專利名稱：一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于雙歧桿菌制品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種提高凍干存活率的兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌(Bifidobacteria)最早于1899年由法國(guó)學(xué)者Tissier從母乳營(yíng)養(yǎng)嬰兒的糞便中分離出，該菌形態(tài)多變，常呈Y字形、V字形、彎曲、棍棒、鹿角狀或分叉，故稱雙歧桿菌。目前已發(fā)現(xiàn)的雙歧桿菌有36種，其中從人體分離的有12種，國(guó)家衛(wèi)生部規(guī)定可用于保健食品的有5種，分別為兩歧雙歧桿菌(B. bifidum)，短雙歧桿菌(B. breve)，長(zhǎng)雙歧桿菌(B. Iongum)，青春雙歧桿菌(B. adolescentis)，嬰兒雙歧桿菌(B. infantis)。雙歧桿菌伴隨人體的一生，只有在患病、衰老或其他不利條件下才減少，甚至消失。作為一種優(yōu)良的生態(tài)菌種，雙歧桿菌與機(jī)體的健康狀況密切相關(guān)，具有抑制腸道病原菌生長(zhǎng)、改善蛋白質(zhì)代謝、提供維生素、降低膽固醇、提高免疫機(jī)能等生理功能，因此已被開發(fā)成微生態(tài)制劑廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健和食品等領(lǐng)域，并已成為微生態(tài)制劑的核心。真空冷凍干燥是制備和保存雙歧桿菌最有效的方法之一，雙歧桿菌細(xì)胞在凍干過程中要經(jīng)受冷凍和干燥兩種激烈因素的作用，導(dǎo)致菌體死亡。影響兩歧雙歧桿菌凍干效果的因素有很多，主要有菌株自身特性、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、菌齡、預(yù)凍條件、菌懸液濃度、凍干保護(hù)劑、亞致死處理等，目前對(duì)兩歧雙歧桿菌凍干菌粉的研究主要集中在制備過程中凍干保護(hù)劑的篩選方面，并獲得了各種凍干保護(hù)劑配方，如ZL2006100U689. 5中公開了一種高活性雙歧桿菌干粉制劑的復(fù)合保護(hù)劑，其配方組成為β-環(huán)糊精10g、乳糖2-5g、海藻糖 0. 5-2. 0g、酵母膏 0. 5-2. Og,維生素 E0. 05-0. Ig 及蒸餾水 IOOml ；ZL200610012690. 8 中也公開了一種直投式雙歧桿菌純種凍干發(fā)酵劑的復(fù)合保護(hù)劑，其配方組成為脫脂乳粉10g、 乳糖3-6g、海藻糖1. 0-2. 0g、吐溫800. 05-1. 0g、酵母膏0. 5-1. Og,血清0. 5_lg、維生素 E0. 05-0. 2g及蒸餾水100ml ；ZL200710006529. 4中也公開了一種雙歧桿菌活菌制劑及其專用保護(hù)劑，其配方組成為甘油0. 01-5. 0份，聚乙烯吡咯烷酮0. 1-6. 0份、聚乙二醇0. 1-5. 0 份、脫脂奶粉1. 0-10. 0份、海藻糖0. 5-15. 0份、谷氨酸鈉0. 1-5. 0份、L-天冬氨酸0. 1-5. 0 份、維生素C鈉0. 1-5. 0份、鳥氨酸鹽酸鹽0. 1-5. 0份。目前，尚沒有研究培養(yǎng)基組成對(duì)兩歧雙歧桿菌凍干存活率的影響，更沒有篩選及優(yōu)化得到提高兩歧雙歧桿菌凍干存活率的抗凍培養(yǎng)基。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基及其應(yīng)用方法，該抗凍培養(yǎng)基解決了兩歧雙歧桿菌在凍干過程中存在的凍干存活率不高，活菌數(shù)低、凍干菌粉容易吸水潮濕以及不便在非乳制品如制劑、膠囊等中使用的問題。一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基，該抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分16_20g 乳糖、3_5g酵母提取物、6-9g氯化鈉、0. 6-1. Og山梨醇、0. 2-0. 5g谷氨酸，8_12g大豆蛋白胨、0. 5-2. Og檸檬酸氫二銨、0. 2-0. 5g甜菜堿、1. 0-2. 5g磷酸氫二鉀、0. 4-0. 8g抗壞血酸鈉、0. 1-0. 2g MgS04、0. 5-1. Oml吐溫80、3_5g半胱氨酸鹽酸鹽和IOOOml蒸餾水。所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分18g乳糖、4g酵母提取物、7g氯化鈉、 0. 6g山梨醇、0. 3g谷氨酸，IOg大豆蛋白胨、1. 5g檸檬酸氫二銨、0. 3g甜菜堿、2. Og磷酸氫二鉀、0. 5g抗壞血酸鈉、0. 15g MgSO4U. Oml吐溫80、4g半胱氨酸鹽酸鹽和IOOOml蒸餾水。所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分20g乳糖、5g酵母提取物、6g氯化鈉、 0. Sg山梨醇、0. 4g谷氨酸，Sg大豆蛋白胨、2. Og檸檬酸氫二銨、0. 5g甜菜堿、1. Og磷酸氫二鉀、0. 8g抗壞血酸鈉、0. 2g MgSO4U. Oml吐溫80,3. 5g半胱氨酸鹽酸鹽和IOOOml蒸餾水。所述抗凍培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟(1)將準(zhǔn)確稱取的乳糖、酵母提取物、氯化鈉、大豆蛋白胨、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、MgSO4和吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié) pH至6. 