專利名稱：一種適用于多糖多酚植物組織高質(zhì)量rna快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從植物組織中的快速提取高質(zhì)量的RNA，特別是從多糖多酚的植物組織包括植物的果實(shí)中提取高質(zhì)量RNA的試劑及方法。
背景技術(shù)：
富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織高質(zhì)量RNA的提取較為困難，目前一般采用冷酚法、熱酚法以及LiCl沉淀法。冷酚法步驟較多，整個(gè)過程需要保持低溫狀態(tài)；而LiCl沉淀法需沉淀過夜，耗時(shí)長、效率低。因此，找到一種適用于富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織高質(zhì)量RNA快速提取的方法可以為開展此類植物分子生物學(xué)的研究奠定良好的基礎(chǔ)。一些商品化的試劑盒大都是采用TRIZOL法，無法從富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織中獲得高質(zhì)量的RNA。有部分針對富含多糖、多酚植物組織RNA提取的專門試劑，但適用性不廣，提取的RNA有基因組DNA污染，效果不甚理想。本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有從富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織中提取RNA方法的不足，提供一種新的提取方法高效、快速地從富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織中分離高質(zhì)量RNA的方法。使用本發(fā)明提取的植物組織RNA質(zhì)量高，適用于下游與基因表達(dá)有關(guān)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，但在提取過程中，5S RNA丟失，所以本發(fā)明不適用于提取植物組織中的smallRNA (20 25nt)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供主要試劑及操作方法從富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織中快速提取高質(zhì)量RNA用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，提高實(shí)驗(yàn)成功率和實(shí)驗(yàn)效率。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為提供一種適用于多糖多酚植物組織高質(zhì)量RNA快速提取方法，其特征在于使用裂解液、沉淀液、重懸液按裂解-抽提-沉淀-重懸-抽提-沉淀流程提取RNA ；具體步驟如下(1)取多糖多酚植物組織于液氮中粉碎；(2)在2mL離心管加入1. 2mL 65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C以下，8000r/min，離心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，-20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4°C以下，12000r/min，離心 15min ；(5)棄上清，以500 μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下12000r/min，離心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNase free H2O溶解。較佳地，所述的裂解液由以下成分配制50mM Tris-HCl (PH 8. 0) (RNasefree H2O配制)；IOmM EDTA(PH 8.0) ；IM NaCl ；2% (ff/V)CTAB ；IOOmMLiCl ；2% PVP40(可以使用前加入)；2% β-巰基乙醇(使用前加入)。其中EDTA，NaCl，CTAB，LiCl均需用0. DEPC處理過夜。較佳地，所述的沉淀液由以下成分配制8M LiCl, 0. 1% DEPC處理過夜后滅菌。較佳地，所述的重懸液由以下成分配制0. 2M NaCl, 0. 1% DEPC處理過夜后滅菌。本發(fā)明的有益效果1、快速；2、高效；3、RNA質(zhì)量高；4、無DNA污染本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)可以從富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織中快速提取高質(zhì)量的RNA。


圖1 使用本發(fā)明試劑及方法從富含多糖、多酚植物組織中提取的RNA ；圖2 香蕉葉片及根的RNA ；其中1、2為香蕉葉片RNA圖；3、4為香蕉根RNA圖；圖3 香蕉、龍眼、番木瓜果肉RNA ；其中5、6為番木瓜果肉RNA圖，7、8為香蕉果肉RNA圖，9、10為龍眼果肉RNA具體實(shí)施例方式下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明決不限于下述實(shí)施例。實(shí)施例1應(yīng)用本發(fā)明試劑及方法提取香蕉葉片以及根部的RNA(1)從香蕉幼苗上取新鮮葉片及根各200mg于液氮中粉碎；(2)在2mL離心管加入1. 2mL 65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C下，8000r/min，離心 15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4 °C以下，12000r/min，離心 15min ；(5)棄上清，以500 μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；蕩混勻
