專利名稱:硫酸軟骨素酶ac融合蛋白、其編碼基因以及其構建方法
技術領域:
本文涉及基因工程和發(fā)酵工程領域中一種硫酸軟骨素酶AC融合蛋白及其編碼基因以及其構建方法。此外本文還提供了純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法。另外,本文還涉及一種生產低分子量硫酸軟骨素A或C的方法。
背景技術:
硫酸軟骨素裂解酶(chondroitinase或 chondroitin sulfateyase,以下有時也簡稱為“ChSase”)是一類能將硫酸軟骨素、軟骨素、透明質酸等糖胺聚糖降解為不飽和二糖(ADi及寡糖)的裂解酶。隨著對ChSase的深入研究,發(fā)現(xiàn)硫酸軟骨素酶AC(以下有時也簡稱為“ChSaseAC”)有著廣泛的應用價值:在基礎理論研究方面,科研人員利用ChSase AC特異性地降解硫酸軟骨素蛋白聚糖中的硫酸軟骨素側鏈,通過對機體組織特定部位的硫酸軟骨素的降解,并通過該部位硫酸軟骨素降解前后功能的改變及降解產物的分析,來了解硫酸軟骨素裂解酶的功能與結果(參見:Shibata S, Midura RJ, Hascall UC.Structuralanalysis of the linkage regionoligosaccharides and unsaturated disaccharidesfrom chondroitin sulfate usingCarbopac PA.J Biol Chem,1992,267(10):6548-6555;和 Hardingham TE,F(xiàn)osang AJ, Hey NJ 等人,The sulphation pattern in chondroitinsulphate chainsinvestigated by chondroitinase ABC and ACII digestion andreactivity withmonoclonal antibodies.Carbohydr Res 1994,255(3):241-254)。在ChSase AC的臨床運用領域,近年來研究也非常活躍,包括對細胞外基質代謝相關疾病,如椎間盤突出的研究。在治療椎間盤突出的介入療法中,將化學藥物注入椎間盤內以溶解吸收椎間盤中壓迫神經(jīng)的髓核或破裂的纖維環(huán)以解除對神經(jīng)的壓迫。目前臨床上主要使用的化學藥物成 分為木瓜蛋白酶和羧肽酶等,但此類藥物成分的特異性低,并損傷外周組織,從而易引起髓神經(jīng)麻痹等癥。近年來,Mark R Brown等(參見:Brown MD.Methodfortreating intervertebral disc displacement with enzymes.US:4,696,816,1987-09-29)經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),突出椎間盤內的主要組分為蛋白聚糖,而用ChSaseAC則可特異性降解掉突出的椎管內的糖胺聚糖、降低椎管內壓,同時對椎管外周組織無損害。因此,ChSase AC木瓜蛋白酶更適宜治療椎間盤突出,同時具有更高的安全性(參見:Kato F,Mimatsu K,Iwata H等人,Comparisonof tissue reaction with chondroitinase ABC andchymopapain in rabbits as thebasis of clinical application in chemonucleolysis.Clin 0rthop,1993,288(3):294-302) 在臨床運用領域還包括抗癌研究,研究表明硫酸軟骨素糖胺聚糖與腫瘤細胞的侵入、轉移密切相關(參見:Henke CA,Roongta U,Mickelson DJ 等人,CD44_relatedchondroitin sulfate proteoglycan, a cell surface receptor implicatedwith tumorcell invasion, mediates endothelial cell migration on fibrinogen andinvasioninto a fibrin matrix.J Clin Invest,1996,97 (11):2541-2552)。2001 年 Denholm EM等發(fā)現(xiàn)ChSase AC能抑制黑色素瘤血管的形成及瘤細胞的轉移與增生等(參見=Denholm EM,Lin YQ, Silver PJ.Ant1-tumor activitiesof chondroitinase AC and chondroitinaseB:inhibition of angiogenesis,proliferation and invasion.Eur J Pharmacol,2001,416(3):213-221)。在制藥領域,硫酸軟骨素是一種具有較強的降血脂作用和緩沖抗凝血作用的物質,臨床上主要用于防止冠心病和動脈粥樣硬化。目前,對低分子量硫酸軟骨素的制備常采用酸水解法、離子交換法和酶解法。前兩種方法需要較復雜的實驗設備并且會污染環(huán)境,比較而言,酶解法需要的條件不高、方法簡便且容易控制,同時酶解法的關鍵在于獲得大量的硫酸軟骨素裂解酶。分離純化硫酸軟骨素裂解酶的方法非常復雜,通常需要經(jīng)過多步的色譜純化,收率很低。在分離純化硫酸軟骨素裂解酶中,ChSase AC的異源重組表達是替代利用微生物生產ChSase AC的可行的方案。然而對ChSase AC的異源重組表達研究非常有限,到目前為止國內還沒有這方面的報道。只有Pojasek等在E.coil中表達了硫酸軟骨素酶的基因(chsase基因),并分離純化到活性蛋白,在其研究中所用的載體為pET15b和pCRT7/NT,這兩個載體中的融合標簽均為His_tag。但是His_tag存在明顯的缺點,即跟親和載體的親和力不強,不能增加與之結合的蛋白質的可溶性,難以提高純化效果和蛋白質可溶性比例等(參見Kevin Pojasek, Zachary Shriver, Patrick Kiley,Ganesh Venkataraman and Ram Sasisekharan.Recombinant Expression, Purificationand Kinetic Characterization of Chondroitinase AC andChondroitinase B fromFlavobacterium hparinum.Biochemical and BiophysicalResearch Communications,2001,286:343-351)。目前,需要一種簡單、方便的方法,通過該方法可以得到具有硫酸軟骨素酶AC活性的硫酸軟骨素酶AC替代物,該替代物可以與硫酸軟骨素酶AC相同地使用。
