專利名稱：鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的pcr引物對及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對及其應用，特別涉及可以鑒定或輔助鑒定貓、牛、羊、豬、雞這五種動物中至少一種動物的組織和/或器官的 PCR引物對。
背景技術：
目前在國內生肉和肉制品的生產和銷售領域，一些不法商販為了牟取暴利，利用摻雜摻假等手段欺騙消費者的事件時有發(fā)生，比如用貓肉冒充豬肉、牛肉和羊肉等。因此一套快速、準確鑒別肉種類，并且能夠適應混合肉制品鑒定的方法，無疑會為執(zhí)法人員提供了強大的技術支撐。傳統(tǒng)的肉制品鑒定的方法主要是基于蛋白質水平的分析，包括電泳法、免疫法、 ELISA等技術。操作過程中首先需制備相應物種的抗體，然后抗原和抗體間進行免疫反應， 最后通過電泳或者顯色等方法進行鑒別。這類鑒別技術受蛋白質(主要起作用的部分為抗原決定簇)結構的影響很大，實際應用中經常出現(xiàn)的問題包括1.熱加工過程會改變蛋白質(抗原決定簇)的結構，因而無法檢測熱加工的肉類；2.對混合肉類的檢測可能出現(xiàn)交叉反應，因為不同物種蛋白質的結構可能具有某種程度的相似性，檢驗的靈敏程度取決于制備的抗體的特異性強弱?；谝陨显?，以核酸為基礎的檢測方法成為近幾年食品檢測領域的發(fā)展方向， 包括DNA分子雜交法和PCR方法等。DNA分子雜交法操作復雜，且成本較高，目前以逐漸被 PCR方法所取代。PCR方法靈敏度高、特異性強，可對混合肉類進行鑒別和區(qū)分，即使摻雜少量異種肉，也能用PCR方法加以鑒別；PCR方法可用于熱加工的肉制品鑒別當中，高溫過程僅僅打斷了核酸的片斷，并不會完全降解核酸，因而熱加工的肉制品當中仍然存在可擴增的模板，這在飼料工業(yè)肉骨粉來源的鑒別過程中得到了很好的證實；PCR反應的迅速，結果易于觀測，使得這種檢測方法目前廣泛應用在飼料、保健品的動物源性成分的鑒別當中。PCR技術中，引物設計是PCR成功的關鍵因素，好的引物將使檢測實驗更加快捷， 結果更加清晰。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對或引物對組合物，以及利用所述引物對或引物對組合物鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動物中至少一種動物的組織和/或器官的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對既可為鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，也可為在含有鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對的前提下，再含有鑒定或輔助鑒定貓、豬、牛、羊、雞組織和/或器官的5個 PCR引物對中其余四個引物對中的全部、或任意三對、或任意兩對、或任一對形成的引物對組合物。具體分為如下五種
1、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的五個引物對組成，第一對引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，第二對引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，第三對引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的 PCR引物對，第四對引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對，第五對引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。2、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的四個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，另外三個引物對為下述四個引物對中的任三個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。3、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的三個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，另外兩個引物對為下述四個引物對中的任兩個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。4、鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的兩個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，另外一個引物對為下述四個引物對中的任一個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/ 或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、豬、 牛、羊、雞中的至少一種。上述1中所述五個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 1 1 1 1;上述2中所述四個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 :1:1: 1;上述3中所述三個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 1 1 ；上述4中所述兩個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 1。5、鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。其中，序列表中的序列1由21個核苷酸組成，序列表中的序列2由18個核苷酸組成，序列表中的序列3由M個核苷酸組成，序列4由沈個核苷酸組成，序列5由M個核苷酸組成，序列6由22個核苷酸組成，序列7由22個核苷酸組成，序列8由觀個核苷酸組成， 序列9由22個核苷酸組成，序列10由22個核苷酸組成。上述動物組織和/或器官可來源于貓、豬、牛、羊、雞這五種動物中任一種動物組織和/或器官，也可以來源于貓、豬、牛、羊、雞這五種動物中的任兩種、任三種、任四種或五種動物的混合組織和/或器官。