專(zhuān)利名稱(chēng)：一種利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄pcr監(jiān)測(cè)ivf胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種IVF(In Vitro Fertilization,試管受精)胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測(cè)方法，特別涉及以一種利用改良實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)分析IVF單個(gè)植入前胚胎的基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。
背景技術(shù)：
1978年7月25日，世界上第一個(gè)成功的“試管”嬰孩(IVF，體外受精)路易絲喜悅布朗，在英國(guó)出生。從此，IVF為全球超過(guò)占10%的不孕癥夫婦帶來(lái)了福音。發(fā)明IVF的英國(guó)科學(xué)家羅伯特愛(ài)德華茲教授被授予2010年諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)。然而，三十多年的臨 床實(shí)踐并沒(méi)有顯著提高IVF的成功率。如，2011年，美國(guó)妊娠協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)35歲病人IVF成功率(受孕率)在25-30%左右，而1997年也在30%左右。而嬰兒出生率更低。其中一個(gè)重要的原因是IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量。這是IVF胚胎質(zhì)量最重要的決定性因素之一。目前，選擇植入母體的囊胚期胚胎主要是根據(jù)胚胎的形態(tài)學(xué)特性。而迄今尚未有一種特殊的生物學(xué)標(biāo)記及監(jiān)測(cè)手段來(lái)確定培養(yǎng)液和胚胎質(zhì)量。胚胎質(zhì)量與胚胎學(xué)家的經(jīng)驗(yàn)密切相關(guān)。這種人為的選擇實(shí)際上存在潛在的危險(xiǎn)性。因?yàn)榧词褂袃?yōu)良形態(tài)學(xué)特性的胚胎仍可能存在基因突變和缺陷。如Sirtuins蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體能量代謝功能，在IVF植入前胚胎期發(fā)揮了重要的作用。Sirt3基因的缺陷誘導(dǎo)了腫瘤抑制蛋白trp53的表達(dá)而抑制了胚胎的發(fā)育。如果sirt3基因和trp53基因同時(shí)缺陷，可改善胚胎的發(fā)育。這種情況也可見(jiàn)于單獨(dú)trp53基因缺陷時(shí)，而胚胎表現(xiàn)為正常的形態(tài)學(xué)特性。在利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time quantitative reverse transcription polymerase chains reaction)方法檢測(cè)小鼠受精卵體外培養(yǎng)72-96小時(shí)后的胚胎發(fā)現(xiàn)一組胚胎中總的腫瘤抑制基因trp53mRNA總量明顯低于體內(nèi)生長(zhǎng)的同期胚胎。RNA微陣列(RNA Microarray)也顯示小鼠一組IVF囊胚期胚胎明顯比體內(nèi)生長(zhǎng)的囊胚期胚胎表達(dá)了低的trp53mRNA。目前尚未知道這組胚胎中有多少個(gè)胚胎不表達(dá)trp53，如果這個(gè)trp53基因缺陷的胚胎植入至母體，下一代的腫瘤發(fā)生率無(wú)疑將大大增高。Microarray顯示小鼠受精卵體外在Whitten氏培養(yǎng)液和KSOM+氨基酸培養(yǎng)液培養(yǎng)96小時(shí)所形成的囊胚期胚胎分別有114和29個(gè)基因表達(dá)異常。我們對(duì)目前臨床常用的三種IVF培養(yǎng)液中生長(zhǎng)成的小鼠囊胚期胚胎的分析顯示52-102個(gè)基因表達(dá)異常，異常程度非常不同，而且影響了許多關(guān)鍵的細(xì)胞功能和重要器官的發(fā)育。例如1.決定干細(xì)胞潛能性的轉(zhuǎn)錄因子，Nanog和UTFl ；2.干細(xì)胞分裂和維持功能；3.心室肌細(xì)胞的發(fā)育，肺泡細(xì)胞的發(fā)育，大腦皮層神經(jīng)元的分化和突觸的發(fā)育；4. B淋巴細(xì)胞的分化；5.細(xì)胞對(duì)DNA損傷的反應(yīng)；6.細(xì)胞清除極低密度脂蛋白的能力，等等。這說(shuō)明目如臨床常用IVF培養(yǎng)液可能存在缺陷，也就是說(shuō)迄今我們尚未有最理想的IVF培養(yǎng)液。其中主要的原因是尚未有可靠有效的手段來(lái)監(jiān)測(cè)IVF培養(yǎng)液的質(zhì)量。雖然微陣列(MiciOarray)分析提供了強(qiáng)有力的工具來(lái)分析單一實(shí)驗(yàn)過(guò)程中成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)。然而它并不適合于樣品的RNA量相當(dāng)小的時(shí)候(對(duì)于Microarray,通常每個(gè)樣品至少需要50ng RNA，我們的經(jīng)驗(yàn)需要100個(gè)以上囊胚期胚胎)。這不可能用人類(lèi)單個(gè)IVF病例的100個(gè)囊胚期胚胎作Microarray分析,換句話(huà)說(shuō),Microarray目前并不能作為人類(lèi)檢測(cè)IVF胚胎的基因表達(dá)的手段。另一種重要的情況是不同基因在卵子和各植入前胚胎期的表達(dá)形式差別很大，尤其當(dāng)被測(cè)基因的RNA轉(zhuǎn)錄子的豐度低，而且它的轉(zhuǎn)錄子壽命又較短，而這種特性可能在調(diào)節(jié)植入前胚胎期功能發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，這種瞬時(shí)表達(dá)的基因用Microarray分析技術(shù)也不易監(jiān)測(cè)到。

發(fā)明內(nèi)容