4
⑶沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNasef ree H2O溶解。實(shí)施例二 應(yīng)用本發(fā)明試劑及方法提取香蕉果肉的RNA
(1)取新鮮香蕉幼果IOOmg于液氮中粉碎；
(2)在2mL離心管加入1.2mL65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振
C3)加入600 μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C以下，8000r/min，離心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4 °C以下，12000r/min，離心 15min ；(5)棄上清，以500 μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNasef ree H2O溶解。實(shí)施例三應(yīng)用本發(fā)明試劑及方法提取龍眼果肉RNA(1)取新鮮龍眼果肉IOOmg于液氮中粉碎；(2)在2mL離心管加入1. 2mL 65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C以下，8000r/min，離心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4 °C以下，12000r/min，離心 15min ；(5)棄上清，以500 μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNase free H2O溶解。實(shí)施例四應(yīng)用本發(fā)明試劑及方法提取番木瓜果肉的RNA(1)取新鮮番木瓜幼果各IOOmg于液氮中粉碎；(2)在2mL離心管加入1. 2mL 65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C以下，8000r/min，離心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4 °C以下，12000r/min，離心 15min ；(5)棄上清，以500 μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNase free H2O溶解。實(shí)施例五應(yīng)用本發(fā)明試劑及方法提取木薯葉片、葉柄、根的RNA(1)取_80°C凍存的木薯葉片、葉柄、根各200mg于液氮中粉碎；(2)在2mL離心管加入1. 2mL 65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻；C3)加入600 μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C以下，8000r/min，離心15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4 °C以下，12000r/min，離心 15min ；(5)棄上清，以500 μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500 μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴10min，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(8)沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNase free H20溶解。本發(fā)明方法提取的RNA質(zhì)量檢測及與Trizol法提取的RNA的對比1.方法1. 1采用NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)對實(shí)施例一、例二、例三、實(shí)施例四、實(shí)施例五中提取的RNA進(jìn)行定量檢測，各RNA樣品的檢測量都為IyL;1. 2以1Trizol提取_80°C凍存的木薯葉片、葉柄、根的RNA (操作方法見1Trizol試劑說明書)，取1 μ L RNA在NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行檢測。2.結(jié)果2. 1實(shí)施例一、例二、實(shí)施例三、實(shí)施例四中RNA定量檢測結(jié)果，見表1 表IRNA定量檢測結(jié)果(NanoDrop 2000紫外分光光度計(jì)，F(xiàn)actor = 40)
