專利名稱:類人膠原蛋白及類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制作方法
類人膠原蛋白及類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠技術領域
本發(fā)明屬于蛋白質工程、生物醫(yī)用材料領域,具體涉及類人膠原蛋白、類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠及其制備方法。
背景技術:
整形美容行業(yè)正隨著人們生活水平的不斷提高而快速發(fā)展,隆胸、隆鼻、除皺、臉部整形等都受人追捧。目前面部整形的需求包括祛除皺紋,改善面部輪廓,填平凹陷瘢痕或唇部,修復受傷的組織等。因此,軟組織填充材料市場需求量大。
在19世紀90年代至今,人們先后研究了白蠟、脂肪移植、硅樹脂、凝膠植入體等材料用于軟組織整形,臨床應用發(fā)現都存在著硬化,瘤狀腫塊、吸收過快、慢性炎癥等問題。 近些年來,美國FDA相繼批準了幾個用于軟組織填充的產品,其主要成分為牛膠原、透明質酸鈉、PMMA小球等,已經有了較好的效果,對于部分使用者仍然存在著使用部位紅腫、過敏及降解過快等情況。
膠原蛋白,又稱為膠原,是脊椎動物體內含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白, 是脊椎動物身體結構的重要材料,也是在哺乳動物中含量最豐富的蛋白。膠原由多糖蛋白分子組成,是結締組織的主要蛋白成分,占機體總蛋白的20 30%。機體中大約一半的膠原蛋白存在于皮膚中,膠原蛋白占真皮和筋腱干重的70%,相當于體重的6%。類人膠原蛋白是將人體已知序列膠原蛋白的一段mRNA逆轉錄生成cDNA后,經過特定序列重復和修飾, 轉化于大腸桿菌中,并經過高密度發(fā)酵、分離提取及純化而得,由西安巨子生物基因技術股份有限公司發(fā)明并獨家生產。它從根本上解決了動物提取膠原蛋白的水不溶性和病毒隱患 (瘋牛病、豬瘟疫、禽流感)等問題,并且具有良好的生物學特性和功能,促新細胞形成和促上皮細胞、成纖維細胞生長功能相比動物體提取膠原蛋白優(yōu)良,免疫排異反應低。
透明質酸鈉是廣泛存在于動物和人體的生理活性物質,在人皮膚、關節(jié)滑膜液、臍帶、房水及眼玻璃體中均有分布。其溶液具有高黏彈性及仿形性,是目前公認的生物相容性極好的生物醫(yī)用材料,為眼科手術的輔助劑,并有保護角膜內皮細胞及眼內組織,減少手術并發(fā)癥,促進傷口愈合的作用。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠及其制備方法,該方法工藝簡單,所制備的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠機械性能良好、生物相容性優(yōu)異,降解時間與目前市場上同類產品相比大大延長,徹底杜絕了動物膠源材料存在的病毒隱患,保證了材料的安全性。
本發(fā)明人經過深入研究發(fā)現單純使用透明質酸鈉制備溫敏型水凝膠存在著降解速度過快,機械輕度過低的問題,不能完全滿足臨床要求,我們在透明質酸鈉的基礎上引入了類人膠原蛋白來改善單純透明質酸鈉凝膠降解過快的問題,經過反復復合試驗,得到了理想的溫敏型水凝膠,從而完成了本發(fā)明。
SP,本發(fā)明如下
1. 一種重組膠原蛋白,其由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成。
2.編碼項1所述的重組膠原蛋白的核酸。
3.導入了項2所述的核酸的載體。
4.用項3的載體轉化宿主細胞而得到的轉化體。
5. 一種類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其特征在于包括以下步驟
1)將類人膠原蛋白用注射用水溶解成質量分數為1. 0% 5. 0%的溶液;
2)將醫(yī)用透明質酸鈉用注射用水溶解成質量分數為1. 0% 2. 0%的溶液;
3)將β-甘油磷酸鈉用注射用水溶解為20% 50%的溶液;
4)將上述三種溶液按一定比例混合后,在0°C 15°C條件下攪拌10 30分鐘混合均勻,并同時將PH調整至7. 0 7. 4 ;
5)將上述混合液在無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中,即為成品。
6.根據項5所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其特征在于所述類人膠原蛋白是項1所述的重組膠原蛋白。
7.根據項5所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其特征在于所述透明質酸鈉的分子量為100萬 250萬。
8.根據項5所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其特征在于類人膠原蛋白溶液、透明質酸鈉溶液及β-甘油磷酸鈉混合過程中體積比為(1 3) (1 5) (1 2)。
9.根據項5所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其特征在于類人膠原蛋白溶液、透明質酸鈉溶液及β-甘油磷酸鈉混合過程溶液的溫度維持在 0°C 15°C。
10.根據項5所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其中,成品溶液的PH值的調節(jié)依賴于β-甘油磷酸鈉添加量。
11.根據項5所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法,其特征在于步驟5)中,所用的注射器為根據臨床需要定制的不同規(guī)格的一次性玻璃注射器。
12.通過項5 11中任一項所述的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的制備方法得到的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠。
本發(fā)明提供的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠在37°C具有良好的成膠性,成膠時間在10分鐘以內,機械強度優(yōu)于目前臨床使用的同類產品,且降解速度慢于單純的透明質酸凝膠。類人膠原蛋白的免疫排異反應更弱,而且徹底杜絕了動物源材料所不可避免的病毒隱患。
圖1動物膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠壓縮試驗結果。
圖2類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠壓縮試驗結果。