為解決RNA Microarray在基因表達(dá)分析中的不足,本發(fā)明建立了一種利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR監(jiān)測(cè)IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量的方法，所述監(jiān)測(cè)方法是利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前胚胎的基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，其利用改良的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)來(lái)有效的分析基因在單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)植入前期胚胎表達(dá)的方法，以此來(lái)監(jiān)控IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量。這種改良的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)操作要求相當(dāng)高，·但非常敏感，高度精確，同時(shí)能產(chǎn)生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補(bǔ)Microarray的不足，對(duì)分析單個(gè)關(guān)鍵基因在單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值。這種技術(shù)還提供了有效的方法去檢測(cè)那些潛在重要的瞬時(shí)表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄子，和怎樣估價(jià)并且解釋在總RNA池完成的基因表達(dá)分析的結(jié)果，不至于掩蓋那些相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子的重要信息。為達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的用于監(jiān)測(cè)IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前期胚胎的基因表達(dá)方法包括以下步驟標(biāo)本收集及純化；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)； 使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時(shí)放大擴(kuò)增陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；采用相對(duì)定量的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)量；以及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。本發(fā)明還提出了利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前期胚胎的基因表達(dá)方法中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系以及PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系，其中所述的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系具體為模板 I. 3 μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶 2. 5U,隨機(jī)引物 2. 5 μ M，dNTPs O. 5 μ M, Mg++4mM, RNase 抑制劑 0. 2U,IOx PCR緩沖液0. 4 μ I，加Mi 11 i Q超純水至終體積4 μ I。由于當(dāng)進(jìn)行人類(lèi)IVF時(shí)，不可能利用較多的受精卵和植入前胚胎期胚胎作基因表達(dá)分析。但可以從單個(gè)IVF病例中通過(guò)超細(xì)的玻璃吸管提取幾個(gè)植入前胚胎期胚胎和單個(gè)胚胎細(xì)胞作基因表達(dá)分析以評(píng)估此病例IVF胚胎質(zhì)量，確定IVF植入前胚胎的生物學(xué)指標(biāo)。本專(zhuān)利申請(qǐng)的發(fā)明人已經(jīng)應(yīng)用此方法對(duì)目前臨床常用的四種IVF培養(yǎng)液對(duì)植入前胚胎期胚胎進(jìn)行了幾個(gè)重要轉(zhuǎn)錄子基因表達(dá)分析，此方法為我們今后再確定新的IVF和體外胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)液的條件提供了一個(gè)重要的監(jiān)測(cè)手段。


通過(guò)下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。其中圖I所示為本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例的免疫熒光技術(shù)和Westernblot分析BCL2和FOS在植入前小鼠胚胎中的表達(dá)；圖2所示為本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析Bcl2和Fos基因在30個(gè)胚胎總RNA池內(nèi)的表達(dá)；圖3所示為本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例的利用改良的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測(cè)Bcl2和Fos基因在單個(gè)受精卵和二細(xì)胞期胚胎中的表達(dá)；圖4所示為本發(fā)明的改良實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR用于分析基因在單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)植入前期胚胎表達(dá)的方法的步驟示意圖。