2-6. 8，裝于厭氧瓶中，裝量為90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，然后在118-121°C滅菌15-20min，滅菌后拔下注射器針頭，并冷卻至室溫得培養(yǎng)基A，備用；(2)將準(zhǔn)確稱取的抗壞血酸鈉、山梨醇、谷氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽及甜菜堿溶解于 50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液；(3)在超凈工作臺(tái)中按照無菌操作要求，將濾液用無菌注射器與培養(yǎng)基A混合均勻，即得兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基。上述兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，包括以下步驟將兩歧雙歧桿菌活化三次、檢查無雜菌，且形態(tài)無異常后，按4% (ν/ν)的接種量接入抗凍培養(yǎng)基中于37°C恒溫培養(yǎng)16-18h，然后7000r/min離心10-15min，棄去上清液， 得到兩歧雙歧桿菌菌泥，并稱量菌泥質(zhì)量，然后向菌泥中加入PH6. 8的磷酸緩沖液，磷酸緩沖液的加入有利于進(jìn)一步提高凍干存活率，每克菌泥中加入Iml磷酸緩沖液，混合均勻后于-40°C預(yù)凍3-12h，然后放入凍干機(jī)于-56°C、4-6I^下進(jìn)行冷凍干燥18_24h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉。本發(fā)明所述兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基在現(xiàn)有培養(yǎng)基組分的基礎(chǔ)上添加了甜菜堿，氯化鈉，山梨醇等組分，各組分按照比例混合后形成抗凍培養(yǎng)基，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)采用該抗凍培養(yǎng)基制備的兩歧雙歧桿菌凍干菌粉，凍干存活率> 58%，菌粉活菌數(shù)> 2. OXlO^cfu/g，而以兩歧雙歧桿菌培養(yǎng)常用的商業(yè)培養(yǎng)基——MRS肉湯制備的菌粉凍干存活率最高僅為8. 74%，活菌數(shù)最高為0. 74X10ncfu/g ；本發(fā)明所述兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基通過添加磷酸緩沖液作為保護(hù)劑制備的兩歧雙歧桿菌菌粉不含脫脂乳粉和海藻糖，解決了兩歧雙歧桿菌菌粉在貯存過程中存在的易吸水變潮等問題，方便了凍干菌粉在非乳制品如制劑及膠囊等中的使用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1(1)將準(zhǔn)確稱取的18g乳糖、4g酵母提取物、7g氯化鈉、IOg大豆蛋白胨、1. 5g檸檬酸氫二銨、2. Og磷酸氫二鉀、0. 15g MgSO4和1. Oml吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 2后裝于厭氧瓶中，裝量為90%，并在厭氧瓶CN 102408993 A
說明書
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蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，然后在121°C滅菌15min，滅菌后拔下注射器針頭，并冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ； (2)將準(zhǔn)確稱取的0. 5g抗壞血酸鈉、0. 6g山梨醇、0. 3g谷氨酸、4. Og半胱氨酸鹽酸鹽及0. 3g甜菜堿溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液； (3)在超凈工作臺(tái)中按照無菌操作要求，將濾液用無菌注射器與培養(yǎng)基A混合均勻，即得兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基。將兩歧雙歧桿菌活化三次、檢查無雜菌，且形態(tài)無異常后，按4% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè)MRS肉湯培養(yǎng)基(對(duì)照)中于37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后 7000r/min離心lOmin，棄去上清液，得兩歧雙歧桿菌菌泥，并稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入pH6. 8的磷酸緩沖液，每克菌泥中加入Iml磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍4h，然后放入凍干機(jī)于-56°C、4I^下進(jìn)行冷凍干燥20h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，凍干存活率為