發(fā)明內容
本發(fā)明人意外地得到了硫酸軟骨素裂解酶替代物-硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其具有硫酸軟骨素酶AC的活性,能夠用于生產硫酸軟骨素,并且硫酸軟骨素的生成條件不高、方法簡便且容易控制。本文涉及以下內容:(1).一種硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中融合有硫酸軟骨素酶AC和麥芽糖結合蛋白。(2).根據(jù)(1)所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述硫酸軟骨素酶AC具有SEQ ID NO:1所示的序列。(3).根據(jù)(1)或(2)所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述麥芽糖結合蛋白具有SEQ ID NO: 2所示的序列(4).根據(jù)(1) (3)中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中,所述麥芽糖結合蛋白通過肽段連接部分與所述硫酸軟骨素酶AC連接。(5).根據(jù)(4)所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中,所述連接部分具有SEQ IDNO: 3所示的序列。(6).根據(jù)(4)所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述連接部分連接在SEQ IDNO:1的氨基酸的N端。(7).根據(jù)(I) (6)中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所不序列。(8).一種硫酸軟骨素酶AC的替代物,其是(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白。(9).一種編碼(I) (7)中任一項所述的融合蛋白的DNA。(10).—種具有序列表中SEQ ID NO:5所不的喊基序列的DNA。(11).一種重組載體,其包含(9)或(10)所述的DNA。(12).一種轉化體,其是將(11)所述的重組載體導入宿主細胞而得到的轉化體。(13).一種構建(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,包括(i).提供含麥芽糖結合蛋白的質粒載體;和(ii).將硫酸軟骨素酶AC的基因連接到上述質粒載體上。(14).根據(jù)(13)的方法,其中所述硫酸軟骨素酶AC的N端通過肽段連接部分與麥芽糖結合蛋白結合。(15).一種純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,其包括:a.利用直鏈淀粉樹脂吸附含(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物,以及`b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白。(16).根據(jù)(15)所述的純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,在所述a和b之前,該方法還包括:提供含麥芽糖結合蛋白的質粒載體;將硫酸軟骨素酶AC的基因連接到上述質粒載體上提供重組載體;將重組載體導入宿主細胞而得到轉化體;以及利用培養(yǎng)基培養(yǎng)該轉化體并獲得所述含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物。(17).硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的用途,用來代替硫酸軟骨素酶AC。(18).一種生產低分子量硫酸軟骨素A或者C的方法,其包括:使用(I) (7)中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白降解硫酸軟骨素A或者C原料、來生產低分子量硫酸軟骨素A或者C的方法,其中得到的硫酸軟骨素A或者C的分子量為0.5 25kDa。(19).根據(jù)(18)所述的生產硫酸軟骨素A或者C的方法,其中,所述得到的硫酸軟骨素A或者C的分子量為2 lOkDa。(20).一種硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的用途,用于生產低分子量的硫酸軟骨素A或者C,其中,生產的低分子量硫酸軟骨素A或者C的分子量為0.5 25kDa。(21).根據(jù)(20)所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的用途,其中,生產的低分子量硫酸軟骨素A或者C的分子量為2 lOkDa。
圖1為從肝素黃桿菌中PCR擴增得到的硫酸軟骨素酶AC基因電泳圖譜。
圖2為轉化子PCR驗證電泳圖譜。圖3為轉化子酶切驗證電泳圖譜。圖4為pMAL-ChSase AC在7種不同的大腸桿菌(E.coli)宿主中的表達情況:A表示不同宿主的0D_和總蛋白質濃度,B表示不同宿主中硫酸軟骨素酶AC融合蛋白分別以硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C為底物的酶活,C表示不同宿主中硫酸軟骨素酶AC融合蛋白分別以硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C為底物的比酶活。圖5為E.coli BL21/pMAL-ChSase AC工程菌株表達硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的SDS-PAGE圖譜以及為硫酸軟骨素酶AC融合蛋白通過直鏈淀粉樹脂親和分離的SDS-PAGE電泳圖譜。圖6為E.coli BL21/pMAL-ChSase AC的IPTG濃度優(yōu)化結果:A表示不同IPTG誘導濃度下的OD6tltl和總蛋白質濃度,B表示同IPTG誘導濃度下硫酸軟骨素酶AC融合蛋白分別以硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C為底物的酶活,C表示同IPTG誘導濃度下硫酸軟骨素酶AC融合蛋白分別以硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C為底物的比酶活。
