丁酸含量+S- a -羥基丁酸含量)X 100 %。
上述以I，2- 丁二醇為底物生產(chǎn)R-a -羥基丁酸的方法中:步驟⑵所述的1，2- 丁二醇濃度優(yōu)選為10 50克/升。步驟⑵所述生物催化劑即完整細(xì)胞的濃度優(yōu)選為40 100克濕細(xì)胞/升。步驟⑵所述的乙二胺四乙酸二鈉濃度優(yōu)選為10 30毫摩爾/升。步驟⑵所述的溫度優(yōu)選為25 40°C。步驟⑵所述的pH優(yōu)選為5.0 8.0。步驟(2)所述振蕩時(shí)間優(yōu)選為4 25小時(shí)。本發(fā)明利用生物催化劑即氧化葡萄糖桿菌DSM 2003的完整細(xì)胞，選擇性地氧化1，2_ 丁二醇的I位羥基，成功實(shí)現(xiàn)R-a-羥基丁酸的立體特異性合成。本發(fā)明方法具有以下特點(diǎn):(I)采用生物催化的方法，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，步驟簡(jiǎn)短，操作簡(jiǎn)便。生物催化劑可以容易地除去，便于后續(xù)產(chǎn)物分離純化。(2)反應(yīng)周期較短，產(chǎn)物R-a -羥基丁酸可積累到較高濃度。(3)底物1，2- 丁二醇價(jià)格低廉，易于獲得。(4)產(chǎn)物對(duì)映體過量率高,可達(dá)到99%以上。


圖1R- a -羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品高壓液相色譜檢測(cè)結(jié)果。圖2S- a -羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品高壓液相色譜檢測(cè)結(jié)果。圖3R- a -羥基丁酸產(chǎn)品高壓液相色譜檢測(cè)結(jié)果。圖4R- a -羥基丁酸產(chǎn)品質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003 (購買自德國微生物保藏中心)，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；其中，上述氧化葡萄糖桿菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D-山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為60克濕細(xì)胞/升、1，2_ 丁二醇的濃度為40克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度20毫摩爾/升；在37°C，pH 6.0條件下，以180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩25小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R-a -羥基丁酸溶液將步驟(2)中制得的轉(zhuǎn)化液以10，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-a -羥基丁酸溶液。(4)產(chǎn)物R-a -羥基丁酸的檢測(cè)
經(jīng)HPLC檢測(cè)，通過比較R-2-羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品高壓液相色譜結(jié)果(圖1)和S_2_羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品高壓液相色譜結(jié)果(圖2)及R-2-羥基丁酸產(chǎn)品高壓液相色譜結(jié)果(圖3)，發(fā)現(xiàn)步驟(3)所得上清液中產(chǎn)物保留時(shí)間與R-2-羥基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品一致，質(zhì)譜檢測(cè)其分子量與R-2-羥基丁酸相符(圖4)。由此確認(rèn)生物催化劑即氧化葡萄糖桿菌DSM 2003完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化1，2_ 丁二醇的產(chǎn)物為R-2-羥基丁酸，并測(cè)定其濃度為18.2克/升，對(duì)映體過量值為99.7%。實(shí)施例2:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫黄渲校鲜鲅趸咸烟菞U菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D-山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為100克濕細(xì)胞/升、1，2- 丁二醇的濃度為50克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度30毫摩爾/升；在40°C，pH 4.0條件下，以180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩15小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R- α -羥基丁酸溶液將步驟⑵中制 得的轉(zhuǎn)化液以10，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-α -羥基丁酸溶液。(4)產(chǎn)物R- α -羥基丁酸的檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，步驟(3)中所含R-2-羥基丁酸的濃度為11.2克/升，對(duì)映體過量值為
95.3%。實(shí)施例3:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；其中，上述氧化葡萄糖桿菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為120克濕細(xì)胞/升、1，2- 丁二醇的濃度為60克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度40毫摩爾/升；在40°C，pH 5.0條件下，以180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩30小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R- α -羥基丁酸溶液將步驟⑵中制得的轉(zhuǎn)化液以10，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除生物催化劑即完
整細(xì)胞，所得清液即為含R-α -羥基丁酸溶液。
(4)產(chǎn)物R- α -羥基丁酸的檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，步驟(3)中所含R-2-羥基丁酸的濃度為21.2克/升，對(duì)映體過量值為