樣品編號(hào)樣品名禾爾濃度(ng/pL)OD 260/280OD 260/230Sample Type1ai-1.7-71236.72.082.38RNA2ai-3.7-714372.082.42RNA3br-1312.31.971.71RNA4br-21101.951.59RNA5papaya-1200.62.051.86RNA6papaya-2360.32.081.81RNA7bf-1161.82.022.29RNA8bf-2196.72.002.31RNA9longan-11172.012.31RNA10longan-2480.72.112.09RNA (ai-1. 7-7，ai_3. 7-7 為香蕉葉片 RNA ；br-1, br-2 為香蕉根 RNA ；papaya-1,papaya-2為番木瓜果肉RNA ；bf-1, bf-2為香蕉果肉RNA ；longan-Ι，longan-2為龍眼果肉RNA)從表1中可以看出，實(shí)施例一、例二、實(shí)施例三、實(shí)施例四提取到的RNA，其0擬60/280的比值處于1. 95 2. 11之間，0擬60/230的比值在1. 59 2. 42之間，RNA的質(zhì)量均較高，沒有明顯的降解和酚、多糖和鹽份的污染，適用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。2. 2實(shí)施例五提取的RNA與Trizol法提取的RNA比較，結(jié)果見表2從表2可以看出，實(shí)施例五中使用本發(fā)明方法提取的木薯葉片、葉柄、根的RNA其0D260/280的值在2. 04 2. 10之間，0D260/230的值在2. 29 2. 37之間，說明RNA的質(zhì)量很高；而使用iTrizol法提取的木薯葉片、葉柄、葉片的RNA其0擬60Λ80的值在1. 29 2. 08之間，0D260/230的值在0. 43 10. 27之間，說明RNA質(zhì)量不高，有部分降解或酚、多糖以及鹽份的污染，這樣的RNA難以應(yīng)用于下游分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。表2實(shí)施例五提取的RNA與Trizol法提取的RNA比較(NanoDrop 2000紫外分光光度(CL1，CL2, D5A03-L, D5A63-L 為葉片 RNA ；CSl, CS2, CD5-LS，D5A01-LS 為葉柄 RNA ；CRl，CR2, CR' 1, CR' 2 為根 RNA)
權(quán)利要求
1.一種適用于多糖多酚植物組織高質(zhì)量RNA快速提取方法，其特征在于使用裂解液、沉淀液、重懸液按裂解-抽提-沉淀-重懸-抽提-沉淀流程提取RNA ；具體步驟如下(1)取多糖多酚植物組織于液氮中粉碎；(2)在2mL離心管加入1.2mL65°C預(yù)熱的裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻；(3)加入600μ L的氯仿和異戊醇的混合液，氯仿和異戊醇的體積比為M 1，振蕩混勻，4°C下，8000r/min，離心 15min ；(4)取上清，加入400μ L沉淀液，混勻，_20°C沉淀0. 5 2小時(shí)后，4°C以下，12000r/min,離心 15min ；(5)棄上清，以500μ L重懸液沉淀，加入500 μ L冰冷的水飽和酚(PH < 5. 0)，振蕩混勻后冰上放置10min，4°C以下，12000r/min，離心15min ；(6)取上清，加入500μ L氯仿與異戊醇的混合液，振蕩混勻后冰浴lOmin，4°C以下，12000r/min，離心 15min ；(7)取上清，加入ImL無水乙醇，冰上沉淀30min，4°C以下，12000r/min，離心15min；(8)沉淀物以75%乙醇洗滌2次，風(fēng)干，RNasefree H2O溶解。
2.如權(quán)利要求1所述的適用于多糖多酚植物組織高質(zhì)量RNA快速提取方法，其特征在于所述的裂解液由以下成分配制50mM Tris-HCl (PH 8. 0) (RNasefree H2O配制)；10mMEDTA (PH 8.0) ； IM NaCl ；2% (ff/V) CTAB ； IOOmM LiCl ；2% PVP40 ；2% β-巰基乙醇。
3.如權(quán)利要求1所述的適用于多糖多酚植物組織高質(zhì)量RNA快速提取方法，其特征在于所述的沉淀液由以下成分配制8M LiCl, 0. 1% DEPC處理過夜后滅菌。
4.如權(quán)利要求1所述的適用于多糖多酚植物組織高質(zhì)量RNA快速提取方法，其特征在于所述的重懸液由以下成分配制0. 2M NaCl, 0. 1% DEPC處理過夜后滅菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于多糖多酚植物組織的高質(zhì)量RNA快速提取方法，具體步驟為65℃預(yù)熱裂解液，加入液氮粉碎后的植物組織，振蕩混勻后加入氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提；加入沉淀液到上清，離心棄上清；加重懸液重懸沉淀，分別以水飽和酚(pH＜5.0)和氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，離心取上清；加入無水乙醇沉淀，沉淀物以75％乙醇洗滌，風(fēng)干，RNase free H2O溶解。本發(fā)明的有益效果在于1、可從富含多糖、多酚及次生代謝物的植物組織中成功提取高質(zhì)量RNA；2、操作時(shí)間短；3、無DNA污染。本發(fā)明中采用的裂解液主要成分為CTAB、Tris-HCl、LiCl、EDTA、NaCl、PVP40；沉淀液的主要成分為LICl；重懸液的主要成分為NaCl。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102392017SQ201110370399
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者于曉玲, 彭明, 李文彬, 阮孟斌 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所