含有上述引物對組合物，或單獨的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護范圍。為了提高上述試劑盒的準確性，所述試劑盒除含有上述引物對組合物或單獨的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對外，還含有限制性內切酶，所述限制性內切酶為EcoR I和/或Hind III ；所述動物為貓、豬、牛、羊、雞中的至少一種。由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得貓肉線粒體16S rRNA基因的基因片段(如序列表中序列11所示)，該基因片段共有367個核苷酸，其中前21位和后18位分別為序列表中序列1和序列2所示上下游引物，第130-135位是Hind III的識別序列。由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列12所示)，該基因片段共有611個核苷酸，其中前M位和后沈位分別為序列表中序列3和序列4所示上下游引物，第133-138位是Hind III的識別序列。由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得牛肉線粒體DNA細胞色素C氧化酶II亞基基因的基因片段(如序列表中序列13所示)，該基因片段共有494個核苷酸，其中前M位和后22 位分別為序列表中序列5和序列6所示上下游引物，第沈3-268位是Hind III的識別序列。由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和 /或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得羊肉線粒體DNA細胞色素B基因的基因片段(如序列表中序列14所示)，該基因片段共有716個核苷酸，其中前22位和后觀位分別為序列表中序列7和序列8所示上下游引物，第253-258位是EcoR I的識別序列。由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對，可PCR擴增獲得雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和 VIII亞基基因的基因片段(如序列表中序列15所示)，該基因片段共有259個核苷酸，其中前22位和后22位分別為序列表中序列9和序列10所示上下游引物，第97-102位是Hind III的識別序列。本發(fā)明所提供的引物對組合物或引物對的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該制備方法具體可包括將所述引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。上述鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。該制備方法具體可包括如下步驟上述引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種物質包裝在同一試劑盒內PCR 反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP (dATP，dTTP，dCTP和dGTP)和限制性內切酶，所述限制性內切酶為Hind III和/或EcoR I。所述動物為貓、豬、牛、羊、雞中至少一種。利用所述引物對組合物或引物對，或所述PCR試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動物中至少一種動物組織和/ 或器官的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，利用所述引物對組合物或引物對，鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法包括下述1)和2、的步驟1)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用上述四種引物對組合物中的任一種組合物，或單獨鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的引物對進行PCR擴增；2)檢測步驟1)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產物確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官如果所述PCR產物中含有大小是330-380bp，如367bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA 片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA 片段，所述的DNA片段待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官。所述檢測所得到的PCR產物大小的方法是將所得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如367bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如611bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官； 如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-270bp之間的一條帶，如259bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官。所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種貓、豬、牛、羊、雞。利用所述PCR試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、豬、牛、羊、雞這五種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法，包括下述a)_c) 的步驟
