專利名稱：一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生態(tài)環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，主要涉及一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因作物的研制與應(yīng)用是提高我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率、有效解決我國(guó)的糧食安全問題的重要途徑。轉(zhuǎn)基因作物的釋放與規(guī)模生產(chǎn)對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境可能產(chǎn)生一定的影響，客觀評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的可能影響是轉(zhuǎn)基因作物研究和發(fā)展的重要基礎(chǔ)和現(xiàn)實(shí)問題。土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的載體，轉(zhuǎn)基因作物種植與土壤生態(tài)系統(tǒng)間將發(fā)生一系列交互作用，轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物可通過多種途徑進(jìn)入土壤生態(tài)系統(tǒng)，其中最直接的途徑有1)根系分泌物轉(zhuǎn)基因作物根系表達(dá)的毒素蛋白和根系分泌物不斷地向作物根際周圍土壤釋放外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物；2)作物殘茬轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物可通過收割前后遺留在田間的根茬和殘枝落葉等進(jìn)入土壤；3)轉(zhuǎn)基因作物花粉的散布使外源基因逃逸并進(jìn)入土壤。轉(zhuǎn)基因作物的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入土壤，與土壤微生物接觸，對(duì)其產(chǎn)生不同程度的影響。研究表明轉(zhuǎn)基因作物種植會(huì)對(duì)某些特定的微生物發(fā)生影響，如抗草甘膦大豆的種植會(huì)促進(jìn)大豆根腐鐮刀菌(Fusarium spp.)的生長(zhǎng)和定殖，使該轉(zhuǎn)基因大豆品種的應(yīng)用受到一定的制約。轉(zhuǎn)Bt基因水稻(克螟稻)秸稈還田對(duì)水田土壤反硝化細(xì)菌和產(chǎn)甲烷細(xì)菌種群有顯著的抑制作用，對(duì)厭氧發(fā)酵細(xì)菌種群有顯著的刺激作用，對(duì)厭氧固氮細(xì)菌種群有輕微刺激作用。特定微生物的改變將反映在土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能上的變化，如，轉(zhuǎn)基因油菜根際微生物組成的差異導(dǎo)致轉(zhuǎn)和非轉(zhuǎn)基因油菜品種根際微生物在碳素利用方式和脂肪酸甲基酯圖譜方面明顯不同。已知多種作物的多個(gè)轉(zhuǎn)基因品系及其殘?bào)w可以改變土壤微生物群體的組成，但這些改變也同時(shí)受檢測(cè)技術(shù)、田間土壤性狀、季節(jié)變化等的影響。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)轉(zhuǎn)基因種植土壤微生物變化是評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物釋放生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的方法，為轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)安全評(píng)估提供技術(shù)手段。一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的方法，包括(1)分別采集轉(zhuǎn)基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30°C下風(fēng)干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴(kuò)增所述微生物的 16SrDNAV3片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；(3)對(duì)各生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進(jìn)行分析，得到轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化情況。 所述的溫度梯度凝膠電泳采用的凝膠溶液為放置30天后的聚丙烯酰胺凝膠溶液。所述的溫度梯度凝膠電泳的條件為電壓160-200V、溫度42-50°C，電泳時(shí)間 3-4h。所述的提取混合液中微生物的總DNA的方法為采用FastPr印核酸提取儀和 FastDNA SPIN Kit for soil 試劑盒提取。所述PCR擴(kuò)增所采用的正向引物和反向引物的堿基序列分別如SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO 2 所示。本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，TGGE圖譜條帶豐富，檢測(cè)的土壤細(xì)菌完整性強(qiáng)，且有效克服了土壤腐殖質(zhì)的干擾，能夠?qū)D(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化做出準(zhǔn)確測(cè)定。


圖1為華池B6、嘉早935、中九B種植期間不同生長(zhǎng)期的土壤樣品16S rDNA V3區(qū) TGGE指紋圖譜，其中，1-3泳道為華池B6，4-6泳道為嘉早935，7_9用到為中九B ；A分蘗期， B抽穗期，C灌漿期，D成熟期；圖2為華池B6、嘉早935、中九B第一年種植期間不同生長(zhǎng)期的土壤樣品16S rDNAV3區(qū)TGGE指紋圖譜主成分分析圖，其中A分蘗期，B抽穗期，C灌漿期，D成熟期。
