專利名稱：Na⁺/H⁺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種Na+AT逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由于全球氣候變暖，世界人口不斷增加，工業(yè)污染加劇，灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，化肥使用不當(dāng)?shù)纫蛩?，土壤鹽漬化日趨嚴(yán)重，這不僅使得土壤荒漠化、生態(tài)環(huán)境進(jìn)一步惡化，并且已經(jīng)成為阻礙作物生長發(fā)育及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要因素。目前，解決問題的主要途徑還是傳統(tǒng)改良鹽漬土的方法，如淡水洗滌、合理灌溉和使用(^0)3等。但是，傳統(tǒng)措施投資大、效益低， 并且隨著大量化學(xué)物質(zhì)的加入會加劇土壤的次生鹽漬化，這迫使人們考慮采用其它措施來改良利用鹽漬土壤。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，培育抗鹽漬、耐干旱的適宜在鹽漬土壤上生長并具有較高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價值的植物品系，是開發(fā)利用鹽漬土壤的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。所以對耐鹽基因的研究成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。在自然界中存在著大面積自然形成或者人工形成的各種各樣的鹽堿環(huán)境，如海洋、鹽(堿)湖、鹽場、鹽堿地以及腌制品等為一般生物生長和存活的極限，但卻生長著能適應(yīng)這種極端環(huán)境的微生物，我們把這類微生物稱為耐鹽微生物或嗜鹽微生物。根據(jù)細(xì)菌對 NaCl的需求和最適生長需要的NaCl濃度，可將細(xì)菌分為四類(1)非嗜鹽菌生長不需要 NaCl，低濃度的NaCl(< 1%)就會對它們的生長產(chǎn)生抑制作用；(2)輕度嗜鹽菌生長需要少量的NaCl，其最適生長的NaCl濃度為1 3% ； (3)中度嗜鹽菌生長離不開NaCl，它們可在0. 1 32. 5%的條件下生長，最適生長NaCl濃度為3 15% ； (4)極端嗜鹽菌一般在9% NaCl以上生長，可在9 35%濃度范圍內(nèi)生長，最適生長NaCl濃度為13 15%。 其中中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌屬于極端環(huán)境微生物。中度嗜鹽菌和極端嗜鹽菌大多存在于海洋、鹽(堿)湖、鹽場、沙漠植物、鹽堿地和鹽漬食物等高鹽環(huán)境中。嗜鹽或耐鹽微生物在鹽域環(huán)境中，一方面細(xì)胞通過積累親和性溶質(zhì)，例如糖、多元醇、氨基酸和氨基酸衍生物等，積累過程既可以通過自身合成也可以通過環(huán)境攝入；另一方面細(xì)胞將多余的Na+排除細(xì)胞外，以維持胞內(nèi)較低的鹽濃度，從而維持細(xì)胞正常的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能。Na+輸出系統(tǒng)又稱為鈉離子(或單價陽離子)/氫離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或簡稱為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na+Al+antiporter)，廣泛存在于微生物(包括細(xì)菌和真菌)、植物和動物細(xì)胞中。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于跨膜蛋白，催化單價陽離子(如Na+、K+、Li+)輸出，該過程與質(zhì)子(H+)的輸入相偶聯(lián)。嗜鹽或耐鹽微生物將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Na+再排到細(xì)胞外，主要就是通過次級Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實現(xiàn)的。目前研究的單亞基逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要有 NhaA、NhaB、NhaC、NhaD、NhaE、NhaG、NhaP、ChaA 和 MdfA 等。大腸桿菌有4個不同的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，分別是NhaA、NhaB, ChaA和MdfA。 ChaA除能輸出Na+交換H+外，還能輸出Ca+與H+交換，NhaA(簡稱Ec-NhaA)是大腸桿菌適應(yīng)在高濃度Na+、L+及堿性pH下生長所必需的主要逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。NhaB賦予大腸桿菌一定的耐鹽性，但在NhaA缺失條件下，NhaB在維持細(xì)菌生長方面起著重要作用。nhaA和nhaB雙缺失突變后，大腸桿菌變成鹽敏感突變株，在含0. 