a)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用所述試劑盒中的引物對組合物或引物對進行PCR擴增；b)檢測步驟a)得到的PCR產物的大小，根據(jù)PCR產物確定所述待測動物組織和/ 或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官的方法同上；c)對經步驟b)檢測的PCR產物進行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官的方法為下述 cl)-c5)中的至少一種cl)將所述大小是330-380bp，如367bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定，如果所述PCR擴增產物可被Hind III酶切為100_150bp和200_250bp的兩個片段，如132bp 和23^p，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；c2)將所述大小是580-640bp，如6Ilbp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定，如果所述PCR擴增產物可被Hind III酶切為100_200bp和450_550bp的兩個片段，如
和476bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；c3)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產物可被Hind III酶切為200-300bp的兩個片段，如^^p和229bp， 所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；c4)將所述大小為690_750bp，如716bp的DNA片段用EcoR I進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產物可被EcoR I酶切為200-300bp和400-500bp的兩個片段，如 255bp和461bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；c5)將所述大小為230-270bp，如259bp的DNA片段用Hind III進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產物可被Hind III酶切為50_100bp和150_200bp的兩個片段，如 99bp和160bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種貓、豬、牛、羊、雞。所述待測動物組織和/或器官具體可為結締組織(如血液)、肌肉組織。本發(fā)明的貓、豬、牛、羊、雞特異性引物，均選用了 62°C的退火溫度，實現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別。同時，PCR產物的酶切鑒定，進一步增強了檢測的精確度。本發(fā)明的檢測方法特異性強，能鑒別摻雜貓、豬、牛、羊和/或雞的組織和/或器官。整個結果清晰、可信度高。本發(fā)明的方法檢測過程耗時短，從提取基因組到酶切結束，最短僅需要8 小時的時間(樣品數(shù)量多時酌情延長)。


圖1為家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞5種肉類基因組的提取結果。其中，泳道M為 DNA分子量標準DL15000，泳道1為家貓的基因組，泳道2為民豬的基因組，泳道3為黃牛的基因組，泳道4為山羊的基因組，泳道5為土雞的基因組。圖2為貓?zhí)禺愐颬CR檢測家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder,泳道1為家貓的PCR產物，泳道2為民豬的PCR產物， 泳道3為黃牛的PCR產物，泳道4為山羊的PCR產物，泳道5為土雞的PCR產物。圖3為豬特異引物PCR檢測家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家貓的PCR產物，泳道2為民豬的PCR產物，泳道3為黃牛的PCR產物，泳道4為山羊的PCR產物，泳道5為土雞的PCR產物。圖4為牛特異引物PCR檢測家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder,泳道1為家貓的PCR產物，泳道2為民豬的PCR產物， 泳道3為黃牛的PCR產物，泳道4為山羊的PCR產物，泳道5為土雞的PCR產物。圖5為羊特異引物PCR檢測家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家貓的PCR產物，泳道2為民豬的PCR產物，泳道3為黃牛的PCR產物，泳道4為山羊的PCR產物，泳道5為土雞的PCR產物。圖6為雞特異引物PCR檢測家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder,泳道1為家貓的PCR產物，泳道2為民豬的PCR產物， 泳道3為黃牛的PCR產物，泳道4為山羊的PCR產物，泳道5為土雞的PCR產物。圖7為五個引物對組合物PCR檢測家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家貓的PCR產物，泳道2為民豬的PCR 產物，泳道3為黃牛的PCR產物，泳道4為山羊的PCR產物，泳道5為土雞的PCR產物。圖8為五個引物對PCR擴增特異性片段的酶切結果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為家貓肌肉的PCR產物，泳道2為家貓PCR產物的酶切結果，泳道3為民豬肌肉的PCR產物，泳道4為民豬PCR產物的酶切結果，泳道5為黃牛肌肉的PCR 產物，泳道6為黃牛PCR產物的酶切結果，泳道7為山羊肌肉的PCR產物，泳道8為山羊PCR 產物的酶切結果，泳道9為土雞肌肉的PCR產物，泳道10為土雞PCR產物的酶切結果。