具體實施例方式以下,對本文的實施方式進行具體說明。硫酸軟骨素酶AC融合蛋白本文涉及的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白(以下,有時也簡稱為“MBP-ChSase AC”),其融合有硫酸軟骨素酶AC和麥芽糖結合蛋白(以下,有時也簡稱為“MBP”)。本文涉及的 硫酸軟骨素酶AC可以是任何硫酸軟骨素酶AC,優(yōu)選選自金黃節(jié)桿菌(Arthrobacter aurescens)、嗜水氣單抱菌(Aeromonas Iiquefaciens)及肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)來源的硫酸軟骨素酶AC。根據(jù)本文的一個優(yōu)選的實施方案,硫酸軟骨素酶AC是肝素黃桿菌來源的硫酸軟骨素酶;特別地,硫酸軟骨素酶AC是去除了編碼信號肽堿基的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,本文硫酸軟骨素酶AC具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸。硫酸軟骨素酶AC融合蛋白中,硫酸軟骨素酶AC可以直接與麥芽糖結合蛋白融合,也可以通過連接部分與所述硫酸軟骨素酶連接。優(yōu)選通過肽段連接部分來連接。肽段連接部分是本領域技術人員可以確定的,該肽段連接部分的長度可以至少為I個氨基酸以上,優(yōu)選為3個氨基酸以上。對于構成該肽段連接部分的氨基酸沒有特別限定,優(yōu)選,由甘氨酸、絲氨酸、或丙氨酸這樣中性的氨基酸重復構成。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,該肽段連接部分為SEQ ID NO:3所示的序列。本文一個優(yōu)選的實施方案,該肽段連接部分連接在硫酸軟骨素酶AC的N端,在進一步優(yōu)選的實施方案中,該肽段連接部分連接在SEQ ID NO:1的氨基酸的N端。本文涉及的麥芽糖結合蛋白可以是任何本領域普通技術人員能夠得到的麥芽糖結合蛋白。優(yōu)選來自于大腸桿菌的麥芽糖結合蛋白。來自大腸桿菌的天然的MBP能夠與麥芽糖特異吸附,參與大腸桿菌對麥芽糖的轉運和利用。MBP不但能與直鏈淀粉結合,實現(xiàn)親和分離,也能與馬鈴薯淀粉實現(xiàn)親和分離,從而可以大大降低酶的分離純化成本,有利于實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模的分離純化。在一個更優(yōu)選的實施方案中,本文的麥芽糖結合蛋白具有SEQIDNO:2所示的氨基酸。
優(yōu)選,本文的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸。此外,根據(jù)本發(fā)明的一個方面,得到的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白不需要將麥芽糖結合蛋白部分切除,具有硫酸軟骨素酶AC的活性,可以直接用作硫酸軟骨素酶AC的替代物。DNA本文還涉及一種編碼上述所有硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的DNA,其是該融合蛋白的編碼序列。用于本說明書的術語“編碼序列”的意思是直接指定其蛋白質產物的氨基酸序列的核苷酸序列。編碼序列的邊界通 常由開讀框決定,所述開讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始密碼子例如GTG和TTG開始,并且以終止密碼子例如TAA、TAG和TGA結束。編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,DNA具有SEQ ID NO: 5所示的堿基序列。重鉬載體本文還涉及重組載體,其包含編碼上述硫酸軟骨素酶AC融合蛋白DNA。本文涉及的重組載體包含編碼上述所有的融合蛋白的DNA序列、啟動子、轉錄和翻譯終止信號。本文中所述的DNA序列可以和其它調控序列結合在一起,產生重組載體,該載體可以包括一個或多個(數(shù)個)方便的限制位點以允許在這些位點插入或取代編碼肽段的DNA序列。備選的,可以通過在適當?shù)挠糜诒磉_的載體中插入包含所述氨基酸序列的DNA序列來表達本文的DNA序列。在制備重組載體的過程中,將編碼序列導入載體中,從而將該編碼序列與適當?shù)谋磉_調控序列可操作地連接。啟動子、轉錄信號、翻譯終止信號以及其它調控序列是任何本領域普通技術人員能夠可以根據(jù)常規(guī)選擇而確定的。重組載體可以是任何載體(例如,質?;虿《?,其能夠方便地進行重組DNA步驟,并且能夠產生核苷酸序列的表達。載體的選擇將通常依賴于載體與將引入該載體的宿主細胞的相容性。載體可以是線狀或閉合環(huán)狀質粒。載體可以是自主復制載體,例如,質粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以含有任何用于確保自復制的構建?;蛘?,載體可以是一種當被引入宿主細胞中時,整合到基因組中并且與整合了該載體的染色體一起復制的載體。此外,可以使用單獨的載體或質?;騼蓚€或更多個載體或質粒,其共同含有待引入宿主細胞基因組的完整DNA,或可以使用轉座子。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,本文的重組載體是pMAL_c2x。優(yōu)選,該重組載體是通過以下步驟構建:將SEQ ID NO:5所示的DNA片段插入質粒pMAL_c2x的多克隆位點,得到重組載體。轉化體本文還涉及轉化體,其是將包含編碼上述硫酸軟骨素酶AC融合蛋白DNA導入宿主細胞而得到的轉化體。