97.6%。實(shí)施例4:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；其中，上述氧化葡萄糖桿菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為5克濕細(xì)胞/升、1，2-丁二醇的濃度為5克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度20毫摩爾/升；在50°C，pH 8.0條件下，以180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩I小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R- α -羥基丁酸溶液`將步驟(2)中制得的轉(zhuǎn)化液以10，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-α -羥基丁酸溶液。(4)產(chǎn)物R- α -羥基丁酸的檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，步驟(3)中所含R-2-羥基丁酸的濃度為0.2克/升，對(duì)映體過量值為96.6%。實(shí)施例5:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；其中，上述氧化葡萄糖桿菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為60克濕細(xì)胞/升、1，2- 丁二醇的濃度為40克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度10毫摩爾/升；在20°C，pH 10.0條件下，以180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R- α -羥基丁酸溶液將步驟⑵中制得的轉(zhuǎn)化液以10，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-α -羥基丁酸溶液。(4)產(chǎn)物R- α -羥基丁酸的檢測(cè)經(jīng)檢測(cè)，步驟(3)中所含R-2-羥基丁酸的濃度為2.2克/升，對(duì)映體過量值為
96.4%。
實(shí)施例6:(I)制備生物催化劑選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.4磷酸鉀緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆?；其中，上述氧化葡萄糖桿菌使用如下培養(yǎng)基配方培養(yǎng):D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸銨5克/升；磷酸二氫鉀2克/升；硫酸鎂5克/升；碳酸鈣10克/升。(2)轉(zhuǎn)化將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為60克濕細(xì)胞/升、1，2_ 丁二醇的濃度為60克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度20毫摩爾/升；在30°C，pH 6.0條件下，以180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩24小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液。(3)制取含R- α -羥基丁酸溶液將步驟⑵中制得的轉(zhuǎn)化液以10，000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-α -羥基丁酸溶液。(4)產(chǎn)物R- α -羥基丁酸的檢測(cè)經(jīng)檢測(cè) ，步驟(3)中所含R-2-羥基丁酸的濃度為23.2克/升，對(duì)映體過量值為
98.4%。
權(quán)利要求
1.一種以I，2-丁二醇為底物生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，步驟是: (1)制備生物催化劑 選取氧化葡萄糖桿菌DSM 2003，常規(guī)方法培養(yǎng)，分離并收集菌體，用pH 7.2 7.5磷酸鉀緩沖液洗滌菌體2 4次，菌體重懸于去離子水中，使菌體濃度達(dá)到200克濕細(xì)胞/升，得到的完整細(xì)胞懸液即為生物催化劑，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆茫? (2)轉(zhuǎn)化 將步驟(I)中制得的生物催化劑即完整細(xì)胞與底物1，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化劑的濃度為5 120克濕細(xì)胞/升、1，2- 丁二醇的濃度為5 60克/升，并加入乙二胺四乙酸二鈉至終濃度5 40毫摩爾/升；在20 50°C，pH 4.0 10.0條件下，以50 180轉(zhuǎn)/分鐘振蕩I 30小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液； (3)制取含R-a -羥基丁酸溶液 將步驟(2)中制得的轉(zhuǎn)化液以5，000 10，000轉(zhuǎn)/分離心5 25分鐘，或者用200 400目濾布過濾，去除生物催化劑即完整細(xì)胞，所得清液即為含R-a-羥基丁酸溶液。
2.如權(quán)利要求1所述以1，2_丁二醇為底物生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，其特征在于，步驟⑵所述的1，2- 丁二醇濃度為10 50克/升。
3.如權(quán)利要求1所述以1，2_丁二醇為底物生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，其特征在于，步驟(2)所述生物催化劑即完整細(xì)胞的濃度為40 100克濕細(xì)胞/升。
4.如權(quán)利要求1所述以1，2_丁二醇為底物生產(chǎn)R-a -羥基丁酸的方法，其特征在于，步驟(2)所述的乙二胺四乙酸二鈉濃度為10 30毫摩爾/升。
5.如權(quán)利要求1所述以1，2_丁二醇為底物生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，其特征在于，步驟⑵所述的溫度為25 40°C。
6.如權(quán)利要求1所述以1，2_丁二醇為底物生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，其特征在于，步驟⑵所述的pH為5.0 8.0。
7.如權(quán)利要求1所述以1，2_丁二醇為底物生產(chǎn)R-a-羥基丁酸的方法，其特征在于，步驟(2)所述振蕩時(shí)間為4 25小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以1，2-丁二醇為底物生產(chǎn)R-α-羥基丁酸的方法，是以常規(guī)方法培養(yǎng)氧化葡萄糖桿菌DSM 2003制得生物催化劑，再將生物催化劑與底物1，2-丁二醇水溶液混合，并加入乙二胺四乙酸二鈉在20～50℃，pH 4.0～10.0條件下，振蕩1～30小時(shí)，得到轉(zhuǎn)化液；再由轉(zhuǎn)化液制取含R-α-羥基丁酸溶液。本發(fā)明方法具有以下特點(diǎn)(1)采用生物催化的方法，反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，步驟簡(jiǎn)短，操作簡(jiǎn)便；生物催化劑可以容易地除去，便于后續(xù)產(chǎn)物分離純化；(2)反應(yīng)周期較短，產(chǎn)物R-α-羥基丁酸可積累到較高濃度；(3)底物1，2-丁二醇價(jià)格低廉，易于獲得；(4)產(chǎn)物對(duì)映體過量率高，可達(dá)到99％以上，為實(shí)現(xiàn)R-α-羥基丁酸的高效生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P7/42GK103103222SQ20111035517
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月10日
發(fā)明者許平, 高超, 張文, 馬翠卿 申請(qǐng)人:山東大學(xué)