2M NaCl培養(yǎng)基上不能生長，該突變株 (nhaA_和nhaB_)被廣泛用于通過功能互補(bǔ)的基因克隆中。在嗜鹽微生物中，中度嗜鹽菌是一個對鹽濃度耐受范圍最廣的類群，在自然界分布廣泛，具有獨(dú)特的基因類型、特殊的生理機(jī)制、多樣化的代謝產(chǎn)物和潛在的應(yīng)用價值。因此大量獲取其基因資源，得到更好、更多的轉(zhuǎn)基因材料具有重要的研究意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2及其編碼基因。本發(fā)明的另一個目的在于提供Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2及其編碼基因在提高微生物或農(nóng)作物耐鹽環(huán)境中的應(yīng)用?？驴蔓}湖位于柴達(dá)木盆地東北部，青海省烏蘭縣境內(nèi)牦牛山下一小盆地內(nèi)。湖面海拔3010米，東西長約28公里，南北狹窄，面積119平方公里?？驴蔓}湖的湖水為鈉鹽型， 存在著大量的耐鹽或嗜鹽微生物基因資源。本發(fā)明從柯柯鹽湖資源中發(fā)現(xiàn)一種中度嗜鹽菌 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2。本發(fā)明提供的一種中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2，其氨基酸序列為a) SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；b)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的蛋白Nha_K2的氨基酸序列(SEQ ID No.幻，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。例如在非活性區(qū)段，將第495位的F替換為W，將第441位的S替換為Q，將第451位的(V)缺失，將第321位增加一個G或增加S和T，不影響其生物活性。因此，本發(fā)明的中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有與中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2同等活性的由Nha-K2衍生得到的蛋白質(zhì)。本發(fā)明基因包括編碼所述蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明提供了編碼上述Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，其核苷酸序列為(1)序列表SEQ ID NO. 1第571-2058位核苷酸序列，或(2) SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或(3)編碼序列表SEQ ID NO. 2所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸，或(4)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述嚴(yán)格條件為在0. 1XSSC(成分為NaCl 0. 015M，檸檬酸鈉0. 0015MpH7. 0)， 0. 1% SDS的溶液中，在65°C下雜交，并用該溶液洗膜。序列表中SEQ ID NO. 1是由2746個脫氧核苷酸組成；第571-573位核苷酸序列為nha-K2基因的起始密碼子，第2059-2061位核苷酸序列為nha-K2基因的終止密碼子；第 571-2058位核苷酸序列為nha-K2基因的編碼序列。SEQ ID NO. 1第1-570位核苷酸序列為nha-K2基因的上游序列；SEQ ID NO. 1第2062-2746位核苷酸序列為nha_K2基因的下游序列。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。因而，本發(fā)明中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因還包括由SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸，得到編碼Nha_K2的核苷酸序列。本發(fā)明提供一種含有上述任一種基因的重組質(zhì)粒?？蓪⒈景l(fā)明基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá)載體，進(jìn)一步將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，獲得表達(dá)本發(fā)明Nha_K2的基因工程菌。在本發(fā)明實例中，通過將nha_K2基因插入到表達(dá)載體pUC118上構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pUC Nha-K2，其質(zhì)粒圖譜如附圖1所示。進(jìn)一步，將該表達(dá)載體導(dǎo)入到E. coli KNabc 中獲得表達(dá)Nha-K2基因工程菌。上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還涉及中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因在提高細(xì)菌菌株耐鹽能力中的應(yīng)用。