具體實(shí)施例方式如圖4所示，根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的用于IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測(cè)的一種改良的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析基因在單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)植入前期胚胎的基因表達(dá)方法，包括以下步驟SI、收集標(biāo)本臨床常規(guī)收集標(biāo)本，經(jīng)過(guò)至少三次預(yù)冷的PBS溶液(磷酸鹽緩沖溶液)洗滌，通過(guò)超細(xì)的玻璃吸管將單個(gè)受精卵或植入前胚胎或胚胎細(xì)胞，總?cè)萘繛镺. lyL，轉(zhuǎn)移到O. 9μ L的RNA抽提液當(dāng)中，所述抽提液為IxPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制劑，經(jīng)過(guò)液態(tài)氮處理后收集全部RNA。S2、收集的 RNA 用 RQlRNase-Free DNase Kit (澳大利亞 Promega 公司生產(chǎn))進(jìn)一步純化。每個(gè)胚胎或胚胎細(xì)胞RNA用O. IIURQlRNase-Free DNase，加O. I μ L的緩沖液，經(jīng)過(guò)37°C下10分鐘，加O. I μ L終止液，95°C下I分鐘。經(jīng)過(guò)這種純化的RNA可直接用于反轉(zhuǎn)錄或儲(chǔ)存在零下80°C備用,最長(zhǎng)可儲(chǔ)備至6個(gè)月。S3、進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),其反應(yīng)體系如下
mm.1.3 μΙ
反轉(zhuǎn)錄酶2.5 U
隨機(jī)引物2.5μΜ
dNTPs0.5μΜ
Mg++4 mM
RNase抑制劑0·2 U
IOxPCR 緩沖液0.4μΙ加特殊處理過(guò)的Mi 11 i Q水至終體積4 μ I其中，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下15°C 10 分鐘 42 0C 2分鐘
I 99 0C 2分鐘
、4°C 10分鐘S4、在該條件下同時(shí)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照(不加入反轉(zhuǎn)錄酶或RNA模板)和陽(yáng)性
對(duì)照(以組織細(xì)胞RNA為模板)；S5、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，PCR反應(yīng)體系如下
模板(cDNA)2μΙ
Taq DNA polymerase0.75 IU
引物(5’和3’)1μΜ
dNTPsΟ.δμΜ
DMSO (DimethyIsuIfoxide)Ο.ΟδμΙ
Mg++2 mM
SYBR green0.1 μΙ
IOxPCR緩沖液1μΙ MiIIiQ 水
.終體積10μΙS6、使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件，其中不同基因引物優(yōu)化的條件是不同的
(包括Mg++和弓I物濃度，熔化溫度，退火溫度等)。本發(fā)明中的常用的PCR條件如下
95°C 10分鐘
95°C 15 秒〕
600C 30秒[40周期
72 0C 45 秒 J
40C 10分鐘S7、在該條件下同時(shí)放大擴(kuò)增陰性對(duì)照(不加入反轉(zhuǎn)錄酶或RNA模板)和陽(yáng)性對(duì)
照(包括Housek^per基因，如ActbjP目的基因在已知的組織細(xì)胞中的表達(dá))S8、計(jì)算出組織細(xì)胞中檢測(cè)目的基因與Houseke印er基因的閾值差(ACt)，和胚
胎中檢測(cè)目的基因與Housek^per基因的閾值差(Λ Ct)，采用相對(duì)定量2_Λ Δε 的方法檢測(cè)
目的基因的表達(dá)量。S9、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)上述的方法，本發(fā)明的一個(gè)典型的實(shí)例，是研究小鼠原癌基因BCL2和FOS在植入前胚胎的表達(dá)。BCL2和FOS是促細(xì)胞存活的基因，小鼠卵子和受精卵表達(dá)極少量的BCL2和FOS蛋白，而植入前胚胎各期表達(dá)較高水平的BCL2和FOS蛋白(如圖I所示)。常規(guī)的實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)分析能在卵子和受精卵檢測(cè)到BCL2和FOS的基因表達(dá)，但在雙細(xì)胞及其以后的植入前胚胎期并不能檢測(cè)到(如圖2所示)。通過(guò)對(duì)單個(gè)植入前胚胎期胚胎實(shí)施實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析，僅約12%左右的雙細(xì)胞胚胎表達(dá)BCL2和FOS基因(如圖3所示)。應(yīng)用這種技術(shù)使我們發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子在植入前胚胎期的瞬時(shí)表達(dá)規(guī)律，因此可有效的應(yīng)用于IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)控。 