圖9為五對引物對組合物PCR擴增摻雜貓肉的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準IOObp Ladder,泳道1為摻雜0. 1 %貓肉的豬肉的PCR產物， 泳道2為摻雜0. 1 %貓肉的牛肉的PCR產物、泳道3為摻雜0. 1 %貓肉的羊肉的PCR產物， 泳道4為摻雜0. 1 %貓肉的雞肉的PCR產物。圖10為貓?zhí)禺愋砸飳CR檢測長毛貓、短毛貓，短毛虎皮貓肌肉樣品結果。其中，泳道M為DNA分子量標準50bp Ladder,泳道1為長毛貓的PCR結果，泳道2為短毛貓的 PCR結果，泳道3為短毛虎皮貓的PCR結果。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、檢測動物純肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對以貓肉線粒體16S核糖體RNA基因為靶基因，設計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -AGCGCAACAATCAAAGCATCT-3 ‘(序列表中的序列1)，下游引物的序列為5' -CGCGGCCGTTTAACTAGC-3'(序列表中的序列2)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增家貓的靶序列如序列表中序列11所示。序列表中的序列11的第130-135位是Hind III的識別序列，PCR產物經酶切后將成為兩條片段，長度分別為132bp和23^p。以豬肉線粒體腺苷三磷酸酶VI亞基和VIII亞基基因為靶基因，設計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -CAGAATCAATTGAACTCAAAACTC-3 ‘(序列表中的序列 3)，下游引物的序列為5 ‘ -TAGTGTTGATGTTGAGTAGTGCTAAT-3 ‘(序列表中的序列4)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增民豬的靶序列如序列表中序列12所示。序列表中的序列12的第133-138位是Hind III的識別序列，PCR 產物經酶切后將成為兩條片段，長度分別為135bp和476bp。以牛肉線粒體DNA細胞色素C氧化酶II亞基基因為靶基因，設計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5‘ -CGCTTGTCTTCTTAATTAGCTCAT-3‘(序列表中的序列5)， 下游引物的序列為5‘ -GTAATATAAGCCTGGACGGGAC-3‘(序列表中的序列6)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增黃牛的靶序列如序列表中序列13所示。序列表中的序列13的第263-268位是Hind III的識別序列，PCR產物經酶切后將成為兩條片段，長度分別為265bp和229bp。以羊肉線粒體DNA細胞色素B基因為靶基因，設計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -CGGCATTCATAGGCTATGTTTT-3 ‘(序列表中的序列7)，下游引物的序列為5' -GACCGGAATGATAAGGAAATATATAATA-3'(序列表中的序列8)。該引物對即為鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增山羊的靶序列如序列表中序列 14所示。序列表中的序列14的第253-258位是EcoR I的識別序列，PCR產物經酶切后將成為兩條片段，長度分別為255bp和461bp。以雞肉線粒體DNA腺苷三磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基基因為靶基因，設計特異擴增該基因的引物對。上游引物的序列為5 ‘ -TTATCCAACCCAAACTTCTTTC-3 ‘(序列表中的序列9)，下游引物的序列為5 ‘ -TTGTTTTGTGATTAGGTGGGTG-3 ‘(序列表中的序列10)。 該引物對即為鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對。該引物對擴增土雞的靶序列如序列表中序列15所示。序列表中的序列15的第97-102位是Hind III的識別序列， PCR產物經酶切后將成為兩條片段，長度分別為99bp和160bp。二、檢測動物純肌肉樣品1、檢測樣品的制備該實驗中的樣品均是純肌肉，分別是家貓、民豬、黃牛、山羊、土雞肌肉樣品。2、利用步驟一的引物對PCR擴增線粒體基因組上的相關基因片段1)樣品基因組的提取使用北京全式金生物技術有限公司Easy Pure Genomic DNA Extraction Kit (貨號EE101-01)提取步驟1中樣品的基因組DNA。結果表明，步驟1中的所有樣品使用該試劑盒均能有效提取到基因組，提取的數(shù)量在電泳檢測時可見(如圖1)，足夠用作PCR反應的模板。2)單重PCR和五重PCR反應及電泳檢測分別以上述步驟1中各個樣品的基因組DNA為模板，利用如下五個引物對或者是所述五個引物對的組合物進行單重PCR和五重PCR 由序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA 組成的用于鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的引物對；由序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的引物對；由序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的引物對；由序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的引物對；由序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的用于鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的引物對。其中，單個引物對的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030)2.0yL，濃度為20 μ M的上游引物l.OyL，濃度為 20 μ M的下游引物1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。其中，當上游引物為序列1時，下游引物為序列2，此時PCR體系為擴增貓基因的 PCR體系；當上游引物為序列3時，下游引物為序列4，此時PCR體系為擴增豬基因的PCR體系；當上游引物為序列5時，下游引物為序列6，此時PCR體系為擴增?；虻腜CR體系；當上游引物為序列7時，下游引物為序列8，此時PCR體系為擴增羊基因的PCR體系；當上游引物為序列9時，下游引物為序列10，此時PCR體系為擴增雞基因的PCR體系。五個引物對組合物的PCR體系10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030) 2.0 μ L，濃度為20 μ M的上游引物(序列1、3、5、7和 9所示單鏈DNA)各1. 