具體的應(yīng)用為將編碼中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2的基因轉(zhuǎn)入宿主菌，使宿主菌表達(dá)中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2，得到具有耐鹽能力的重組菌株。所述宿主菌為大腸桿菌KNabc。本發(fā)明還提供中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其編碼基因在提高農(nóng)作物耐鹽能力中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻的方法，將編碼中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因轉(zhuǎn)入水稻，使水稻表達(dá)中度嗜鹽菌Na7H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，得到具有耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因水稻，使其可以在鹽漬土壤上生長，這是開發(fā)利用鹽漬土壤的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2及其編碼基因，經(jīng)實驗驗證將該Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2在大腸桿菌中表達(dá)，可提高大腸桿菌耐鹽環(huán)境的能力，這對于農(nóng)作物育種具有重要的借鑒意義，可將其轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，獲得具有耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，以提高農(nóng)作物的適應(yīng)性，在農(nóng)作物育種中有重要的應(yīng)用前景。


圖1是重組質(zhì)粒pUC Nha-K2構(gòu)建示意圖；圖2是攜帶nha-K2基因的陽性克隆在不同Na+、Li+和K+濃度下的生長情況，其中圖加是Na+濃度下的生長情況，圖2b是Li+濃度下的生長情況，圖2c是K+濃度下的生長情況；圖3是Nha_K2的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性檢測結(jié)果，其中其中a圖為陽性檢測結(jié)果，b圖為陰性對照；圖4是Nha_K2的Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性檢測結(jié)果，其中其中a圖為陽性檢測結(jié)果，b圖為陰性對照；圖5是Nha_K2的K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性檢測結(jié)果，其中其中a圖為陽性檢測結(jié)果，b圖為陰性對照。
具體實施例方式以下實施例僅用于說明本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件進(jìn)行。實施例1柯柯鹽湖宏基因組文庫的構(gòu)建、nha-K2基因的克隆及序列分析(1)柯柯鹽湖宏基因組文庫的構(gòu)建柯柯鹽湖位于柴達(dá)木盆地東北部，青海省烏蘭縣境內(nèi)牦牛山下一小盆地內(nèi)。湖面海拔3010米，東西長約觀公里，南北狹窄，面積119平方公里。湖水為鈉鹽型，漸趨干涸， 現(xiàn)僅東西兩端有小面積水面。晶間鹵水來源為穿過山前傾斜平原砂礫層后在粘土層而逸出的泉水，泉眼665處以上。鹽礦蘊(yùn)藏量大，每平方公里達(dá)750萬噸左右，氯化鈉總儲藏量達(dá) 9億多噸，便于露天開采，再生能力強(qiáng)，建有柯柯鹽廠進(jìn)行開采。分別采集青海柯柯鹽湖的湖底淤泥、鹽土混合和全鹽三種樣品。為了針對性的獲得中度嗜鹽菌的耐鹽基因，首先利用8%的Gibbson培養(yǎng)基(每升含有酪蛋白5g，酵母粉 10g，蛋白胨 5g, KCl 2g，檸檬酸三鈉 3g，MgSO4 · 7H20 20g, NaCl 80g, pH 7. 5)對樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)。在8%的GitDbson培養(yǎng)基中生長良好的菌株，則是中度嗜鹽菌。具體實施方法如下從湖底淤泥、鹽土混合和全鹽三種樣品中各稱取2g 土壤溶于20mL 8%的GilAson 培養(yǎng)基中，于37°C、180rpm、培養(yǎng)36h。然后，將三種樣品按照1 %的接種量再轉(zhuǎn)接于20mL 8%的Gibbson培養(yǎng)基中，于37°C、180r/min、培養(yǎng)36h。再將它們按照的接種量接種于 200mL 8%的Gibbson培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)36h，然后收集菌體，提取DNA。DNA提取步驟如下a.取200mL新鮮菌液，以12，000r/min，在4°C離心5min，收獲菌體，用TE緩沖液以同樣條件離心洗滌1到2次；b.