本文涉及的轉化體可用于蛋白質的生產,通過將包含本文DNA序列的載體導入宿主細胞而得到該轉化體,并在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)該轉化體,可以用來生產所需要的目標蛋白質。術語“宿主細胞”包括母體細胞的任何后代,其由于復制過程中發(fā)生的突變而不同于母體細胞。宿主細胞可以是在本文的肽段的重組產生中有用的任何細胞,例如,原核或真核細胞。原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于,芽孢桿菌屬、鏈球菌屬、鏈霉菌屬、葡萄球菌屬、腸球菌屬、乳酸菌屬、乳球菌屬、梭菌屬、地芽孢桿菌屬和海洋芽孢桿菌屬。革蘭氏陰性細菌包括但不限于,大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門氏菌屬、彎曲桿菌屬、螺桿菌屬、黃桿菌屬、梭桿菌屬、泥桿菌屬、奈瑟氏菌屬和脲原體屬。細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌屬細胞。在本文的實施中有用的芽孢桿菌屬細胞包括但不限于,嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈球菌屬細胞。在本文的實施中有用的鏈球菌屬細胞包括但不限于,似馬鏈球菌、釀膿鏈球菌、乳房鏈球菌和馬鏈球菌獸瘟亞種細胞。細菌宿主細胞還可以是任何鏈霉菌屬細胞。在本文的實施中有用的鏈霉菌屬細胞包括但不限于,不產色鏈霉菌、除蟲鏈霉菌、天藍鏈霉菌、灰色鏈霉菌和淺青紫鏈霉菌細胞。宿主細胞還可以是真核生物,如哺乳動物、昆蟲、植物或真菌細胞。在一個具體的方面,宿主細胞是真菌細胞。在一個具體的方面,真菌宿主細胞是酵母細胞。在另一個具體的方面,真菌宿主細胞是絲狀真菌細胞。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,細菌宿主細胞是大腸桿菌。根據(jù)進一步優(yōu)選的實施方案,細菌宿主細胞是大腸桿菌BL21。構建硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法本文還涉及一種構建硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,包括(i).提供含麥芽糖結合蛋白的質粒載體;和(ii).將硫酸軟骨素酶AC的基因連接到上述載體上。
`
本文的另一實施方式涉及構建硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,其中,該硫酸軟骨素酶AC的N端通過肽段連接部分與麥芽糖結合蛋白結合。其中涉及的質粒載體如上文所述。純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法本文還涉及純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,其包括:a.利用直鏈淀粉樹脂吸附含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物的步驟,以及b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的步驟。本文涉及的純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,在所述a和b之前,該方法還包括:提供含麥芽糖結合蛋白的質粒載體;將硫酸軟骨素酶AC的基因連接到上述質粒載體上提供重組載體;將重組載體導入宿主細胞而得到轉化體;以及利用培養(yǎng)基培養(yǎng)該轉化體并獲得所述含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物。其中,轉化體的培養(yǎng)可以使用包含碳源、氮源、無機鹽、各種維生素等的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基來進行,作為碳源,可以使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖等糖類,乙醇、甲醇等醇類,檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸等有機酸類,廢糖蜜等。作為氮源,可以單獨或混合使用例如氨氣、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、尿素等。此外,作為無機鹽,可以使用例如磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等。此外,培養(yǎng)基中可以添加蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白氨基酸、生物素等各種維生素等營養(yǎng)素。此外,在培養(yǎng)中,可優(yōu)化培養(yǎng)基的氮源、碳源、無機離子,從而能夠進一步促進細菌的生長和融合蛋白的表達。培養(yǎng)通常在通氣攪拌、振蕩等需氧條件下進行。對培養(yǎng)溫度沒有特殊限制,只要是宿主微生物能夠生長繁育的溫度即可,此外,對培養(yǎng)過程中的PH也沒有特殊限制,只要是宿主微生物能夠生長繁育的PH即可。培養(yǎng)中的pH調整可以通過添加酸或堿來進行。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,對上述的轉化體培養(yǎng)是在誘導的條件下進行的培養(yǎng),由此表達得到硫酸軟骨素酶AC。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,上述誘導培養(yǎng)的條件是:0 ImM的IPTG。根據(jù)本文另一個優(yōu)選的實施方案,上述誘導培養(yǎng)的條件是:0.025mM的IPTG。在一個進一步優(yōu)選的實施方案中,上述誘導培養(yǎng)條件是:10 42°C誘導培養(yǎng)15 28小時。在一個更優(yōu)選的方面,上述誘導培養(yǎng)條件是:15°C誘導培養(yǎng)23小時。