0 μ L，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8和10所示單鏈DNA) 各1. O μ L，模板(總DNA) 2. OyL, 5U/ μ L的TaqDNA聚合酶(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°C，5min 預變性；95°C，30s, 62°C，30s, 72 V，45s，擴增反應進行 30 個循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結束。將PCR反應獲得的產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為 1. 5% -2%。3、純肌肉樣品的PCR結果電泳檢測結果顯示(1)采用由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應，其中家貓的PCR擴增產物中得到一條大小330-380的條帶(圖幻，其它民豬、黃牛、山羊、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說明貓?zhí)禺愐飳Ｒ恍苑浅：?，與其他動物沒有交叉反應；沒有非特異的雜帶產生。 (2)采用由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和 /或器官的PCR引物對進行PCR反應，其中民豬的PCR擴增產物中得到一條大小580-640bp 的條帶(圖幻，其它家貓、黃牛、山羊、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說明豬特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應；沒有非特異的雜帶產生。( 采用由序列表中序列5 和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對進行 PCR反應，其中黃牛的PCR擴增產物中得到一條大小460-520bp的條帶(圖4)，其它家貓、 民豬、山羊、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說明牛特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應；沒有非特異的雜帶產生。(4)采用由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應，其中山羊的 PCR擴增產物中得到一條大小690-750bp的條帶(圖5)，其它家貓、民豬、黃牛、土雞的肌肉樣品中沒有該條帶。說明羊特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應；沒有非特異的雜帶產生。(5)采用由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對進行PCR反應，其中土雞的PCR擴增產物中得到一條大小230_270bp的條帶(圖6)，其它家貓、民豬、黃牛、山羊的肌肉樣品中沒有該條帶。說明雞特異引物專一性非常好，與其他動物沒有交叉反應；沒有非特異的雜帶產生。(6)采用五個引物對組合物在同一反應體系中進行PCR反應，其中家貓的PCR擴增產物中只有一條 330-380bp的條帶，民豬的PCR擴增產物中只有一條大小580_640bp的條帶，黃牛的PCR擴增產物中只有一條大小460-520bp的條帶，山羊的PCR擴增產物中只有一條大小690-750bp 的條帶，土雞的PCR擴增產物中只有一條大小230-270bp的條帶(圖7)。這一結果再次說明五種PCR引物對專一性非常好，與其他動物DNA沒有交叉反應，沒有非特異的雜帶產生； 另外，這一結果還表明，五種引物對可以同時使用，在檢測靈敏度方面能達到與單獨使用各引物對相同的效果，引物對組合物的形式使得一次PCR反應完成五種肉類的檢測，大大節(jié)約了檢測時間與成本。4、酶切鑒定將PCR擴增獲得的家貓、民豬、黃牛、土雞的條帶使用Hind III進行酶切反應；山羊的條帶使用EcoR I進行酶切反應。酶切體系10 X Buffer 1. O μ L，限制性內切酶0. 5 μ L，PCR產物8. 5 μ L，加雙蒸水至 20μ L。其中，當PCR產物為家貓、民豬、黃牛、土雞的條帶時，上述IOXBuffer為與Hind III匹配使用的10XBuffer (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1060A)，上述限制性內切酶為Hind 111(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1060A;當PCR產物為山羊的條帶時，上述IOXBuffer為與EcoR I匹配使用的IOXBuffer (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1040A)，上述限制性內切酶為EcoR 1(購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D1040A)。酶切反應獲得的產物進行凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為1. 5% -2%。結果顯示PCR擴增獲得的家貓肌肉的條帶被酶切為100_150bp和200_250bp的兩條條帶；PCR擴增獲得的民豬肌肉的條帶被酶切為100-200bp和450-550bp的兩條條帶； 黃牛肌肉的條帶被酶切為200-300bp的兩條條帶；山羊肌肉的條帶被酶切為200-300bp和 400-500bp的兩條條帶；土雞肌肉的條帶被酶切為50-100bp和150_200bp的兩條條帶(圖 8)。說明PCR產物符合最初的設計，不是非特異性擴增的結果，說明PCR反應結果真實有效。5、測序驗證將家貓肌肉的PCR產物進行測序，結果表明家貓(序列表中的序列11)PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家貓NC_001700的16S核糖體RNA基因片段的序列同源性達到98% 以上，大小為367bp。將民豬肌肉的PCR產物進行測序，結果表明民豬(序列表中的序列12)PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為611bp。將黃牛肌肉的PCR產物進行測序，結果表明黃牛(序列表中的序列13)PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中黃牛AY526085. 