將菌體沉淀懸浮在TE緩沖液中，加入50mg/mL的溶菌酶至終濃度為^iig/mL， 37°C 反應(yīng) 4-24h ；c.加入20% SDS溶液至終濃度2%，20mg/mL蛋白酶K至終濃度0. lmg/mL,充分混合后，水浴55 °c反應(yīng)池；d.加入等體積的Tris飽和酚(pH 8. 0)，輕輕上下顛倒搖動5min，再加等體積 (IOmL)的氯仿/異戊醇混合液(24 1，V/V)，輕輕上下顛倒搖動5min, 12，000r/min離心 lOmin，吸取上清到干凈的離心管中。重復(fù)該步驟一次；e.加入等體積的氯仿/異戊醇混合液04 1，V/V)，輕輕上下顛倒搖動5min， 12，OOOr/min離心lOmin，用大口吸頭小心吸取上清到干凈的離心管中；f.上清液加入冷的2倍體積乙醇，用玻璃棒將DNA卷出；用冰預(yù)冷的70%的乙醇洗滌三次，風(fēng)干；g.在4°C下將風(fēng)干的DNA溶解在IOmL TE緩沖液中，加入lOmg/mLRNase至總濃度 50 μ g/mL, 37°C水浴2h ；再加入濃度為20mg/mL蛋白酶K至總濃度100 μ g/mL, 55°C水浴中 2h ；h.重復(fù)步驟e和f，將風(fēng)干的DNA溶于TE緩沖液中，4°C存放至DNA完全溶解。用Sau3A I對提取的柯柯鹽湖宏基因組DNA進(jìn)行部分酶切，具體方法如下
a.用酶儲藏液把原酶Sau3AI(3U/yL)稀釋100倍，然后設(shè)多個試切反應(yīng)，每個反應(yīng)中分別加入不同體積稀釋后的Sau3AI ；b.取6yL DNA、2yL的緩沖液(10X)、加無菌水至終體積20yL，先不加酶，于 37°C溫浴 30min ；c.在20uL的反應(yīng)體系中加入不同體積的酶液，37°C消化30min，然后立即加入 6μ L EDTA(0. 2Μ)終止反應(yīng)；d.調(diào)整酶和DNA濃度、不斷重復(fù)上述反應(yīng)，找出在30min左右2 51Λ范圍內(nèi)最強(qiáng)熒光為最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明，要獲2 51Λ大小的DNA片段，最適酶量為每20yL體系加0. 3yL 100 倍稀釋的Sau3AI。用最適酶量對柯柯鹽湖宏基因組DNA進(jìn)行多管大量酶切，將獲得2 51Λ 大小的DNA片段，用來自中科瑞泰的DNA回收純化試劑盒，按其中的標(biāo)準(zhǔn)操作方法回收純化酶切DNA片段。然后將純化回收的2 51Λ大小的柯柯鹽湖宏基因DNA片段與購買的BamH I酶切并去磷酸化的PUC118載體(Takara)按照5 1的比例進(jìn)行混合，再加入Buffer和連接酶，16°C連接12h。將連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變株Ε. coli Knabc (由美國紐約大學(xué)Mount Sinai醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系的Terry A. Krulwich教授惠贈)，在LBK (每升含有胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KCl 6.48g，自然pH)平板上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，白斑約占90%左右，挑取白斑，每一百個克隆為一個單位，擴(kuò)大培養(yǎng)，構(gòu)建柯柯鹽湖DNA文庫。(2) nha-K2基因的獲得及序列分析將步驟(1)構(gòu)建的柯柯鹽湖宏基因組文庫每個單位的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞接種于含氨芐青霉素和卡那霉素抗性的LBK+0. 2M NaCl液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12_1他，采用常規(guī)堿裂解法小量提取大腸桿菌中的重組質(zhì)粒。將提取的柯柯鹽湖宏基因組文庫重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到 E. coli KNabc中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)復(fù)壯后涂布在LBK+0. 2M NaCl的平板上，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12-24h。Ε. coli KNabc是一個Na+輸出相關(guān)基因缺失的菌株，它只能在無Na+的LBK培養(yǎng)基中生長，在LBK+0.2M NaCl的培養(yǎng)基中不能生長。如果文庫中的重組質(zhì)粒能夠功能互補(bǔ) E. coli KNabc,即在LBK+0. 2M NaCl的平板上能夠生長，說明該重組質(zhì)粒中含有Na+輸出相關(guān)基因。