本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開(kāi)范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR監(jiān)測(cè)IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，所述監(jiān)測(cè)方法是利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前胚胎的基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，所述反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前胚胎的基因表達(dá)方法包括步驟 標(biāo)本收集及純化； 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)； 反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照； 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)； 使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件； 在該條件下同時(shí)放大擴(kuò)增陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照； 采用相對(duì)定量的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)量；以及 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析； 其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為模板I. 3 μ 1，反轉(zhuǎn)錄酶2. 5U，隨機(jī)引物2. 5μΜ，dNTPs O. 5 μ M，Mg++4mM，RNase 抑制劑 O. 2U，IOx PCR 緩沖液 O. 4 μ 1，加 Milli Q 超純水至終體積4 μ I。
2.如權(quán)利要求2所述的利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR監(jiān)測(cè)IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的反應(yīng)條件為25°C下10分鐘，然后42°C下2分鐘；然后在99°C下2分鐘以及4°C下10分鐘。
3.如權(quán)利要求I所述的利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR監(jiān)測(cè)IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，其中所述標(biāo)本收集及純化的步驟包括 臨床常規(guī)收集標(biāo)本，經(jīng)過(guò)至少三次預(yù)冷的PBS洗滌，通過(guò)超細(xì)的玻璃吸管將單個(gè)受精卵或植入前胚胎或胚胎細(xì)胞，總?cè)萘繛镺. I μ L,轉(zhuǎn)移到O. 9 μ L的RNA抽提液當(dāng)中，經(jīng)過(guò)液態(tài)氮處理后收集全部RNA ;所述抽提液為IxPCR緩沖液中加入O. IIU RNA酶抑制劑。
4.如權(quán)利要求3所述的IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測(cè)方法，其中所述標(biāo)本收集及純化的步驟包括 將收集的RNA用RQlRNase-Free DNase Kit進(jìn)一步純化，每個(gè)胚胎或胚胎細(xì)胞RNA用O. IIU RQlRNase-Free DNase，加O. I μ L的緩沖液;經(jīng)過(guò)37°〇下10分鐘，加O. I μ L終止液，95。。下I分鐘。
全文摘要
本發(fā)明提出一種利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR監(jiān)測(cè)IVF胚胎培養(yǎng)液質(zhì)量的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。所述監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液質(zhì)量的方法是利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前胚胎的基因表達(dá)來(lái)進(jìn)行IVF胚胎培養(yǎng)液的質(zhì)量監(jiān)測(cè)，所述反轉(zhuǎn)錄PCR分析IVF單個(gè)植入前胚胎的基因表達(dá)方法包括步驟標(biāo)本收集及純化；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反轉(zhuǎn)錄陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；RT產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)；使用組織細(xì)胞RNA進(jìn)行優(yōu)化PCR條件；在該條件下同時(shí)放大擴(kuò)增陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；采用相對(duì)定量的方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)量；以及進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。這種改良的實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)非常敏感，高度精確，同時(shí)能產(chǎn)生可觀的資料。利用這種方法，可以彌補(bǔ)Microarray的不足，對(duì)分析單個(gè)關(guān)鍵基因在單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)和在IVF科研與臨床上有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值。此方法為確定新的IVF和體外胚胎培養(yǎng)培養(yǎng)液的條件提供了一個(gè)重要的監(jiān)測(cè)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864213SQ20111036293
公開(kāi)日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者金星亮, 白麗君, 常菁 申請(qǐng)人:江蘇邁健生物科技發(fā)展有限公司