圖3動物膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠與類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠壓縮試驗結果對比。其中,對照組為動物膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠,試驗組為類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠。
圖4類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠注射小鼠皮下2周的照片。
圖5類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠注射小鼠皮下4周的照片。
圖6臺灣“雙美”膠原蛋白植入劑透明質酸鈉凝膠注射小鼠皮下2周的照片。
圖7臺灣“雙美”膠原蛋白植入劑透明質酸鈉凝膠注射小鼠皮下4周的照片。
發(fā)明的具體實施方式
本說明書中提及的科技術語具有與本領域技術人員通常理解的含義相同的含義, 如有沖突以本說明書中的定義為準。
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本發(fā)明的一個方面涉及一種重組膠原蛋白(簡稱本發(fā)明的重組膠原蛋白),其由 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。
SEQID NO:1
HDPVVLQRRDffENPGVTQLNRHLAHAHPPFASD
HPMGAPGPAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAH
GPAGALGAHGPAGPLGPAGPPGSAGAPGAHGPA
GPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAP
GPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSA
GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
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GPAGPLGAHGPAGPLGAPGPAGSAGAPGPPGAP
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GAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPP
GSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPA
GPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAPGPPGAH
GPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPLGAHGPAGPL
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GAPGPAGPPGSAGAPGPPGAPGPAGPPGSAGAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP
GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP
GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP
GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH
GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAP GAT GLS AGA THG
LVT CGL
本發(fā)明的重組膠原蛋白是中國專利申請公開CN1371919A的權利要求1所述的類人膠原蛋白,其具有三鏈、三螺旋結構,其可以采用例如該中國專利申請公開CN1371919A 中公開的基因工程表達方法來制備。本發(fā)明的重組膠原蛋白是由中國西北大學的范代娣教授發(fā)明的,因此又稱作范氏重組膠原蛋白或范氏類人膠原蛋白(Fan's Human-like Collagen,FHLC)。
此外,本發(fā)明還涉及編碼上述本發(fā)明的重組膠原蛋白的核酸。
此外,本發(fā)明還涉及導入了上述核酸的載體。
此外,本發(fā)明還涉及用上述載體轉化宿主細胞而得到的轉化體。
上述核酸、載體、轉化體可以基于本發(fā)明的重組膠原蛋白的氨基酸序列來制造,其制造方法是本技術領域公知的,例如可以參見分子克隆實驗指南第三版[美]J.莎姆布魯克著黃培堂等譯科學出版社2002年9月。
以下,通過實施例對本發(fā)明進行更具體的說明,但本發(fā)明不受這些實施例的限制。
制備例1重組膠原蛋白的制備
按中國專利申請公開CN1371919A所述方法制備了類人膠原蛋白(由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列組成),確認其分子量為約90kD。這里,將該重組膠原蛋白簡稱為類人膠原蛋白,并用于下面的實施例。
實施例1
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成1.0%的溶液,將分子量為250萬的透明質酸鈉用注射用水溶解成1. 5%的溶液,將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為20%的溶液,然后將三者按1 3 2(體積比)混合,4°C條件下攪拌均勻后真空脫泡,無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中即為成品。
實施例2
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成1. 5%的溶液,將分子量為250萬的透明質酸鈉用注射用水溶解成1. 5%的溶液,將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為25%的溶液,然后將三者按2 2 1(體積比)混合,0°C條件下攪拌均勻后真空脫泡,無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中即為成品。
實施例3
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成2. 0%的溶液,將分子量為200萬的透明質酸鈉用注射用水溶解成2. 0%的溶液,將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為30%的溶液,然后將三者按1 5 1(體積比)混合,4°C條件下攪拌均勻后真空脫泡,無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中即為成品。