通過這種功能互補(bǔ)的方法，在柯柯鹽湖宏基因組文庫中篩選得到陽性克隆E. coli KNabc/pUCK3，提取質(zhì)粒pUCK3(此處質(zhì)粒為含有nha_K2基因及其上下游基因的質(zhì)粒，后續(xù)實驗中，通過亞克隆獲得只含有nha-K2編碼區(qū)的重組質(zhì)粒pUC Nha-K2質(zhì)粒)，送北京博邁德公司測序，測序引物為M13通用引物，序列如下Ml3 正向引物5 ‘ -GTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘Ml3 反向引物5 ‘ -CAGGAAACAGCTATGAC-3 ‘運(yùn)用Genebank中Blastx對質(zhì)粒上插入的外源DNA片段進(jìn)行分析，結(jié)果表明該外源片段中存在一個完整的開放讀碼框(ORF)，此ORF與Alkalimonas amylolytica的Na+/H+ 逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhaD同源性為73%;與Pseudoalteromonas haloplanktis的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhaD同源性為72% ；與Aeromonas salmonicida的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhaD的同源性為71%，說明質(zhì)粒pUC K3上的插入片段含有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NhaD基因，命名為 nha_K2(Na./H+antiporter of Keke S alt Lake)。DNAman分析表明，獲得的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因nha_K2大小1488bp (如序列表中的SEQ ID NO. 1第571-2058位核苷酸序列)，編碼一個由496個氨基酸組成的多肽Nha-K2(其氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0.2所示)，其分子量為55，034Da，等電點(diǎn)為9. 18。本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明公開的nha-Kl基因核苷酸序列，可以通過人工合成的方法獲得 nha-Kl 基因。禾Ij用 Internet 網(wǎng)站 http://www. sbc. su. se/ erikw/toppred2/ 進(jìn)行疏水性分析。在496個氨基酸殘基中，有287個氨基酸殘基位于疏水區(qū)，構(gòu)成12個跨膜區(qū)，是典型的整合膜蛋白。實施例2逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha_K2提高大腸桿菌耐鹽能力的作用通過實施例1中所列舉的采樣地點(diǎn)，采取土樣，在8% GitDbson培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)， 提取總DNA后，部分酶切，構(gòu)建宏基因組文庫，利用大腸桿菌鹽敏感突變株KNabc為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在含有0. 2M NaCl LBK培養(yǎng)基中篩選可獲得nha_K2基因。(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Ml I酶切質(zhì)粒PUC118，然后將其與用同樣酶切的含有nha-K2基因和其上下游序列的片段(大小約為2. 7kb)連接，得到重組質(zhì)粒pUCNha-K2(圖1)，經(jīng)鑒定，pUCNha-K2在Ml I位點(diǎn)插入了含有nha_K2基因的外源片段(如序列表中的SEQ ID NO. 1)。(2)重組質(zhì)粒pUCNha_K2轉(zhuǎn)化大腸桿菌本實施例優(yōu)選大腸桿菌KNabc為宿主，也可將nha-K2基因?qū)肫渌?xì)菌中表達(dá)。將步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒pUCNha_K2，采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Na+ 輸出基因缺失的菌株KNabc，篩選轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的陽性轉(zhuǎn)化子，命名為E. C01 i KNabc/ pUCNha_K2。具體步驟如下大腸桿菌電擊感受態(tài)細(xì)胞的制備E. coli KNabc菌種于37°C，200r/min培養(yǎng)過夜；次日晨以1%接種量轉(zhuǎn)接，于371、20017^11，搖3-5小時至OD600 = 0. 5-0. 7 ；將培養(yǎng)物冰浴15-30min后，4°C離心收集菌體；用冰預(yù)冷滅菌ddH20清洗菌體2_3次，10%甘油洗菌體1次；然后用10%甘油懸浮，細(xì)胞懸液按40 μ L小份分裝保存。電擊轉(zhuǎn)化將1 μ L質(zhì)粒DNA加到40 μ L感受態(tài)細(xì)胞中混勻，將混合物吸入預(yù)冷的電激杯內(nèi)，迅速將電激杯放入電極的滑塊內(nèi)，立即按下Pulse鍵，電擊條件為12. 