1的細胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為494bp。將山羊肌肉的PCR產物進行測序，結果表明山羊(序列表中的序列14)PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊⑶068049的細胞色素B基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為716bp。將土雞肌肉的PCR產物進行測序，結果表明土雞(序列表中的序列15) PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為259bp。上述實驗表明，本發(fā)明的檢測方法特異性強，引物之間沒有交叉反應。擴增產物符合預計的大小，且都能被設計好的限制性內切酶切割，說明擴增產物不是非特異性擴增的結果。整個結果清晰、可信度高。實施例2檢測摻雜肌肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對設計和制備方法同實施例1 一。二、檢測動物肌肉樣品1、檢測樣品的制備該實驗中的樣品是摻雜家貓肉的民豬肉、黃牛肉、山羊肉和土雞肉1)摻雜貓肉的豬肉在99.9g豬肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的豬肉。2)摻雜貓肉的牛肉在99.9g牛肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的牛肉。3)摻雜貓肉的羊肉在99.9g羊肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的羊肉。4)摻雜貓肉的雞肉在99.9g雞肉中摻雜0. Ig貓肉，制成0. 的摻雜貓肉的雞肉。2、利用步驟一的引物對PCR擴增線粒體基因組上的相應基因片段1)樣品基因組的提取制備方法同實施例1步驟二 2。2) PCR反應及電泳檢測分別以上述步驟1中各個樣品的基因組DNA為模板，以序列表中序列1、3、5、7和 9所示的上游引物和序列表中序列2、4、6、8和10所示的下游引物，進行PCR擴增反應。其PCR反應(五個引物對組合物)體系為10XBuffer 2. 0 μ L(購自寶生物工程 (大連)有限公司，貨號DROO1Α)，dATP, dTTP, dCTP和dGTP各2. 5mM的4種dNTP混合物 (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號D4030) 2.0 μ L，濃度為20 μ M的上游引物(序列 1、3、5、7和9所示單鏈DNA)各l.OyL，濃度為20 μ M的下游引物(序列2、4、6、8和10所示單鏈DNA)各1. 0 μ L，模板(總DNA) 2. 0 μ L, 5U/ μ L的I1aq DNA聚合酶(購自寶生物工程 (大連)有限公司，貨號DR001A) 0. 5 μ L，加雙蒸水至20 μ L。PCR 程序:95°c，5min 預變性；95°C，30s, 62°C，30s, 72°C，45s，擴增反應進行 30 個循環(huán)；72°C，延伸5min ；4°C，保溫結束。將PCR反應獲得的產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為 1. 5% -2%。3、摻雜貓肉的肌肉樣品檢測結果電泳檢測結果表明，摻雜0. 貓肉的豬肉中得到兩條大小分別為330_380bp和580-640bp的條帶，摻雜0. 貓肉的牛肉中得到兩條大小分別為330-380bp和460_520bp 的條帶，摻雜0. 貓肉的羊肉中得到兩條大小分別為330-380bp和690-750bp的條帶，摻雜0. 貓肉的雞肉中得到兩條大小分別為330-380bp和230-270bp的條帶(圖9)。4、測序驗證將如下PCR 產物均進行測序:230-270bp (雞)、330_380bp (貓)、460_520bp (牛)、 580-640bp (豬)、690-750bp (羊)，結果表明家貓(序列表中的序列11) PCR產物的序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫中家貓NC_001700的16S核糖體RNA基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為367bp，且在130-135位有HindIII酶切位點。民豬(序列表中的序列12) PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中家豬AP003^8. 1基因腺苷酸磷酸酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為611bp，且在133-138位有HindIII酶切位點；黃牛(序列表中的序列13)PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中黃牛AY526085. 1的細胞色素C氧化酶II亞基基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為494bp，且在沈3-268位有HindIII酶切位點；山羊(序列表中的序列14) PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中山羊⑶068049的細胞色素 B基因片段的序列同源性達到98%以上，大小為716bp，且在253-258位有EcoRI酶切位點； 土雞(序列表中的序列15)PCR產物的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中原雞AY235571. 1腺苷酸磷酸合成酶VI亞基和VIII亞基片段的序列同源性達到98%以上，大小為259bp，且在97-102 位有HindIII酶切位點。實施例3、利用鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對檢測不同貓肉樣品一、制備鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對設計和制備方法同實施例1步驟一。二、檢測各種貓肉樣品1、檢測樣品檢測樣品為長毛貓、短毛貓和短毛虎皮貓肌肉。2、利用步驟一的引物對PCR擴增線粒體基因組上的16S核糖體RNA基因片段1)樣品基因組的提取同實施例1。2) PCR 反應同實施例1。將PCR反應獲得的產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳濃度為2%。 電泳檢測結果表明長毛貓、短毛貓和短毛虎皮貓肌肉中均得到一條大小330-380bp的條帶 (圖10)。這說明貓的引物對貓類具有通用性，能適合多種貓的鑒定。3、測序驗證將所有的長毛貓、短毛貓和短毛虎皮貓肌肉的PCR產物進行測序，結果表明長毛貓(序列表中的序列16)、短毛貓(序列表中的序列17)和短毛虎皮貓(序列表中的序列 18)肌肉的PCR產物的大小均為367bp，均在第130-135位有HindIII的識別位點。