具體實(shí)施例方式水稻材料Bt水稻華池B6、親本嘉早935和遠(yuǎn)緣親本中九B田間試驗(yàn)與采樣田間實(shí)驗(yàn)在浙江省建德市苗木基地進(jìn)行，試驗(yàn)田劃分為9個(gè)小區(qū)，分別種植這三個(gè)水稻品種，每個(gè)品種均設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)26-28行X 12株/行> 300株，不同品種的小區(qū)間隔設(shè)置。在水稻的分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期分別取樣。將水稻連同其根部的泥土用小鏟一起拔出并帶回實(shí)驗(yàn)室，每個(gè)小區(qū)取三株水稻樣品。取回的樣品在室溫下適度風(fēng)干后， 抖落并收集根際周圍的土壤，在除去植物殘根和石礫等雜物后，過2mm篩后備用。土壤總DNA的提取土壤總DNA的提取采用FastPr印核酸提取儀和FastDNA SPIN Kit for soil試劑盒(Qbiogene，Carlsbad，CA，USA)進(jìn)行提取，提取的土壤總DNA用的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。土壤中DNA提取的步驟按照試劑盒上的要求進(jìn)行，具體步驟如下(1)稱取0. 5g 土樣加入到裂解E管中；(2)分別加入978 μ 1磷酸鹽緩沖液(ρΗ 8. 0)和122 μ 1 MT緩沖液；(3)將裂解E管置于FastPr印FP120核酸提取儀中，振蕩速度為6. 0m/s，細(xì)胞裂解40s ； (4) 14000 Xg離心IOmin ； (5)轉(zhuǎn)移上清液到干凈的離心管中，加入250 μ 1PPS，用手上下?lián)u晃數(shù)次，使其充分混勻；(6) 14000 X g離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至2ml離心管中，加入Iml結(jié)合基體混合液；(7)旋渦振蕩5min以使結(jié)合基體與DNA充分結(jié)合，混合好后靜置3min ； (8)棄 500 μ 1上清液，將剩余的上清液和結(jié)合基體充分混勻后取680 μ 1到過濾管中，14000 X g離心lmin，棄上清液并將剩余的混合液混勻后加入到過濾管中，再14000 Xg離心Imin并將上清液倒去；(9)加入500 μ 1 SEMS-M至過濾管中，14000 Xg離心lmin，棄濾液，把過濾管重新放入收集管中，14000 Xg離心Imin去除剩余的SEMS-M洗滌液；(10)把過濾管放入新的收集管中，于室溫下干燥5min; (11)加50 μ 1 DES與過濾管中，旋渦使其充分混合，14000Xg 離心lmin，將DNA洗脫至收集管中，-20°C冰箱中保存。土壤微生物16S rDNA擴(kuò)增土壤微生物 16S rDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增的引物 Primer 1 (341f_GC)、Primer2 (534r) 由上海生工生物技術(shù)服務(wù)公司合成，其序列見表1，主要用于擴(kuò)增16rDNA V3區(qū)段。PCR 反應(yīng)體系為 51 μ 1 :DNA 模板(基因組)0. 5 μ 1 ；dNTP (10 μ M) 1. 5 μ 1 ； MgCl2 (25mM) 3.0μ 1 ；IOX buffer 5. 0 μ 1 ；Primer 1 (10 μ Μ) 1. 0 μ 1 ；Primer 2 (10 μ Μ) 1· 0 μ 1 ；Taq 酶(5U/ μ 1)0. 15 μ 1 ；ddH20 38. 75 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為95°C變性 5min，94°C變性 30s，55°C退火 45s，72°C延伸 45s，共 30 個(gè)循環(huán)，最后在72°C延伸lOmin。反應(yīng)結(jié)束后取ΙΟμΙ PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。電泳條件為120V (恒壓)，25min。表IPCR擴(kuò)增的引物
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的方法，包括(1)分別采集轉(zhuǎn)基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30°C下風(fēng)干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴(kuò)增所述微生物的 16SrDNAV3片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；(3)對(duì)各生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進(jìn)行分析，得到轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的溫度梯度凝膠電泳采用的凝膠溶液為放置30天后的聚丙烯酰胺凝膠溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的溫度梯度凝膠電泳的溫度范圍為 42 50°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增所采用的正向引物和反向引物的堿基序列分別如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化的方法，包括(1)分別采集轉(zhuǎn)基因水稻在分蘗期、抽穗期、灌漿期和成熟期的根際土壤，將根際土壤在20-30℃下風(fēng)干，過2-3mm篩后溶于緩沖液，得到混合液；(2)提取混合液中微生物的總DNA，以該總DNA為模板，PCR擴(kuò)增所述微生物的16SrDNA V3片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溫度梯度凝膠電泳分離，染色得到所述微生物的DNA指紋圖譜；(3)對(duì)各生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的DNA指紋圖譜進(jìn)行分析，得到轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的結(jié)構(gòu)變化情況。本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，有效克服了土壤腐殖質(zhì)的干擾，能夠?qū)D(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物結(jié)構(gòu)變化做出準(zhǔn)確測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102344968SQ20111036248
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者董斌, 虞云龍 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)