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,進行上述誘導培養(yǎng)的培養(yǎng)基的溶劑是水,溶質是10g/L NaCl,5g/L酵母提取物,10g/L蛋白胨和100 μ g/L氨芐青霉素。對于制備含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物的方法,沒有特別地限制,可以使用各種的方法。通常,可以如下制備:利用上述的適當?shù)呐囵B(yǎng)基培養(yǎng)的轉化體,通過使用超聲波、壓榨、滲透壓沖擊等物理方法,或者利用了表面活性劑等化學方法,或者酶處理等破碎或可溶化,以及離心分離或過濾等操作,從而得到含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,將上述培養(yǎng)的轉化體培養(yǎng)物菌體米用超聲波、壓榨、滲透壓沖擊等物理方法進行破碎而得到含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物。根據(jù)本文 一個優(yōu)選的實施方案,采用超聲破碎獲得含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,采用滲透壓沖擊獲得含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物。在一個更優(yōu)選的實施方案中,滲透壓沖擊是在含有20 40 %蔗糖,30mMTris-HCl,ImM EDTA的緩沖液中進行的。根據(jù)本文一個優(yōu)選的實施方案,將是上述含硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物通過直鏈淀粉樹脂(amylose樹脂)實現(xiàn)一步親和分離。直鏈淀粉樹脂是任何本領域普通技術人員能夠可以根據(jù)常規(guī)選擇而確定的,可以使用可以商購的直鏈淀粉樹脂,例如MBPTrap HP(商品號28-9187-78,GEHealthcare0在一個優(yōu)選的實施方案中,通過直鏈淀粉樹脂的上清液的流速為0.5ml/min。在一個優(yōu)選的實施方案中,用于洗脫的麥芽糖的濃度為IOmM0在一個優(yōu)選的實施方案中,用于洗脫的麥芽糖的流速為0.5ml/min。在一個優(yōu)選的實施方案中,該直鏈淀粉樹脂是經(jīng)過預平衡的。低分子暈硫酸軟骨素A或者C的生產方法本文涉及生產低分子量硫酸軟骨素A或C的方法,其包括:使用硫酸軟骨素酶AC融合蛋白降解硫酸軟骨素A或C原料、生產低分子量硫酸軟骨素A或者C的方法,其中得到的低分子量硫酸軟骨素A或C的分子量為0.5kDa 25kDa,優(yōu)選為2kDa lOkDa。當將硫酸軟骨素的分子量降低至2kDa IOkDa時,其藥效更為明顯,對防止動脈粥樣硬化、風濕性炎癥和傷口愈合有更好的療效。用于生產硫酸軟骨素的底物可以任意選擇,這要是能夠被硫酸軟骨素酶AC降解的底物均可??梢赃x自:硫酸軟骨素A、硫酸軟骨素C、以及透明質酸中的任何。根據(jù)本文的一個優(yōu)選的技術方案,硫酸軟骨素選自硫酸軟骨素A或硫酸軟骨素C。生產硫酸軟骨素的底物的濃度是本領域技術人員可以根據(jù)所添加的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的濃度而適當確定的。硫酸軟骨素與硫酸軟骨素酶AC融合蛋白反應的時間也可以根據(jù)目標的低分子量硫酸軟骨素的分子量來進行確定。實施例下面結合具體實施例對本文作進一步說明,但本文并不限于以下實施例。下述實施例中,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。所述引物合成及測序工作均由Invitrogen生物技術有限公司完成,所有的限制性內切酶均購自NewEngland Biolabs公司;Pfu酶及dNTP購自TaKaRa公司;所有感受態(tài)細胞(如:DH5 a、TBl和ToplO)購自北京全式金生物技術有限公司);硫酸軟骨素酶AC酶活測定底物硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C購自南京奧多福尼生物科技有限公司,其它的化學藥品均為一般分析純試劑,購自國藥集團化學試劑有限公司。實施例1、硫酸軟骨素酶AC融合蛋白(MBP-ChSase AC)的表達一、去除信號肽的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC編碼序列的克隆表達載體pMAL-ChSase AC構建的具體過程如下:1、引物的設計及合成經(jīng)Genbank查詢得到肝素`黃桿菌硫酸軟骨素酶AC的DNA序列(Tkalec, A.L.,Fink, D.,Blain, F.,Zhang-Sun, G.,Laliberte, M.,Bennett,D.C.,Gu, K.,Zimmermann,J.J.and Su, H.1solation and expression in Escherichia coli of cslAand cslB,genes coding for the chondroitin sulfate-degrading enzymeschondroitinase ACand chondroitinase B,respectively, from Flavobacteriumheparinum.Appl.Environ.Microbiol.2000,66 (I),29-35),再根據(jù)去除編碼信號肽堿基的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC的DNA序列設計引物,并在引物序列中引入限制性內切酶Sac I和EcoR I的識別位點,所用的上下游引物分別為:上游引物Pl:5,-TATGAGCTCTCAGCAGACCG GTACTGCAGAAC-3’ (SEQ ID NO:6)(帶下劃線的堿基為Sac I的酶切位點),下游引物P2:5’ -CGCGAATTCTTACTATTTCAGT TCAACCGTTGC-3’ (SEQ ID NO:7)(帶下劃線的堿基為EcoR I的酶切位點),擴增后,即分別引入SacI和EcoRI酶切位點。