權利要求
1.鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，由獨立包裝的五個引物對組成，第一對引物是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，第二對引物是由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對，第三對引物是由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR 引物對，第四對引物是由序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對，第五對引物是由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、牛、羊、 豬、雞中的至少一種。
2.鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對組合物，為下述1)- 中任一種1)由獨立包裝的四個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，另外三個引物對為下述四個引物對中的任三個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種；2)由獨立包裝的三個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，另外兩個引物對為下述四個引物對中的任兩個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種；3)由獨立包裝的兩個引物對組成，其中一個引物對是由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，另外一個引物對為下述四個引物對中的任一個由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定豬組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定牛組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列7和序列8 所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定羊組織和/或器官的PCR引物對、由序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的鑒定或輔助鑒定雞組織和/或器官的PCR引物對；所述動物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種；
3.根據(jù)權利要求1或2所述的引物對組合物，其特征在于權利要求1所述五個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 :1:1:1: 1 ；權利要求2中1)所述四個引物對在 PCR反應體系中的摩爾比為1 :1:1: 1 ；權利要求2中2)所述三個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 1 1 ；權利要求2中3)所述兩個引物對在PCR反應體系中的摩爾比為1 1。
4.鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對，由兩條單鏈DNA組成，所述兩條 DNA單鏈分別為序列表中序列1所示的單鏈DNA，和序列表中序列2所示的單鏈DNA。
5.鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的試劑盒，其特征在于所述試劑盒含有權利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對，和限制性內切酶，所述限制性內切酶為 EcoR I和/或Hind III ；所述動物為貓、牛、羊、豬、雞中的至少一種。
6.權利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝的步驟。
7.權利要求5所述的PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對中各引物對的所述兩條單鏈DNA分別單獨包裝后，與下述物質中的至少一種包裝在同一試劑盒內PCR反應緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP和限制性內切酶；所述限制性內切酶為Hind III和/或EcoR I。
8.利用權利要求1-4中任一所述的引物對組合物或引物對鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、牛、羊、豬、雞這五種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法，包括下述(1)和的步驟所述(1)為如下A)-E)中任一步驟A)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權利要求1所述的引物對組合物進行PCR擴增；B)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權利要求2中1)所述的引物對組合物進行PCR擴增；C)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權利要求2中2、所述的引物對組合物進行PCR擴增；D)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權利要求2中幻所述的引物對組合物進行PCR擴增；E)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權利要求4所述的引物對進行PCR擴增；(2)檢測步驟(1)得到的PCR產物