實施例4
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成3. 0%的溶液,將分子量為200萬的透明質酸鈉用注射用水溶解成1. 0%的溶液,將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為45%的溶液,然后將三者按2 3 1(體積比)混合,12°C條件下攪拌均勻后真空脫泡,無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中即為成品。
實施例5
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成4. 0%的溶液,將分子量為150萬的透明質酸鈉用注射用水溶解成2. 0 %的溶液,將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為40 %的溶液,然后將三者按3 1 2(體積比)混合,8°C條件下攪拌均勻后真空脫泡,無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中即為成品。
實施例6
將類人膠原蛋白用注射用水溶解成5. 0%的溶液,將分子量為100萬的透明質酸鈉用注射用水溶解成2. 0%的溶液,將β -甘油磷酸鈉用注射用水溶解為50%的溶液,然后將三者按1 4 1(體積比)混合,4°C條件下攪拌均勻后真空脫泡,無菌條件下灌裝在一次性玻璃注射器中即為成品。
實施例7
(1)力學性能測試
試驗方法采用美國英斯特朗公司3365型電子萬能材料試驗機來測量水凝膠的壓縮載荷和彈性模量。首先按照實施例1的方法制備類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠,制備完成后將溶膠放于IOmL的離心管中,在37°C條件下使其呈凝膠狀,直徑為10mm。 然后將制備好的水凝膠樣品用手術刀片切成長為IOmm的圓柱狀凝膠塊進行抗壓試驗。對照組為將實施例1中類人膠原蛋白替換為動物膠原蛋白的水凝膠。打開電子萬能材料試驗機,調節(jié)相關參數主要有初始抗壓盤高度為10mm,最終抗壓盤高度為4mm,抗壓盤形狀為圓形,直徑為10mm,壓縮速度為2mm/min,橫坐標設為壓縮位移,縱坐標設為壓縮應力。然后將切好的凝膠塊放于抗壓盤上,開始試驗,當抗壓盤高度為4mm時停止試驗。保存數據圖并自動給出該樣品的彈性模量數據。
試驗結果如圖1 3所示。
由圖1、2、3可以明顯看出類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠的機械強度優(yōu)于目前臨床使用的透明質酸鈉凝膠。
(2)皮下降解試驗
試驗方法按照實施例2制備類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠。將制備好的混合液移入ImL的注射器中,置于4°C環(huán)境下備用。選優(yōu)良的雄性昆明小鼠20只,體重在 25-30g之間,隨機均分為兩組,一組為類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠組,另一組為臺灣“雙美”膠原蛋白植入劑。所用小鼠在室溫環(huán)境下養(yǎng)一周時間,觀察小鼠的生長反應。待小鼠比較適應環(huán)境后,用脫毛劑將小鼠背部去毛,然后采用常規(guī)麻醉,將皮膚消毒后,用注射器注射于小鼠皮下組織。注射時,用左手拇指和食指輕輕提起小鼠皮膚,右手持注射器, 將注射針刺入皮下,若針頭可左右擺動則證明針頭已進入皮下,注射0. 2mL后緩慢拔出注射針,然后用無菌紗布輕壓針刺部位半分鐘,以防止凝膠膠外漏。于第2周和第4周,每次每組處死3只小鼠,將與材料注射的部位取下拍照,觀察凝膠在皮下的降解情況。
試驗結果如圖4 7所示。
由圖4 7可以可以看出。類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠注射小鼠皮下2周和4周后凝膠基本維持原來的注射后的形狀不變,無明顯的炎癥反應和降解。而臺灣“雙美”膠原蛋白植入劑透明質酸鈉凝膠注射小鼠皮下2周和4周后降解較為明顯,4周皮下凝膠的體積已降至原來的三分之一左右。表明類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠在皮下的降解速度更慢。
還需要說明的是,在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下,在本說明書中作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用于其它技術方案;并且,在可實施且不明顯違背本發(fā)明的主旨的前提下,作為不同技術方案的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合,來構成其它技術方案。本發(fā)明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案,并且這些技術方案相當于記載在本說明書中。
以上通過具體實施方式
和實施例對本發(fā)明進行了說明,但本領域技術人員應該理解的是,這些并非意圖對本發(fā)明的范圍進行限定,本發(fā)明的范圍應由權利要求書確定。
工業(yè)實用性
根據本發(fā)明,能夠提供一種類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠及其制備方法, 該方法工藝簡單,所制備的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠機械性能良好、生物相容性優(yōu)異,降解時間與目前市場上同類產品相比大大延長,徹底杜絕了動物膠源材料存在的病毒隱患,保證了材料的安全性。
權利要求
1.一種重組膠原蛋白,其由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列組成。
2.編碼權利要求1所述的重組膠原蛋白的核酸。
3.導入了權利要求2所述的核酸的載體。
4.用權利要求3的載體轉化宿主細胞而得到的轉化體。
全文摘要
本發(fā)明涉及類人膠原蛋白及類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠。與目前臨床廣泛應用的同類凝膠材料相比,所制備的類人膠原蛋白復合透明質酸鈉水凝膠成膠速度快、生物相容性優(yōu)異,徹底杜絕了動物源材料所不可避免的病毒隱患,保證了凝膠類填充材料在臨床使用中的安全性。
文檔編號C12N15/11GK102492033SQ20111036314
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權日2011年11月16日
發(fā)明者嚴建亞, 范代娣, 馬曉軒 申請人:陜西巨子生物技術有限公司