2、PCR擴增去除信號肽的肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC的編碼序列PCR擴增的反應體系為:50ng肝素黃桿菌基因組DNA模版,IOOpmol每種引物,IX擴增緩沖液(北京天為生物技術有限公司),200 μ mol/L每種dNTP,I單位高保真Pfu酶;擴增程序為:94攝氏度預變性5分鐘,94攝氏度變性I分鐘,68、65.7、62.9、59.5、56.8和54攝氏度引物退火I分鐘,72攝氏度延伸3分鐘,30個循環(huán)后,72攝氏度延伸10分鐘結束反應。該PCR結果如圖1所示,表明擴增得到了 2kb的硫酸軟骨素酶AC基因片段,測序表明,擴增產物的核苷酸序列如序列表中序列I的第1114-3153位所示(命名為ChSase AC)。圖1中,泳道1-6分別為退火溫度為68、65.7、62.9、59.5、56.8和54攝氏度擴增結果,泳道M 為分子量 marker (條帶大小依次為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、lkb、800bp),箭頭所指處為2kb目標片段。3、構建含有目的片段的克隆載體參照試劑盒說明書進行操作,將步驟一中2中的PCR擴增的目的片段直接亞克隆入載體pMD -19T Simple (TaKaRa公司)中,得連接產物。4、轉化大腸桿菌及陽性克隆轉化子的篩選及測序將步驟3獲得的連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,具體方法為:將10 μ I的連接產物與100 μ I的大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細胞混勻,冰浴30分鐘,42攝氏度熱激90秒,冰浴10分鐘,然后加入800 μ I含100 μ g/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨3g,酵母提取物1.5g,NaCl 3g,水285mL)中,180rpm、37攝氏度振搖60分鐘,涂于含100 μ g/L氨芐青霉素的LB抗性培養(yǎng)平板(蛋白胨3g,酵母提取物1.5g,NaCl 3g,瓊脂粉4.5g,水285mL, 16 μ I Χ-gal和4 μ I IPTG/平板)進行藍白斑篩選。37攝氏度培養(yǎng)12 20小時。挑選白斑并以此為模版,用引物Pl和P2進行菌落PCR鑒定,PCR反應體系及反應條件與步驟2相同。反應結束后,對擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,可含轉化子的陽性克隆。將篩選得到的陽性克隆轉至5mL含0.05mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37攝氏度、220rpm振搖12小時,將菌液交由Invitrogen生物技術有限公司進行測序,將含有具有序列表中SEQ ID NO:5第1114-3153位核苷酸序列的硫酸軟骨素酶AC蛋白編碼基因的pMD -19T Simple 重組載體命名為 pMD-19-ChSase AC。二、重組大腸桿菌表達載體的構建以pMD-19-ChSase AC質粒為模版,用引物Pl和P2進行PCR擴增肝素黃桿菌硫酸軟骨素酶AC的基因,PCR反應體系及反應條件與步驟一中2相同。將pMAL-c2x載體(購自美國New England Biolabs公司和PCR產物(以pMD-19-ChSase AC質粒為模版的擴增產物)分別用Sac I和 EcoR I雙酶切,用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)連接,轉化DH5 α,以Pl和Ρ2為引物,通過菌落PCR篩選轉化子(如圖2所示),提取可得到2kb PCR產物的轉化子中的pMAL_c2x重組載體,分別通過Sac I和EcoR I雙酶切驗證(如圖3所示)。圖 2 中 M 為分子量 marker (條帶大小依次為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、lkb、800bp、500bp),泳道1、2、3為PCR驗證的轉化子,箭頭所指處為硫酸軟骨素酶AC基因條帶。圖 3 中 M 為分子量 marker (條帶大小依次為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、lkb、800bp、500bp、300bp),泳道 1、3、5、7 為正確連接的重組質粒 pMAL-ChSase AC,泳道 2、4、5、8分別為重組質粒pMAL-ChSase AC被Sac I和EcoR I雙切后電泳圖,箭頭所指處為硫酸軟骨素酶AC基因條帶。將通過Sac I和EcoR I雙酶切得到的2kb片段的質粒進行測序,將含有具有序列表中序列I的第1114-3153位核苷酸序列的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白編碼基因的 pMAL-c2x 重組載體命名為 pMAL-ChSase AC。在 pMAL-ChSase AC 中,ChSase AC 基因與IacZa基因之間有兩個連續(xù)的終止密碼TAGTAA,從而能夠有效地終止蛋白質翻譯不會表達IacZ a蛋白。三、硫酸軟骨素酶AC融合蛋白MBP-ChSase AC的表達提取步驟二中含有pMAL-ChSase AC的大腸桿菌DH5a中的質粒,按照常規(guī)方法轉化大腸菌 TBU ToplO, JM109、BL21、BL21 (DE3)和 BL21 (DE3) (plysS)。除 E.coli TBl感受態(tài)細胞制作按照《分子克隆實驗指南》中氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的說明完成外,E.coli T0P10、E.coliDH5a、E.coli JM109、Ε.coli BL21、Ε.coli BL21(DE3)、Ε.coliBL21(DE3) (plysS)感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。