58.86% (對(duì)照為 8. 38% )，菌粉活菌數(shù)為 2. 79 X lO^cfu/g (對(duì)照為 0. 62 X 10ncfu/g)。實(shí)施例2(1)將準(zhǔn)確稱取的20g乳糖、5g酵母提取物、6g氯化鈉、8g大豆蛋白胨、2. Og檸檬酸氫二銨、1. Og磷酸氫二鉀、0. 2g MgSO4和1. Oml吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 8后裝于厭氧瓶中，裝量為90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，然后在118°C滅菌20min，滅菌后拔下注射器針頭，并冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ； (2)將準(zhǔn)確稱取的0. Sg抗壞血酸鈉、0. Sg山梨醇、0. 4g谷氨酸、3. 5g半胱氨酸鹽酸鹽及0. 5g甜菜堿溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液； (3)在超凈工作臺(tái)中按照無菌操作要求，將濾液用無菌注射器與培養(yǎng)基A混合均勻，即得兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基。將兩歧雙歧桿菌活化三次、檢查無雜菌，且形態(tài)無異常后，按4% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè)MRS肉湯培養(yǎng)基(對(duì)照)中于37°C恒溫培養(yǎng)18h，然后 7000r/min離心lOmin，棄去上清液，得兩歧雙歧桿菌菌泥，并稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入pH6. 8的磷酸緩沖液，每克菌泥中加入Iml磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍4h，然后放入凍干機(jī)于-56°C、6I^下進(jìn)行冷凍干燥Mh，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，凍干存活率為
59.54% (對(duì)照為 8. 74% )，菌粉活菌數(shù)為 2. 83 X lO^cfu/g (對(duì)照為 0. 74X 10ncfu/g)。實(shí)施例3(1)將準(zhǔn)確稱取的17g乳糖、3g酵母提取物、9g氯化鈉、8g大豆蛋白胨、l.Og檸檬酸氫二銨、2. Og磷酸氫二鉀、0. 2g MgSO4和0. 5ml吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 5后裝于厭氧瓶中，裝量為90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，然后在119°C滅菌18min，滅菌后拔下注射器針頭，并冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；⑵將準(zhǔn)確稱取的0. 4g抗壞血酸鈉、1. Og山梨醇、0. 2g谷氨酸、5. Og半胱氨酸鹽酸鹽及0. 4g甜菜堿溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液； (3)在超凈工作臺(tái)中按照無菌操作要求，將濾液用無菌注射器與培養(yǎng)基A混合均勻，即得兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基。將兩歧雙歧桿菌活化三次、檢查無雜菌，且形態(tài)無異常后，按4% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè)MRS肉湯培養(yǎng)基(對(duì)照)中于37°C恒溫培養(yǎng)16h，然后 7000r/min離心15min，棄去上清液，得兩歧雙歧桿菌菌泥，并稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入 PH6. 8的磷酸緩沖液，每克菌泥中加入Iml磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍12h，然后放入凍干機(jī)于-56°C、5I^下進(jìn)行冷凍干燥18h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，凍干存活率為
58.54% (對(duì)照為 8. 32% )，菌粉活菌數(shù)為 2. 75X lO^cfu/g(對(duì)照為 0. 71 X 10ncfu/g)。實(shí)施例4(1)將準(zhǔn)確稱取的16g乳糖、5g酵母提取物、8g氯化鈉、12g大豆蛋白胨、0. 5g檸檬酸氫二銨、2. 5g磷酸氫二鉀、0. Ig MgSO4和0. 5ml吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解并混合均勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 4后裝于厭氧瓶中，裝量為90%，并在厭氧瓶蓋的橡膠塞上插Iml注射器針頭，然后在120°C滅菌20min，滅菌后拔下注射器針頭，并冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ； (2)將準(zhǔn)確稱取的0. 6g抗壞血酸鈉、0. 7g山梨醇、0. 5g谷氨酸、3. Og半胱氨酸鹽酸鹽及0. 2g甜菜堿溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液； (3)在超凈工作臺(tái)中按照無菌操作要求，將濾液用無菌注射器與培養(yǎng)基A混合均勻，即得兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基。將兩歧雙歧桿菌活化三次、檢查無雜菌，且形態(tài)無異常后，按4% (ν/ν)的接種量分別接入上述抗凍培養(yǎng)基和商業(yè)MRS肉湯培養(yǎng)基(對(duì)照)中于37°C恒溫培養(yǎng)17h，然后 7000r/min離心12min，棄去上清液，得兩歧雙歧桿菌菌泥，并稱量菌泥質(zhì)量，向菌泥中加入pH6. 8的磷酸緩沖液，每克菌泥中加入Iml磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍池，然后放入凍干機(jī)于-56°C、4I^下進(jìn)行冷凍干燥22h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉，凍干存活率為