5kV/cm, 25 μ F,4_5ms0(3)轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pUCNha_K2的大腸桿菌耐鹽能力檢測將陽性克隆E. coli KNabc/pUCNha-K2和轉(zhuǎn)入空載體pUC118的大腸桿菌E. coli KNabc/pUC118 (陰性對照)接種于含不同濃度Na+、Li+和K+的培養(yǎng)基中，當(dāng)?shù)竭_(dá)生長穩(wěn)定期后，測定它們的0D_，可反映出它們在不同Na+、Li+和K+濃度下的生長情況(圖2)。結(jié)果表明攜帶nha-K2基因的陽性克隆KNabc/pUCNha-K2可以耐受高達(dá)0. 6M Na+濃度，而陰性對照菌KNabc/pUC118在0. 2M Na+濃度下便不能生長；且陽性克隆可以耐受0. 4M高Li+濃度，而陰性對照在0. 05M Li+濃度下就不能生長；陽性克隆對K+的耐受能力不很明顯。上述實驗和結(jié)果表明，nha-K2基因的的表達(dá)可以賦予大腸桿菌缺失鈉離子輸出相關(guān)基因的突變株KNabc較強(qiáng)的耐鹽能力，尤其是對Na+和Li+，K+較不明顯。說明若將Nha_K2 蛋白轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，使農(nóng)作物表達(dá)該蛋白，也可提高農(nóng)作物耐鹽的能力，這對農(nóng)作物育種具有重要的借鑒意義。實施例3對Nha_K2蛋白的單價陽離子逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的檢測
(1)反轉(zhuǎn)膜的制備所謂反轉(zhuǎn)膜即為菌體粗蛋白的混合體，由于陽性克隆E. coli KNabc/pUC Nha~k2 的反轉(zhuǎn)膜中含有Nha-K2蛋白，而陰性對照菌E.coli KNabc/pUC118的反轉(zhuǎn)膜中則不含 Nha-K2蛋白，通過檢測這兩種菌反轉(zhuǎn)膜的單價陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性，可以確定Nha-K2蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)鹽離子的功能。將實施例2獲得的陽性克隆E. coli KNabc/pUC Nha_K2和轉(zhuǎn)入空載體pUC118的大腸桿菌E. coli KNabc/pUC118 (陰性對照)接種于盛有20ml LBK液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C、180r/min搖床中過夜培養(yǎng)。然后，轉(zhuǎn)接于200mL的LBK液體培養(yǎng)基中相同條件培養(yǎng)至對數(shù)末期。離心收集菌體，用緩沖液A[10mM Tris-HCl (pH7. 5)，140mM氯化膽堿，0. 5mM 二硫蘇糖醇(l，4-dith DTT)，250mM蔗糖(或10%甘油)，5mM MgCl2]洗2次，加入適量的緩沖液A懸浮菌體(另外需加入PMSF至終濃度ImM，少量蛋白酶抑制劑和DNase，緩沖液A 用量為20mL/g菌體)；然后通過Freeh Press破碎細(xì)胞，于4°C、8，000r/min、IOmin以去除未破碎細(xì)胞及雜質(zhì)等，再35，000r/min超速離心1小時，沉淀即為制備的反轉(zhuǎn)膜，用ImL緩沖液A懸浮。(2)采用熒光監(jiān)測法測定反轉(zhuǎn)膜中的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性利用考馬斯亮藍(lán)法測定步驟(1)制備的反轉(zhuǎn)膜樣品的蛋白含量，確定反應(yīng)的樣品加入量，具體步驟如下取反轉(zhuǎn)膜5-10 μ L，加蒸餾水至0. 2mL,加入2mL考馬斯亮藍(lán)G-250 (稱取IOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL90%乙醇(或甲醇)中，再加入100mL85% (ff/V)的磷酸，用蒸餾水定容至1L)，充分混勻。放置aiiin后，測定OD595值，計算反轉(zhuǎn)膜中蛋白質(zhì)的含量。然后利用熒光分光光度計監(jiān)測反轉(zhuǎn)膜的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。首先，向盛2mL緩沖液B (IOmM Tris-MES (pH6. 5-9. 5)，140mM氯化膽堿，5mMMgCl2)的石英杯中加入1 μ M吖啶橙 (acridine orange,A0)和40 μ g反轉(zhuǎn)膜，抽吸混勻，此時出現(xiàn)的是平穩(wěn)曲線；然后向反應(yīng)體系中添加Tris-L-乳酸鉀(測K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性時用Tris-L-乳酸替代Tris-L-乳酸鉀)至終濃度為5mM，此時熒光強(qiáng)度開始猝滅；利用AO作為熒光探針，通過熒光分光光度計監(jiān)控跨膜PH梯度的變化。熒光監(jiān)測參數(shù)為激發(fā)光(EX)波長495nm，發(fā)射光(EM)波長 530nm ；當(dāng)熒光強(qiáng)度下降至穩(wěn)態(tài)時，向反應(yīng)體系加入5 μ L濃度為2Μ的NaCl、LiCl或KCl，以破壞ΔρΗ，此時，熒光強(qiáng)度開始升高。