經(jīng)過氨芐青霉素篩選和利用步驟一中步驟I提供的引物進行菌落PCR鑒定,得到含有pMAL-ChSaseAC 的大腸桿菌 TBl、ToplO, JM109、BL21 (DE3)和 BL21 (DE3) (plysS),即 TBl/pMAL-ChSaseAC、ToplO/pMAL-ChSase AC、JM109/pMAL_ChSase AC, BL21/pMAL-ChSase AC、BL21 (DE3) /pMAL-ChSase AC、BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-ChSase AC 和 DH5 a /pMAL-ChSase AC 作為表達MBP-ChSase AC 的工程菌。以質粒 pMAL-c2x 轉化大腸桿菌 TBl、ToplO, JM109、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3)(plysS)和 DH5 α,得到空載體對照 TBl/pMAL_c2x、ToplO/pMAL_c2x、JM109/pMAL_c2x、BL21/pMAL-c2x、BL21 (DE3) /pMAL_c2x、BL21 (DE3) (plysS) /pMAL_c2x 和 DH5 a /pMAL_c2x。以下操作對上面的工程菌平行進行。將空載體對照和工程菌分別在含氨芐青霉素抗性的LB培養(yǎng)基(NaC110g/L,酵母提取物為5g/L,蛋白胨10g/L,含100 μ g/L氨芐青霉素)37攝氏度培養(yǎng)2.5小時后,加入終濃度為0.24mM IPTG 15攝氏度誘導25小時。lOOOOrpm,10分鐘離心收集菌體并用50mMTris-HCl (pH 8.0)洗滌兩次,重懸至OD600約為8.000附近。將上面OD600約為8.000重懸液進行超聲破碎(輸出功率為300W,每次超聲3秒和間歇3秒的處理198次),12000rpm,30分鐘離心,超聲破碎后離心所得的上清液即為含硫酸軟骨素酶AC的粗產物。酶活力(單位為IU/L)的檢測采用232nm的光吸收法,IIU的酶活定義為30攝氏度每分鐘產生I μ mo I不飽和鍵的反應效力。取硫酸軟骨素A或硫酸軟骨素C底物溶液0.5ml (lg/L硫酸軟骨素A或者硫酸軟骨素C,50mMTris-HCl,pH 8.0),加入上步中所得的一定體積的粗產物,其他體積以50mMTris-HCl,pH 8.0緩沖液補充,最終的反應體積為1.5ml,測單位時間內在232nm的吸光度變化ΛΑ232。消光系數(shù)ε = 3800Μ'比酶活(單位為IU/mg蛋白)的定義為酶活力與粗產物蛋白濃度(單位為mg/L)的比值。蛋白濃度監(jiān)測采用常規(guī)的Bradford法。以硫酸軟骨素A或者C為底物的宿主優(yōu)化結果如圖4所示,空載體對照菌株TBl/pMAL-c2x、ToplO/pMAL-c2x、JM109/pMAL_c2x、BL21/pMAL_c2x、BL21 (DE3)/pMAL_c2x、BL21 (DE3) (plysS) /pMAL-c`2x和DH5 a /pMAL-c2x誘導培養(yǎng)后無酶活,工程菌都表達出了有活性的可溶性MBP-ChSase AC融合蛋白。并且經(jīng)過測序,表達出的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID No:4所示;并且該融合蛋白MBP-ChSase AC中的MBP的氨基酸序列如SEQID No:2所示;該融合蛋白中的ChSase AC的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示??梢园l(fā)現(xiàn),無論以硫酸軟骨素A還是硫酸軟骨素C為底物,E.coli BL21具有最高的酶活,因此最佳宿主為E.coli BL21。對最佳宿主E.coli BL21表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳:取上述超聲破碎后離心所得的上清夜(粗產物)100 μ I做可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳,取上述超聲破碎后離心所得的沉淀來做不可溶蛋白組分SDS-PAGE電泳。結果如圖5所示,圖5中M為marker (由上至下分子量依次均為230kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa),1-4 分別為 E.coli BL21/pMAL-ChSaseAC 的全細胞、不可溶蛋白、可溶蛋白、直鏈淀粉柱純化蛋白組分,箭頭所指處為融合蛋白MBP-ChSaseAC (117.97kDa)。此外,嘗試使硫酸軟骨素酶AC的C端與MBP融合,但未獲得融合蛋白。實施例2、通過對誘導劑IPTG濃度和對培養(yǎng)基成分講行優(yōu)化來提高硫酸軟骨素酶AC融合蛋白MBP-ChSase AC的表汰量和酶活選用實施例1中的最優(yōu)表達宿主E.coli BL21/pMAL-ChSase AC,通過對誘導劑IPTG濃度進行優(yōu)化,大幅度提高了硫酸軟骨素酶AC融合蛋白MBP-ChSase AC的表達量,提高了單位發(fā)酵液中的酶活。菌體培養(yǎng)、破碎、蛋白質量測定及酶活測定同實施例1步驟三。得到的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白可以直接用來測定硫酸軟骨素酶AC的活性,未切除麥芽糖結合蛋白部分。圖6示出了以硫酸軟骨素A或者C為底物,對IPTG濃度進行優(yōu)化時的結果??梢园l(fā)現(xiàn),誘導E.coli BL21/pMAL-ChSase AC表達的最優(yōu)IPTG濃度為0.025mM。當誘導劑IPTG的濃度為0.025mM時,以硫酸軟骨素A和硫酸軟骨素C為底物時的酶活分別可以達到3008.29IU/L發(fā)酵液(以硫酸軟骨素A為底物)和3031.47IU/L發(fā)酵液(硫酸軟骨素C為底物),蛋白表達量可以達到654.61mg/L發(fā)酵液,比酶活可達4.60IU/mg(以硫酸軟骨素A為底物)和4.63IU/mg (以硫酸軟骨素C為底物)。進一步,通過對培養(yǎng)基的氮源、碳源、無機離子進行優(yōu)化,可以進一步提高酶活,以硫酸軟骨素A為底物時酶活可以達到10800IU/L發(fā)酵液;以硫酸軟骨素C為底物時可以達到10700IU/L發(fā)酵液。