59.11% (對(duì)照為 8. 78% )，菌粉活菌數(shù)為 2. 81 X IO11CfVg (對(duì)照為 0. 75 X 10ncfu/g)。
權(quán)利要求
1.一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于該抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分:16-20g乳糖、3-5g酵母提取物、6-9g氯化鈉、0. 6-1. Og山梨醇、0. 2-0. 5g谷氨酸，8_12g 大豆蛋白胨、0. 5-2. Og檸檬酸氫二銨、0. 2-0. 5g甜菜堿、1. 0-2. 5g磷酸氫二鉀、0. 4-0. 8g抗壞血酸鈉、0. 1-0. 2g MgS04、0. 5-1. Oml吐溫80、3_5g半胱氨酸鹽酸鹽和IOOOml蒸餾水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分18g乳糖、4g酵母提取物、7g氯化鈉、0. 6g山梨醇、0. 3g谷氨酸，IOg大豆蛋白胨、1. 5g檸檬酸氫二銨、0. 3g甜菜堿、2. Og磷酸氫二鉀、0. 5g抗壞血酸鈉、 0. 15g MgSO4U. Oml吐溫80、4g半胱氨酸鹽酸鹽和IOOOml蒸餾水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于所述抗凍培養(yǎng)基的配方組成包括以下組分20g乳糖、5g酵母提取物、6g氯化鈉、0. Sg山梨醇、0. 4g谷氨酸， Sg大豆蛋白胨、2. Og檸檬酸氫二銨、0. 5g甜菜堿、1. Og磷酸氫二鉀、0. Sg抗壞血酸鈉、0. 2g MgSO4U. Oml吐溫80、3. 5g半胱氨酸鹽酸鹽和IOOOml蒸餾水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基，其特征在于所述抗凍培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟(1)將稱取的乳糖、酵母提取物、氯化鈉、大豆蛋白胨、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、 MgSO4和吐溫80溶解于950mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至6. 2-6. 8，然后在118-121 °C 滅菌15-20min，滅菌后冷卻至室溫得培養(yǎng)基A ；(2)將稱取的抗壞血酸鈉、山梨醇、谷氨酸、半胱氨酸鹽酸鹽及甜菜堿溶解于50ml蒸餾水中，然后用0. 22 μ m濾膜過濾除菌得濾液；(3)將濾液與培養(yǎng)基A混合均勻，即得兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基。
5.一種如權(quán)利要求1所述兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，包括以下步驟將兩歧雙歧桿菌活化后按4%的接種量接入抗凍培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)16-18h，然后7000r/min離心10-15min，得兩歧雙歧桿菌菌泥，向菌泥中加入pH6. 8的磷酸緩沖液，每克菌泥中加入Iml磷酸緩沖液，混合均勻后于_40°C預(yù)凍3-12h，然后放入凍干機(jī)于_56°C、 4-6Pa下進(jìn)行冷凍干燥1814h，即得兩歧雙歧桿菌菌粉。
全文摘要
本發(fā)明提供一種兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基，包括以下組分16-20g乳糖、3-5g酵母提取物、6-9g氯化鈉、0.6-1.0g山梨醇、0.2-0.5g谷氨酸，8-12g大豆蛋白胨、0.5-2.0g檸檬酸氫二銨、0.2-0.5g甜菜堿、1.0-2.5g磷酸氫二鉀、0.4-0.8g抗壞血酸鈉、0.1-0.2gMgSO4、0.5-1.0ml吐溫80、3-5g半胱氨酸鹽酸鹽和1000ml蒸餾水。采用該抗凍培養(yǎng)基制備的兩歧雙歧桿菌凍干菌粉，凍干存活率在58％以上，活菌數(shù)在2.0×1011cfu/g以上，而以MRS肉湯制備的菌粉凍干存活率最高為8.74％；本發(fā)明所述兩歧雙歧桿菌抗凍培養(yǎng)基不含脫脂乳粉和海藻糖，解決了菌粉在貯存中易吸水變潮的問題。
文檔編號(hào)C12N1/04GK102408993SQ20111037684
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者張華 , 秦濤, 舒國(guó)偉, 陳合, 雷小蘭, 馬振興, 馬齊 申請(qǐng)人:陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院