熒光強(qiáng)度的恢復(fù)程度即為Na7H+(Li7H+或Κ+/Η+)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的大小。陽性克隆 E. coliKNabc/pUC Nha_K2 和陰性對照 E. coliKNabc/pUC118 的 Na+/H+、 Li+/H+和K+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性如圖3、4、5所示。結(jié)果表明，在pH9. 5的緩沖液B中Nha_K2 表現(xiàn)出較高的Na+/H+和Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，而陰性對照菌株E. coliKNabc/pUC118來源的反轉(zhuǎn)膜中未能檢測到任何逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。同時，僅檢測到非常微弱的Nha-K2的K+/ H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。該結(jié)果與實施例2中陽性克隆在不同Na+、Li+和K+濃度中的生長情況一致，因此證實，Nha-K2蛋白具有較強(qiáng)的Na+/H+和Li+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，而K+/H+逆向運(yùn)蛋白活性較不明顯。說明Nha-K2蛋白可以賦予大腸桿菌較強(qiáng)的耐鹽能力，若將Nha-K2 蛋白轉(zhuǎn)入農(nóng)作物，使農(nóng)作物表達(dá)該蛋白，也可提高農(nóng)作物耐鹽的能力，這對農(nóng)作物育種具有重要的借鑒意義。
權(quán)利要求
1.一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2，其特征在于，其氨基酸序列為a)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列；b)SEQID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列為1)序列表SEQID NO. 1第571-2058位核苷酸序列，或2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或幾個核苷酸；或3)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，是通過將權(quán)利要求2或3所述基因插入到表達(dá)載體PUC118上構(gòu)建得到重組表達(dá)載體pUC Nha-K2。
6.權(quán)利要求4或5所述的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
7.中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2或其編碼基因在提高細(xì)菌菌株耐鹽能力中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將權(quán)利要求4所述的重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌，使宿主菌表達(dá)權(quán)利要求1所述的Nha-K2蛋白，得到具有耐鹽能力的重組菌株。
9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述宿主菌為大腸桿菌KNabc。
10.中度嗜鹽菌Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2或編碼基因在提高農(nóng)作物耐鹽能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2及其編碼基因與應(yīng)用。該Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Nha-K2編碼基因具有序列表中SEQ ID NO.1第571-2058位核苷酸序列。本發(fā)明的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，將本發(fā)明的Nha-K2蛋白導(dǎo)入宿主菌中表達(dá)，可提高宿主菌耐鹽的能力，也可將其轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，獲得具有耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物以提高農(nóng)作物適應(yīng)性，在農(nóng)作物育種中有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK102492026SQ201110366059
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者王磊, 陳三鳳, 陶麗, 高淼 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)