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產物確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官如果所述PCR產物中含有大小是330-380bp，如367bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是460-520bp，如494bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是690-750bp，如716bp的DNA片段，所述的DNA片段待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產物中含有大小是230-270bp，如259bp的DNA片段，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官；所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種貓、牛、羊、豬、雞。
9.利用權利要求5所述的試劑盒鑒定或輔助鑒定待測動物組織和/或器官中是否含有或候選含有貓、牛、羊、豬、雞這五種動物中至少一種動物組織和/或器官的方法，包括下述a)-c)的步驟a)在同一個PCR反應體系中，以待測動物組織和/或器官的基因組DNA為模板，選用 60-64°C的退火溫度，優(yōu)選為62°C，用權利要求5所述試劑盒中的引物對組合物或引物對進行PCR擴增；b)檢測步驟a)得到的PCR產物的大小，確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官，方法如權利要求8步驟( 所述；c)對經步驟b)檢測的PCR產物進行酶切鑒定，所述酶切鑒定的步驟及確定所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有哪種或哪些動物組織和/或器官的方法為下述 cl)-c5)中的至少一種cl)將所述大小是330-380bp，如367bp的DNA片段用HindIII進行酶切鑒定，如果所述 PCR擴增產物可被HindIII酶切為100_150bp和200_250bp的兩個片段，如132bp和235bp， 所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；c2)將所述大小是580-640bp，如61 Ibp的DNA片段用HindIII進行酶切鑒定，如果所述 PCR擴增產物可被HindIII酶切為100_200bp和450_550bp的兩個片段，如135bp和476bp， 所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；c3)將所述大小為460-520bp，如494bp的DNA片段用HindIII進行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴增產物可被HindIII酶切為200-300bp的兩個片段，如和229bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；c4)將所述大小為690-750bp，如716bp的DNA片段用EcoRI進行酶切鑒定的步驟，如果所述PCR擴增產物可被EcoRI酶切為200-300bp和400-500bp的兩個片段，如255bp和 461bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；c5)將所述大小為230480bp，如259bp的DNA片段用HindIII進行酶切鑒定的步驟， 如果所述PCR擴增產物可被HindIII酶切為50_100bp和150_200bp的兩個片段，如99bp 和160bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官； 所述待測動物組織和/或器官來源于下述動物中的至少一種貓、牛、羊、豬、雞。
10.根據(jù)權利要求8或9所述方法，其特征在于所述檢測所得到的PCR產物大小的方法是將所得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示330-380bp之間的一條帶，如367bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有貓組織和/或器官；如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示580-640bp之間的一條帶，如 611bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有豬組織和/或器官；如果所述PCR 產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示460-520bp之間的一條帶，如494bp，所述待測動物組織和/ 或器官中含有或候選含有牛組織和/或器官；如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示 690-750bp之間的一條帶，如716bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有羊組織和/或器官；如果所述PCR產物在瓊脂糖凝膠電泳上顯示230-280bp之間的一條帶，如 259bp，所述待測動物組織和/或器官中含有或候選含有雞組織和/或器官。
全文摘要
本發(fā)明公開了鑒定或輔助鑒定動物組織和/或器官的PCR引物對及其應用。本發(fā)明所提供的引物對為鑒定或輔助鑒定貓、牛、羊、豬和雞組織和/或器官的共五個PCR引物對中，包含鑒定或輔助鑒定貓組織和/或器官的PCR引物對在內的至少一種引物對；所述鑒定或輔助鑒定貓、豬、牛、羊和雞組織和/或器官的共五個PCR引物對依次分別由序列1和序列2所示兩條DNA單鏈、序列3和序列4所示兩條DNA單鏈組成、序列5和序列6所示兩條DNA單鏈、序列7和序列8所示兩條DNA單鏈、序列9和序列10所示兩條DNA單鏈組成。本發(fā)明五個引物對均選用了62℃的退火溫度，實現(xiàn)了在同一溫度一次PCR完成所有鑒別，且特異性強，檢測過程耗時短。
文檔編號C12N15/10GK102382891SQ20111036313
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權日2011年11月16日
發(fā)明者于雷, 侯東軍, 姜艷彬, 尹艷, 李通, 李穎, 楊紅菊, 王海 申請人:侯東軍