實施例3、通過肓鏈淀粉柱純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白MBP-ChSase AC本文利用的融合伴侶(fusion partner)麥芽糖結合蛋白MBP能夠與直鏈淀粉親和吸附實現(xiàn)一步分離。具體的親和分離步驟如下:將終濃度為0.24mMIPTG誘導表達23小時的菌體IOOmL, IOOOOrpm離心10分鐘;同時設未誘導表達的菌體對照。接著按以下兩個方案分別操作:方案一: 用柱平衡液Column buffer (20mM Tris-HCl, 200mM NaCl, pH7.5)洗滌兩次,重懸在5mL Column buffer中,進行超聲破碎(輸出功率為300W,每次超聲3秒和間歇3秒的處理99次)。方案二:滲透壓沖擊。將菌體重懸在IOOmL滲透壓沖擊緩沖液I (osmoticshockbuffer I)中(20-40%蔗糖,30mM Tris-HCl, ImM EDTA) 15 分鐘,攪拌。IOOOOrpm 離心 10分鐘,然后重懸在等體積0.5mM硫酸鎂中,冰浴10-15分鐘,lOOOOrpm,離心10分鐘。離心后上清液以0.5ml/min通過2ml預平衡的直鏈淀粉親和分離柱,通過IOmM0.5ml/min麥芽糖洗脫并收集。目標蛋白經(jīng)過直鏈淀粉(amylose)樹脂吸附后,用IOmM麥芽糖在I個柱體積下能夠將目標蛋白洗脫。結果如圖5所示,表明經(jīng)過直鏈淀粉樹脂一步純化后目標蛋白可占90%以上。圖5中,M為marker (由上至下分子量依次均為230kDa、150kDa、100kDa、80kDa、60kDa、50kDa、40kDa、30kDa、25kDa),1-4分別為E.coli BL21/pMAL-ChSase AC的全細胞、不可溶蛋白、可溶蛋白、直鏈淀粉柱純化蛋白組分,fir頭所指為目標蛋白(117.97kDa)。綜上,通過融合蛋白首次實現(xiàn)硫酸軟骨素酶AC在大腸桿菌中70%以上有活性、正確折疊的可溶蛋白形式存在;實施例的結果說明利用麥芽糖結合蛋白(MBP)作為融合標簽,克服了 His-tag標簽的缺點,具有起始轉錄效率高、顯著提高酶重組表達的可溶性等優(yōu)點。本文還可通過親和分離實現(xiàn)了該融合蛋白的一步純化。與現(xiàn)有技術中使用的魚精蛋白沉淀(參考 ANA LYDIA TKALEC, DOMINIQUE FINK 等人,Isolation andExpression in Escherichia coli of cslA and cslB,Genes Coding forthe ChondroitinSulfate-Degrading Enzymes Chondroitinase AC andChondroitinase B, Respectively,from Flavobacterium heparinum.APPL.ENVIRON.MICROBIOL.2000,66 (I):29-35)和一步柱純化法相比(參見表I),可以大大縮短純化需要的時間,并且純化所用的設備明顯減少,降低了純化硫酸軟骨素酶的生產成本。利用直鏈淀粉樹脂的純化僅需要進行2個小時左右,即可獲得能夠用于工業(yè)生產的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白。純度達到可以應用的95 %以上。表I魚精蛋白沉淀和一步柱純化法相比
權利要求
1.一種硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中融合有硫酸軟骨素酶AC和麥芽糖結合蛋白。
2.根據(jù)權利要求1所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述硫酸軟骨素酶AC具有SEQ ID NO:1所示的序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述麥芽糖結合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的序列
4.根據(jù)權利要求1 3中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中,所述麥芽糖結合蛋白通過肽段連接部分與所述硫酸軟骨素酶AC連接。
5.根據(jù)權利要求4所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中,所述連接部分具有SEQIDNO: 3所示的序列。
6.根據(jù)權利要求4所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述連接部分連接在SEQIDNO:1的氨基酸的N端。
7.根據(jù)權利要求1 6中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白,其中所述融合蛋白具有SEQ ID NO:4所示序列。
8.一種硫酸軟骨素酶AC的替代物,其是權利要求1 7中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白。
9.一種純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法,其包括: a.利用直鏈淀粉樹脂吸附含權利要求1 7中任一項所述的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的粗產物,以及 b.利用麥芽糖洗脫純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白。
10.硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的用途,用來代替硫酸軟骨素酶AC。
全文摘要
本文公開了一種硫酸軟骨素酶AC融合蛋白、其編碼基因以及其構建方法。本文提供的硫酸軟骨素酶AC融合蛋白包括麥芽糖結合蛋白。此外本文還提供了純化硫酸軟骨素酶AC融合蛋白的方法。另外,本文還涉及一種生產低分子量硫酸軟骨素A或C的方法。
文檔編號C12N1/15GK103103174SQ20111035818
公開日2013年5月15日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權日2011年11月11日
發(fā)明者李曄, 吳敬君, 邢新會, 張翀 申請人:清華大學